Name: Nanosensoren Protease-Aktivität In Vivo für die nicht-invasive Diagnostik zu erkennen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Erfahren Sie, wie Nanosensoren die Protease-Aktivität in vivo erfassen und nicht-invasive Diagnostik ermöglichen. Diese Methode nutzt Urinproben zur Früherkennung von Krankheiten wie Krebs.

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Diese Arbeit wurde durch eine NIH Direktor neue Innovator Award (Auszeichnung Nr. finanziert. DP2HD091793). Q.D.M. wird unterstützt durch die NSF Graduate Research Fellowships Program (Grant Nr. DGE-1650044). B.A.H wird von den nationalen Instituten der Gesundheit GT BioMAT Training Zuschuss im Rahmen Prämiennummer 5T32EB006343 sowie der Georgia Tech President Fellowship unterstützt. G.A.K. hält den Career Award an der wissenschaftlichen Schnittstelle aus dem Burroughs-Willkommen-Fonds. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

Institutionelle Genehmigung institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) des Forschers Institution ist notwendig, die folgenden Tierversuche durchzuführen. Darüber hinaus sind standard Tierbetreuung Einrichtungen (z. B. Gehäuse, Kammern, sterile Tier Hauben und Isofluorane Kammern für Anesthetization CO2 Kammern für ethische Endpunkt Euthanization) notwendig, um diese ordnungsgemäß durchführt Experimente. Spezielle Schulungen und Unterstützung bei diesen Einrichtungen können durch physiologische Forschung Labor (PRL) an der Hochschule bereitgestellt werden. Alle tierische Arbeit von IACUC an der Georgia Tech genehmigt wurde (Protokoll: A14100).
(1) Eisenoxid-Nanopartikel (IONP)-Synthese
Hinweis: Sicherheit: die gesamte Eisenoxid-Nanopartikel-Synthese Verwendung persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt werden sollte und unter einer chemischen Rauch Haube.
<ol><li>Entspannen Sie in einem 15 mL konische Rohr 1 mL 30 % Ammonium Hydroxid in einem Eiskübel für 30 min.</li>
	<li>Waschen Sie eine 250-mL-Erlenmeyerkolben mit entionisiertem Wasser zu, und fügen Sie 10 mL doppelt destilliertes Wasser (DdH2O). Tauchen Sie die Außenseite des Kolbens im Eisbad ruht auf einem rühren/Heizplatte. Verwenden Sie eine Kunststoff Pipette zum Fluss N2 Gas in der DdH2O in den Kolben. Blase für 15 Minuten mit N2 , ebenso.</li>
	<li>224 µmol (4,5 Gramm) von Dextran wiegen (Molekulargewicht (MW) = 20 kDa) in ein 50 mL konische Röhrchen. Fügen Sie H2O hinzu, so dass der letzte Band der Mischung, einschließlich der Dextran 20 mL. Wirbel der Dextran kräftig aufzulösen.</li>
	<li>Wiegen Sie 290 µmol (78,5 Gramm) von Eisen(III)-Chlorid Hexahydrat, hinzu kommen Dextran-Lösung und Strudel auf auflösen.</li>
	<li>Filtern Sie die resultierende Lösung durch einen 0,2 µm-Filter.</li>
	<li>Übertragen Sie 1 mL gekühlten Ammonium Hydroxid in 9 mL sauerstoffarmes Wasser. Zurück zu 4 ° C.</li>
	<li>367 µmol (73,0 Gramm) von Eisen(II) chlorid Tetrahydrat wiegen, lösen sich in 1 mL der sauerstofffreien DdH2O und durch einen 0,2 µm-Filter filtern.</li>
	<li>Die dextran-iron(III)-Lösung in der 250-mL-Erlenmeyerkolben übertragen und ebenso mit N2 für 15 Minuten auf dem Eis. Mit einen magnetischen Stir bar dreht bei 1600 u/min mischen.</li>
	<li>Um eine homogene Stickstoffatmosphäre zu schaffen, Kappe der Flasche mit einem gummiseptum. Punktion das Septum mit einer 18 gauge Nadel Fluss N2 in den Kolben. Separate 18-Gauge Nadel als Flow Ventil.</li>
	<li>Die dextran-iron(III) Lösung fügen Sie 467 µL der Lösung Eisen(II) mit eine 1 mL Spritze, die mit einer magnetischen Stir Bar bei 1600 u/min unter ständigem Rühren hinzu. Dieses Verhältnis von Eisen(II) zu Eisen führt zu einer ausgewogenen Reaktion, die Magnetit oder Fe3O4produzieren wird.</li>
	<li>Fügen Sie die gekühlte verwässern Ammonium Hydroxid tropfenweise in die Eisen (II) - Eisen (III) - Dextran-Lösung, die Keimbildung Prozess21zu initiieren. Stellen Sie sicher, dass mischt jeden Tropfen auch vor dem Ablegen in einem anderen. Die Reaktion nach der Zugabe von 1-2 mL von Ammonium Hydroxid zu beenden.</li>
	<li>Stoppen Sie die Strömung von N2 und entfernen Sie der gummiseptum zu. Entfernen Sie das Eisbad zu und ersetzen Sie durch eine Badewanne mit warmem Wasser, während Sie weiterhin rühren Sie die Lösung. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur der Lösung 75 ° C erreicht und 75 Minuten inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie den Kolben aus der rühren/heiße Platte und Filtern Sie doppelt die Lösung durch 0,2 µm dann 0,1 µm Filter, grobe Partikel zu entfernen.</li>
	<li>Puffer wechseln die Partikel in DdH2O, mit 100 kDa Molekulargewicht abgeschnitten (m.w.c.o.)-Konzentratoren um überschüssige Dextran aus der Lösung zu entfernen, die sehr dickflüssig sein sollte. Filter zu ersetzen, wenn der Durchfluss durch dunkel bleibt auch nach 2-3 Drehungen, die angibt, dass der Filter gebrochen haben kann.<ol>
<li>Puffer-Austausch mit Spin Filter, für 15 Minuten bei 4 ° C bei 4800 X g zentrifugieren, verwerfen die Durchströmung und neuen Puffer der IONP Projektmappe hinzufügen. Wiederholen Sie 3 - 5 Mal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bestimmen Sie die Konzentration der Nanopartikel mit einem Spektrophotometer/Platte-Reader. Nehmen Sie Absorption Messungen bei 400 nm und Verwendung der molaren Absorptionsvermögen von IONP bei dieser Wellenlänge (ε = 2,07 x 106 cm-1 M-1) zur Bestimmung der Konzentration von e/a-Teilchen.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie der IONPs auf 10 mg/mL in DdH2O (Gesamtvolumen ist in der Regel ca. 3 mL) und achten Sie darauf, für diesen Schritt für die chemische Verträglichkeit Polypropylenröhrchen verwenden. Fügen Sie 1,6 Mengen von 5 M NaOH, dann fügen Sie 0,65 Bände von Epichlorhydrin. Konsequent auf eine Platte Schüttler bei Raumtemperatur für 12 Stunden Crosslink Dextran mischen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine 20 mL Spritze mit einer 18-Gauge-Nadel IONP Lösung in die 50 kDa m.w.c.o. Dialysemembran zu übertragen. Legen Sie die Dialysemembran in 4 L DdH2O und ersetzen Sie H2O ein paar Mal (alle 2-3 Stunden) zu. Über Nacht inkubieren.</li>
	<li>Messen der Konzentration und IONPs bis 5 mg/mL (siehe Schritt 1.15) zu bringen. Fügen Sie Ammonium Hydroxid um bis zu 20 % (V/V) und schütteln bei Raumtemperatur für &gt; 12 Stunden aminate der Oberfläche des IONPs hinzu. Buffer Tausch mit 30 kDa m.w.c.o. Filtern (siehe 1.14).</li>
	<li>Stellen Sie die Lautstärke bis auf 2,5-3,5 mL vor der Endreinigung durch schnell Protein Liquid Chromatography (FPLC; siehe Tabelle der Materialien für Gel-Filtration-Spalte).</li>
	<li>Verwenden Sie dynamische Lichtstreuung (DLS), um den hydrodynamischen Radius des IONPs (erwarteten Bereich 10-100 nm, durchschnittliche Größe 40-50 nm) zu bestimmen. Zu diesem Zweck Aliquotierung 1 mL 100 X verdünnten IONP Probe in eine Küvette, legen in die Maschine und die Software des Herstellers zu verwenden, um die Messung vorzunehmen. Hinweis: Die Gesamtbevölkerung von IONPs werden zwischen 10 und 100 nm von DLS-Messungen, aber die Mehrheit der Bevölkerung ist rund um den durchschnittlichen Durchmesser, die von 40-50 nm reicht. Will man den Größenbereich zu begrenzen, können eine weitere Größe Ausgrenzung Chromatographie Brüche mit verschiedenen Durchmessern zu isolieren. IONPs sollte bei 4 ° c gelagert werden</li>
</ol>(2) Peptid Design, Konjugation, IONP und In-vitro- Validierung
<ol><li>Ein Peptid-Substrat (z. B. durch eine zentrale Einrichtung oder kommerziell) für ein Ziel-Protease mit einer N-terminalen fluoreszierende Reporter wie Fluorescein erfolgt (FITC) und ein C-terminal Cystein-Rückstand Thiol-vermittelten Kupplung ermöglichen zu synthetisieren. Hinweis: Bei dieser Studie für MMP9, war das Peptid verwendet FITC-PLGVRGK-C, mit kKatze/km ~ 2.0 x 105 M-1s-1.</li>
	<li>Aliquoten 0,5 mg IONP (bei 1 mg/mL) und Buffer Tausch in Kupplung Puffer (50 mM Natrium Borat mit 1 mM EDTA, pH = 8,5) mit einem 10 kDa m.w.c.o. Spin Filtern (siehe Schritt 1,14).</li>
	<li>Succinimidyl Jodazetat (SIA) in Dimethylformamid (DMF), eine Konzentration von ~ 30 mg/mL erreichen auflösen, und IONP bei einem mol-Verhältnis von 500 SIA:IONP SIA hinzufügen. Hinweis: SIA ist ein Heterobifunctional cross-Linker, der Kopplung von Aminen auf IONPs den Sulfhydryl Gruppen auf das Substrat Peptid vermittelt.</li>
	<li>1-2 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Wenn Sie über Nacht verlassen, bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Puffer-Austausch mit einem 10 kDa m.w.c.o. Spin Filter in Kupplung Puffer nicht umgesetztes SIA zu entfernen (siehe Punkt 1.14).</li>
	<li>Bringen Sie die Endprodukt-Lösung 1 mg/ml (0,5 mL Lösung). Mischen Sie das Peptid von Interesse in einem molaren Verhältnis von 90:1 (Peptid: IONP) mit 20 kDa Thiol-terminierte Polyethylenglykol (PEG) in einem molaren Verhältnis von 20:1 (PEG: IONP). Mischen Sie dieses Peptid-PEG-Lösung mit IONP.</li>
	<li>Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Teller Shaker auf höchste Geschwindigkeit, für Rohre in Folie, Immunofluoreszenz fluoreszierende Moleküle zu verhindern.</li>
	<li>Fügen Sie L-Cystein in einem molaren Verhältnis von 500: 1 (C:IONP), nicht umgesetztes SIA-Moleküle zu neutralisieren. 1 Stunde bei 25 ° C auf einem Boston-Shaker mit höchster Geschwindigkeit bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Über FPLC reinigen (siehe 1.1.19). Verwenden Sie ein Spektralphotometer zur Messung der Extinktion der Probenlösung und das Peptid: IONP Verhältnis wie folgt zu berechnen. Nach der Reinigung Lagern Sie Produkt bei 1 mg/mL bei 4 ° C mit PBS-Puffer.<ol>
<li>Verwenden Sie ein Spektralphotometer zur Messung der Extinktion der Probenlösung bei 400 nm (eineProbe, 400) und die Wellenlänge der maximalen Absorption für die Fluorophor verwendet, das 488 nm für FITC (eineProbe, 488). Die Extinktion einer Aktie Amin IONP Lösung bei den gleichen zwei Wellenlängen zu messen (400 nm und 488 nm), die jeweils als einNP, 400 und einNP, 488vertreten sind.</li>
		<li>Verwenden Sie Gleichungen 1 und 2 der normalisierten berechnen A400 und eine488 -Werte. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq1.jpg">Gleichung 1 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq2.jpg">Gleichung 2</li>
		<li>Eine400 und eine488 repräsentieren die normalisierte Werte der Probe. Verwenden Sie diese Werte, um das Verhältnis von Peptid: IONP mit Gleichung 3 zu berechnen. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq3.jpg">Gleichung 3</li>
		<li>Wo <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq4.jpg"> und <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq5.jpg"> sind die molaren Absorptivities der IONP und der Fluorophor, beziehungsweise. Für diese Teilchen <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq4.jpg"> = 2,06 x 106 M-1cm-1 und für FITC <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq5.jpg"> = 72.000 M-1cm-1, also der Wert der <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq6.jpg"> 28,75 werden sollte. Typische Peptid: IONP Verhältnisse sollte im Bereich von 20:1 bis 50: 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Funktionalität der Sonden durch durchführen eines in-vitro- Spaltung Assays zu validieren.<ol>
<li>Mit PBS (1 % BSA), eine 18 µL-Nanopartikel-Lösung mit einer 200 nM-Konzentration von Peptid zu machen. Mischen Sie mit 2 µL Protease von Interesse (MMP9; 0,1 - 1 mg/mL).</li>
		<li>1 Stunde, die Fluoreszenz-Messungen in einem Teller-Reader bei 37 ° C inkubieren (mit den entsprechenden Anregung und Emission Wellenlängen, die sind 485 nm und 528 nm für FITC, beziehungsweise) alle 1-2 Minuten, Spaltung zu überwachen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Verwaltung der Nanosensoren und Urin Erkennung von Krebs
Hinweis: Für mehr Details über das Beispielmodell, siehe unsere vorherigen Bericht13.
<ol><li>Erstellen Sie einen metabolische Käfig für die urinsammlung durch eine Zylindrische Hülse an die Spitze einer 96-well-Platte zu sichern. Während Urin sammeln legen Sie eine Maus im Inneren der Hülse und Deckel mit einer Petrischale Abdeckung zur Flucht des Tieres zu verhindern.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Injektionslösung (200 µL maximale Lautstärke) mit Nanosensoren in einer Konzentration von 3000 mg/kg (~ 50 µmol) durch Peptid in sterile Kochsalzlösung.</li>
	<li>Weiblich, 8 - Wochen alten, nackten Mäusen mit Xenograft LS174T kolorektalen Tumoren bei einer Belastung von ca. 100-300 mm3, die auf etwa auftreten sollten Tag 10, Nanosensor Lösung mittels Rute Vene Injektion verabreichen. Sofort nach der Injektion Mäuse in metabolische Käfige und notieren Sie die Zeit der Injektion für jede Maus.</li>
	<li>Entfernen Sie bei 60-90 Minuten nach der Injektion Zylindrische Hülse aus 96-Well-Platte. Zurückhalten von Maus und leichten Druck auf die Blase, Mäuse, alle restlichen Urin auf den Teller nichtig zu induzieren. Sammeln Sie alle Urin (200-500 µL).</li>
	<li>Analysieren Sie Urinproben durch Immunopräzipitation FITC aus dem Urin zu reinigen und Empfindlichkeit zu erhöhen. Verwenden Sie magnetische Beads mit Anti-FITC Antikörper gekoppelt.<ol>
<li>Zuerst waschen Sie 25 mg von den magnetischen Beads 3 Mal mit Beschichtung Puffer, und 225 µL bringen Sie Endvolumen. Hinweis: Es ist wichtig, die Beschichtung Puffer (0,1 M Natrium Borat, pH 9,5), blockierende Puffer (PBS, 0,5 % BSA, 0,05 % Tween-20, pH 7,4), und waschen Puffer (PBS, 0,1 % BSA, 0,05 % Tween-20, pH 7,4) frisch jedes Mal und etwa 20 mL der jeweils erforderlich ist.</li>
		<li>Fügen Sie 200 µL Anti-FITC (5 mg/mL) und 200 µL Ammoniumsulfat (3 M). 16-24 Stunden bei 37 C auf ein Rotator inkubieren.</li>
		<li>Die Lösung zu einem Magnetabscheider hinzufügen, entfernen den überstand, ersetzen mit 625 <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57937/57937eq7.jpg"> Puffer Λ blockieren, und über Nacht bei 37 C inkubieren. Dann 3 Mal mit Waschpuffer waschen und Lagern in 1,25 mL Waschpuffer.</li>
		<li>Brüten 2 µL Urin mit 5 µL des magnetischen Beads (20 mg/mL) und bringen ein Gesamtvolumen zu 50 µL mit PBS (0,01 % Tween 20). 60 min inkubieren.</li>
		<li>Zweimal mit 50 µL PBS waschen (0,01 % Tween 20) mit einem Magnetabscheider, um magnetische Beads nach jedem Waschen zu sammeln.</li>
		<li>Eluieren Sie zweimal mit 32.5 µL 5 % Eisessig. Neutralisieren Sie zusammengefasste Elution (70 µL) mit 35 µL 2 M Tris, einen endgültigen pH-Wert von ~ 7 zu erreichen.</li>
		<li>Auf einem Teller-Reader zu lesen (siehe Tabelle der Materialien) bei geeigneter Anregung und Emission Wellenlängen, Urin Fluoreszenz zu quantifizieren. Berechnen Sie die Konzentration von fluoreszierenden Reporter gegen eine Leiter der bekannten Konzentrationen von freien Fluorophor.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Dr. Kwong ist Mitbegründer und dient als Berater Glympse Bio, die Entwicklung von Produkten im Zusammenhang mit der Forschung, die in diesem Dokument beschriebenen. Diese Studie könnte seine persönliche finanzielle Situation auswirken. Die Bedingungen dieser Vereinbarung überprüft und von Georgia Tech gemäß seinen Interessenkonflikt Richtlinien genehmigt

Diese Methode beschreibt die Entwicklung der Activity based Nanosensoren bestehend aus Protease Substrate zu einem Nanoparticle Kern konjugiert. Das Ereignis der proteolytischen Spaltung ist die "pharmakokinetischen Switch", genannt, weil gespalten Peptid-Produkte kleiner als die renale Filtration Größenbeschränkung von 5 nm23 und Filter in Urin sind, eine nicht-invasive Signal zu produzieren. Daher ist es wichtig, Nanopartikel oder Träger mit einem hydrodynamischen Radius, die größer ist als 5 nm...

Proteasen sind multifunktionelle Enzyme, die die Hydrolyse von Peptidbindungen spezialisiert und haben wesentliche Kontrolle über viele biologische Prozesse, einschließlich der Homöostase, Handlungspotentiale und Krankheit1. Ein veränderter Bewusstseinszustand der Protease-Aktivität hat zu einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen, machen Proteasen attraktive Kandidaten für die Entwicklung in klinischen Biomarker2,3korreliert. Darüber hinaus ist die Protease-Aktivität funktional verknüpften zu unterscheiden Pathogeneses, Behandlungsergebnisse und Prognose der Erkrankung4. Im großen und ganzen, Biosensoren wurde entwickelt, um verschiedene biologische Phänomene zu erkennen und Krankheiten wie Krebs, neurodegenerativen Erkrankungen und Elektronentransfer verarbeitet5,6,7,8 , 9. genauer gesagt, Protease Substrat-basierte Sensoren wurden entwickelt, um die Protease-Aktivität zu erkennen, und beinhalten Fluorogenic Sonden für die diagnostische Bildgebung10 und isotopischer beschriftet Peptid Substrate für in-vitro- Erkennung durch Massenspektrometrie11. Darüber hinaus wurden Activity based Sonden entwickelt, die Substrat-Regionen, die binden oder ändern das Ziel Protease12enthalten. Mit dieser Methode wird die Ziel-Protease irreversibel gehemmt, wenn aktiven Seite geändert wird, und Analyse des Gewebes, das in Vivo Anwendungen begrenzt Ernte benötigt. Jedoch ist es wichtig, die Protease-Aktivität in Vivo, Sinn, weil Regulierung der Protease-Aktivität stark abhängig vom Kontext des anderen biologischen Aktivitäten wie das Vorhandensein von endogene Inhibitoren ist.
Das Ziel dieser Arbeit ist es, die Formulierung des Activity based Nanosensoren zu beschreiben, die Protease-Aktivität in Vivo zu erkennen, indem Sie ein messbares Signal im Urin produzieren. Diese Plattform dient als eine nicht-invasive Diagnostik, um komplexe Krankheiten wie Krebs mithilfe Dysregulated Protease-Aktivität als funktionelle Biomarker zu unterscheiden. Unsere Nanosensor-Plattform besteht aus Eisenoxid-Nanopartikeln (IONP) konjugiert, Protease Substrate. Diese Substrate werden von einem fluoreszierenden Reporter beendet die Proteasen Spalten das Substrat freigesetzt wird. Diese IONPs in Vivozirkulieren, zu Krankheit Websites lokalisieren und setzen Substrate zu aktiven krankheitsassoziierten Proteasen. Nach der Spaltung fluoreszierende Reporter freigegeben sind und aufgrund ihrer geringen Größe sind in Urin, gefiltert, während uncleaved Substrate auf die IONP im Körper verbleiben. Daher führt eine Erhöhung der Protease Tätigkeiten in Vivo in höheren Konzentrationen der Reporter im Urin (Abbildung 1). Da unsere Plattform ein Urin-Test ist, keine imaging Plattform ist erforderlich und Diagnosesignale im Urin angereichert.
Diese Plattform kann entwickelt werden, um eine Vielzahl von Krankheiten einschließlich Krebs, Fibrose und Thrombose13,14zu erkennen. Hier beschreiben wir das Design der Nanosensoren Erhebungen in Matrix Metallopeptidase 9 (MMP9) erkennen Aktivität als Biomarker von Dickdarmkrebs. Darmkrebs ist die zweithäufigste Ursache für Krebstod in den Vereinigten Staaten, mit schätzungsweise 136.800 neue Fälle und 50.300 Todesfälle in 2014 allein15. Kolorektalen Tumorzellen produzieren MMP9, das gezeigt worden ist, zur malignen Progression, Matrix Schädigung sowie Metastasen16fahren. Darüber hinaus haben wir eine geeignete Peptid-Substrat (PLGVRGK) aus der Literatur17für MMP9 identifiziert. Diese Plattform kann für Früherkennung und kostengünstige Point-of-Care Diagnostik13,14,18,19,20,21verwendet werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57937/57937fig1.jpg"> Abbildung 1: Schematische Nanosensor Aktivität In Vivo. Nanosensoren durch den Körper zirkulieren und auf Seiten der Krankheit zu lokalisieren. Krankheitsbezogenen Proteasen Spalten dann Peptid Substrate von IONPs präsentiert. Die Größe der Fragmente gespalten ermöglicht renale Clearance, wodurch sie im Urin zu lokalisieren. Nachdem das Tier uriniert, können diese Peptid-Fragmente durch ihre Reporter Molekül analysiert werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57937/57937fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<table><tbody><tr><td>0,2 &Mikro; m Spritzenvorsatzfilter</td><td>VWR</td><td>4652</td><td></td></tr><tr><td>18G Nadel</td><td>VWR</td><td>89134-024</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Konika</td><td>VWR</td><td>89039-670</td><td></td></tr><tr><td>250 mL Erlenmeyerkolben</td><td>VWR</td><td>89000-362</td><td></td></tr><tr><td>Rührstab</td><td>VWR</td><td>58949-006</td><td></td></tr><tr><td>Heizplatte/Magnetrührer</td><td>VWR</td><td>97042-634</td><td></td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>VWR</td><td>97064-482</td><td></td></tr><tr><td>Albumin aus Rinderserum (BSA)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A13100</td><td></td></tr><tr><td>Eisen(III)-chloridhexahydrat</td><td>Sigma</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>Eisen(II)-chloridtetrahydrat</td><td>Sigma</td><td>44939</td><td></td></tr><tr><td>Epichlorhydrin</td><td>Sigma</td><td>45340-500ML-F</td><td></td></tr><tr><td>DMF</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Hydroxid</td><td>Sigma</td><td>320145-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Pellets Sigma</td><td>221465-500G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td></td><td>Sigma E9884</td><td></td></tr><tr><td>Natriumborat</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td>Sigma</td><td>168149-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>PBS Tabletten</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Pharmakosmos</td><td>5510 0020 9006</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 15 mL 10k Filter, 24 Stück</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 15 mL 30k Filter, 24 Stück</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 15 mL 100k Filter, 24 Stück</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NanoZS</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Dialysekassette</td><td>LifeTech</td><td>66130</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Tosylactivated</td><td>LifeTech</td><td>65501</td><td></td></tr><tr><td>SIA</td><td>Life Tech</td><td>22349</td><td></td></tr><tr><td>PEG 20k</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SH-20K-1g</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Antikörper [2A3]</td><td>GeneTex</td><td>GTX10257</td><td></td></tr><tr><td>Hiload 16/600 superdex 200</td><td>GE Healthcare</td><td>45-002-490</td><td></td></tr><tr><td>Plattenleser</td><td>Fisher</td><td>BTCYT5M</td><td></td></tr><tr><td>BD Insulinspritzen</td><td>Fisher</td><td>NC0872854</td><td></td></tr></tbody></table>

nanosensoren protease-aktivität in vivo für die nicht-invasive diagnostik zu erkennen

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Proteasen sind multifunktionelle Enzyme, die die Hydrolyse von Peptidbindungen spezialisiert und Breite biologische Prozesse einschließlich der Homöostase und Handlungspotentiale steuern. Darüber hinaus Dysregulated Proteaseaktivität treibt Pathogenese und ist eine funktionelle Biomarker von Krankheiten wie Krebs; Daher kann die Möglichkeit, Protease-Aktivität in Vivo zu erkennen klinisch relevante Informationen für die biomedizinische Diagnostik bieten. Dieses Protokoll soll Nanosensoren geschaffen, die für die Protease-Aktivität in Vivo Sonde durch die Herstellung einer quantifizierbaren Signals im Urin. Diese Protease Nanosensoren bestehen aus zwei Komponenten: einem Nanopartikel und Substrat. Die Nanopartikel Funktionen Zirkulation Half-Life und Substrat Lieferung an Ziel-Krankheit-Sites zu erhöhen. Das Substrat ist eine kurze Peptidsequenz (6-8 AA), die spezifisch für ein Ziel Protease oder eine Gruppe von Proteasen werden soll. Das Substrat wird an die Oberfläche der Nanopartikel konjugiert und wird von einem Reporter, wie z. B. einen fluoreszierenden Marker für die Erkennung beendet. Wie Dysregulated Proteasen das Peptid-Substrat Spalten, wird die Reporter in Urin für die Quantifizierung als Biomarker der Proteaseaktivität gefiltert. Hier beschreiben wir Bau des Nanosensor für Matrix-Metalloproteinase 9 (MMP9), der Tumorprogression und Metastasierung, zur Erkennung von Darmkrebs in einem Mausmodell zugeordnet ist.

Die Mehrheit der Bevölkerung der IONPs ist rund um den durchschnittlichen Durchmesser, die von 40-50 nm reicht. Nach PEGylierung, hat dieser Größenordnung eine Zirkulation Halbwertszeit von etwa 6 Stunden13 in Vivo (siehe Abb. 2a). Will man für einen bestimmten Größenbereich auswählen, können eine Größe Ausgrenzung Chromatographie um IONP Fraktionen mit unterschiedlichen Durchmessern zu isolieren. Die Nanopartikel durch TEM e...

Proteasen sind streng regulierte Enzyme grundlegende biologische Prozesse und Dysregulated Protease-Aktivität Laufwerke Fortschreiten von komplexen Krankheiten wie Krebs beteiligt. Diese Methode soll Nanosensoren geschaffen, die Protease-Aktivität in Vivo durch die Herstellung einer Spaltung Signal, das vom Host Urin nachweisbar ist und Krankheit diskriminiert messen.

Nanosensoren Protease-Aktivität In Vivo für die nicht-invasive Diagnostik zu erkennen

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich des Protea-Mixes und der Diagnostik zu beantworten, z. B. wie Sonden entwickelt werden können, die das Fortschreiten von Krankheiten durch Messung der Proteatenaktivität in vivo erkennen können. Der Hauptvorteil dieser Methode besteht darin, dass die entwickelten Diagnosen nicht-invasiv sind und den Nachweis biologischer Signale tatsächlich verstärken können. Diese Methode kann auf zahlreiche Krankheiten angewendet werden, da viele Proteusen tatsächlich wesentliche Treiber der Pathogenese sind.In den chemischen Abzug wird ein ml 30%Ammoniumhydroxid in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführt. Legen Sie dieses Röhrchen in einen Eiskübel und lassen Sie es 30 Minuten lang abkühlen. Einen 250 ml Ehrlenmeyerkolben mit entionisiertem Wasser waschen.Dann 10 ml doppelt destilliertes Wasser hinzufügen. Tauchen Sie den Kolben in ein Eisbad, das auf einer Heizplatte ruht. Mit einer Kunststoffpipette wird der Stickstoffgasfluss in das doppelt destillierte Wasser im Kolben eingeleitet.15 Minuten lang sprudeln lassen, um sich mit Sauerstoff zu versorgen. Wiegen Sie anschließend 4,5 g Dextrin in einem konischen 15-ml-Röhrchen ab. Fügen Sie Wasser hinzu, so dass das endgültige Volumen der Mischung einschließlich des Dextrins 20 ml beträgt.Kräftig vortexen, um das Dextrin aufzulösen. Wiegen Sie 78,5 mg Eisen-3-chlorid-Hexahydrat ab und geben Sie es zur Dextrinlösung. Wirbel zum Auflösen.Filtern Sie mit einem 0,2-μm-Filter die resultierende Lösung. Danach werden 9 ml des sauerstoffarmen Wassers in das konische 15-ml-Röhrchen mit 1 ml gekühltem Ammoniumhydroxid überführt. Stellen Sie das konische Rohr zum Abkühlen wieder in den Eiskübel.73 mg Eisen-2-chlorid-Tetrahydrat werden abgewogen und in den restlichen 1 ml sauerstoffarmem, doppelt destilliertem Wasser aufgelöst. Verwenden Sie einen 0,2-μm-Filter, um die Lösung zu filtern. Anschließend wird die Dextrin-Eisen-3-Lösung in den 250-ml-Ehrlenmeyerkolben überführt.Sauerstoffarm mit Stickstoffgas für 15 Minuten auf Eis, während bei 1.600 U/min mischen. Verschließen Sie den Kolben mit einem Gummiseptum. Mit einer 18-Gauge-Nadel das Septum durchstechen, um Stickstoffgas in den Kolben zu strömen.Führen Sie eine separate 18-Gauge-Nadel ein, die als Durchflussauslass dient. Verwenden Sie anschließend eine 1-ml-Spritze, um 467 μl der Eisen-2-Lösung zur Dextrin-Eisen-3-Lösung hinzuzufügen. Bei 1.600 U/min umrühren.Fügen Sie die gekühlte, verdünnte Ammoniumhydroxidlösung tropfenweise hinzu, um den Keimbildungsprozess zu starten. Stellen Sie sicher, dass sich jeder Tropfen gut vermischt, bevor Sie einen weiteren hinzufügen. Stoppen Sie den Fluss von Stickstoffgas und entfernen Sie das Gummiseptum.Entfernen Sie das Eisbad und ersetzen Sie es durch ein Bad mit warmem Wasser. Die Lösung auf 75 Grad Celsius erhitzen und dann 75 Minuten inkubieren. Nehmen Sie die Flasche von der Herdplatte.Die Lösung wird zweimal durch einen 0,2-μm-Filter und dann durch einen 0,1-μm-Filter filtriert, um grobe Partikel zu entfernen. Mit 100 kDa Molekulargewichts-Cutoff-Konzentratoren werden die Partikel durch Puffer in doppelt destilliertes Wasser ausgetauscht, um überschüssiges Dextrin zu entfernen. Wenn der Durchfluss nach zwei bis drei Umdrehungen dunkel bleibt, tauschen Sie die Filter aus, da sie möglicherweise defekt sind.Als nächstes resuspendieren Sie die Eisenoxid-Nanopartikel in doppelt destilliertem Wasser in einer Konzentration von 10 mg pro ml. Fügen Sie 1,6 Volumen 5 molare Natriumhydroxid hinzu und fügen Sie dann 0,65 Volumen Epichlorhydrin hinzu. Mit einem Plattenschüttler 12 Stunden lang bei Raumtemperatur streng mischen.Verwenden Sie eine 20-ml-Spritze mit einer 18-Gauge-Nadel, um die Eisenoxid-Nanopartikellösung in eine Dialysemembran mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 50 kDa zu überführen. Legen Sie die Dialysemembran in 4 Liter doppelt destilliertes Wasser. Über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren.Nach der Bestimmung der Konzentration die Eisenoxid-Nanopartikel auf eine Konzentration von 5 mg pro ml bringen. Ammoniumhydroxid auf 20 % zugeben und mindestens 12 Stunden bei Raumtemperatur schütteln, um die Oberfläche der Eisenoxid-Nanopartikel zu verbessern. Anschließend erfolgt der Pufferaustausch mit 30 kDa Molekulargewichts-Cutoff-Filtern.Verwenden Sie dynamische Lichtstreuung, um den hydrodynamischen Radius der Eisenoxid-Nanopartikel zu bestimmen, wie im Textprotokoll beschrieben. Nach der Synthese eines Peptidsubstrats aliquotieren Sie 0,5 mg Eisenoxid-Nanopartikel in das Spin-Filterrohr mit einem Molekulargewicht von 10 kDa. Pufferaustausch in einen Kopplungspuffer unter Verwendung eines 10 kDa Molekulargewichts-Cutoff-Spinfilters, wie im Textprotokoll beschrieben.Lösen Sie SIA in DMF auf, um eine Konzentration von ca. 30 mg pro ml zu erreichen. Fügen Sie dann SIA zu den Eisenoxid-Nanopartikeln in einem Molverhältnis von 500 zu eins hinzu. Nach der Inkubation und dem Pufferwechsel das Endprodukt auf eine Konzentration von 1 mg pro ml bringen.Mischen Sie das interessierende Peptid mit 20 kDa thiolterminiertem Polyethylenglykol und mischen Sie dann diese Peptidglykollösung mit Eisenoxid-Nanopartikeln. Decken Sie die Röhren mit Folie ab, um ein Ausbleichen der fluoreszierenden Moleküle zu verhindern. Und über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubieren, den auf die höchste Geschwindigkeit einstellen.Als nächstes fügen Sie L-Cystin in einem molaren Verhältnis von 500 zu eins zu den Eisenoxid-Nanopartikeln hinzu. Eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubieren, der auf die höchste Geschwindigkeit eingestellt ist. Danach stellen Sie eine 18 μl Nanopartikellösung unter Verwendung von PVS und eine 200 nanomolare Peptidkonzentration her.Fügen Sie 2 ul der interessierenden Protease hinzu. Inkubieren Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einem Plattenlesegerät und führen Sie alle ein bis zwei Minuten Fluoreszenzmessungen durch, um die Spaltung zu überwachen. Unmittelbar nach der Injektion der vorbereiteten Nanosensorlösung durch Schwanzveneninjektion werden die Mäuse in Stoffwechselkäfige gesetzt und der Zeitpunkt der Injektion für jede Maus notiert.Kombinieren Sie 2 μl Urin mit 5 μl vorbereiteten magnetischen Kügelchen. Bringen Sie mit PVS das endgültige Gesamtvolumen auf 50 ul. 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Waschen Sie anschließend zweimal mit jeweils 50 μl PVS, während Sie nach jedem Waschen einen Magnetabscheider verwenden, um die magnetischen Kügelchen zu sammeln. Zweimal mit 32,5 μl 5%iger Eisessigsäure eluieren. Verwenden Sie 35 μl von 2 molaren Tris, um die Poolverdünnung zu neutralisieren und einen endgültigen pH-Wert von etwa 7 zu erreichen.Verwenden Sie danach ein Plattenlesegerät bei geeigneten Anregungs- und Emissionswellenlängen, um die Urinfluoreszenz zu quantifizieren. Berechnen Sie die Konzentration des fluoreszierenden Reporters gegen eine Leiter bekannter Konzentrationen von freiem Fluorophor. In dieser Studie werden aktivitätsbasierte Nanosensoren entwickelt, indem Proteasesubstrate an einen Nanopartikelkern konjugiert werden.Der durchschnittliche Durchmesser von Eisenoxid-Nanopartikeln liegt zwischen 40 und 50 nm. Nach der Pekolation beträgt die Zirkulationshalbwertszeit für diesen Größenbereich etwa 6 Stunden. Nach erfolgreicher Peptidkonjugation zeigt die spektrale Absorptionsanalyse einen deutlichen Absorptionspeak bei der maximalen Anregungswellenlänge des fluoreszierenden Reporters.Die Fähigkeit der Sonde, die Proteaseaktivität zu erfassen, wird dann getestet, indem ein Aliquot von Nanosensoren mit rekombinanten Proteasen inkubiert wird. Es ist typisch, Substratspaltgeschwindigkeiten zu beobachten, die der Michaelis-Menten-Kinetik folgen. Nanosensoren, die mit einem Nahinfrarot-Fluoreszenzreporter beschichtet sind, werden dann verwendet, um die Pharmakokinetik in Mausmodellen von Krebs durch Ganztier-Fluoreszenzbildgebung sichtbar zu machen.Es wird beobachtet, dass sich ein Fluoreszenzsignal 60 bis 90 Minuten nach intravenöser Verabreichung der Nanosensoren im Urin von Mäusen mit LS 174 t kolorektal lokalisiert. Signifikant niedrigere Fluoreszenzsignale werden in der Blase von Kontrollmäusen beobachtet. Es sollte beachtet werden, dass das in der Leber beobachtete Signal entsteht, weil die Partikel schließlich von Monoziten und Makrophagen im ridiculoendophilialen System abgefangen werden, die häufig in der Leber, der Milz und den Lymphknoten vorkommen.Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Fluoreszenz die primäre Messgröße ist, daher ist es wichtig, die Peptidsubstrate mit fluoreszierenden Markern im Dunkeln zu halten. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Bioverteilungsstudien und In-viva-Bildgebung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die Lokalisierung von Partikeln in verschiedenen Organen.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Diagnostik den Weg, um Krebs-Biomarker bei Mäusen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Eisenoxid-Nanopartikel synthetisiert und charakterisiert, diese zum Bau von Nanosensoren verwendet und die Nanosensoren dann in vivo verwendet. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit den Chemikalien, die an einer Nanopartikelsynthese beteiligt sind, äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie persönliche Schutzausrüstung und Arbeiten in einem Abzug getroffen werden sollten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Die Protease Fluorescent Detection Kit ist für die Messung der Protease-Aktivität mit Fluorometrie konzipiert. Es eignet sich auch zum Nachweis von Spuren von Protease-Kontamination. Die Methode basiert auf der proteolytischen hydroysis von einer proprietären Rezeptur eines FITC-markiertem Casein Substrat.

Die Nutzung der Protease Fluorescent Detection Kit für Protease-Aktivität zu bestimmen

Fluoreszierende Nanopartikel in unserem Labor hergestellt werden, für die Bildgebung Ionenkonzentrationen und Ionenströme in biologischen Systemen wie Zellen während der Signalisierung und der interstitiellen Flüssigkeit während der physiologischen Homöostase eingesetzt.

Fluoreszierende Nanopartikel für die Messung von Ionen-Konzentration in biologischen Systemen

Dieses Video zeigt einen in vitro Assay zur Quantifizierung der Serinproteaseaktivität von Neutrophilen in Sputumproben. Die Probe, die sezernierte Protease enthält, wird mit einem fluoreszierenden Reporter inkubiert, der ein Erkennungsmotiv trägt. Die Spaltung des Motivs durch die Protease ermöglicht eine individuelle Fluoreszenzemission durch das Donor- und Akzeptorfluorophor des Reporters, was auf die Proteaseaktivität in der Probe hinweist.

Ein In-vitro-Assay zur Messung der Serinproteaseaktivität von Neutrophilen unter Verwendung eines fluoreszierenden Reporters

Dabei berichten wir über eine neue Methode, um Protein-Protein-Interaktionen mit Hilfe eines conductimetric Biosensors basierend auf die β-Lactamase-Hybridtechnologie zu studieren. Diese Methode beruht auf der Freisetzung von Protonen bei der Hydrolyse des β--Lactame.

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Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, funktionale Nanosensoren für die Portable, kostengünstig, zu synthetisieren und schnelle Erkennung von gezielt pathogene Bakterien durch eine Kombination von magnetischen Entspannung und Fluoreszenz Emission Modalitäten.

Foodborne Krankheitserreger Screening mit Magneto-fluoreszierende Nanosensor: Schnellnachweis von E. Coli O157: H7

Hier präsentieren wir Ihnen die Einzelheiten des Verfahrens einer neu entwickelten Protease Assays Plattform nutzen N-terminalen Hexahistidine/Maltose-bindendes Protein und fluoreszierende Protein fusioniert rekombinante Substrate an der Oberfläche der Nickel-Nitrilotriacetic befestigt saure magnetische Agarose Korne. Eine anschließende Gelanalyse der Assay-Proben durch Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt wird ebenfalls dargestellt.

Einsatz von rekombinanten Fusionsproteinen in eine fluoreszierende Protease-Assay-Plattform und ihre In-Gel-Renaturierung

Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für eine modifizierte Zymographic-Technik in der fluoreszierenden Peptide als abbaubare Substrat anstelle von native Proteine verwendet werden. Elektrophorese von biologischen Proben in fluoreszierenden Peptid-Zymogramme ermöglicht die Detektion eines breiteren Spektrums von Proteasen als frühere Zymographic Techniken.

Erkennung von Protease-Aktivität durch fluoreszierende Peptid Zymography

Veränderte Nuklease-Aktivität wurde mit verschiedenen menschlichen Bedingungen verbunden, die ihr Potenzial als Biomarker zugrunde liegen. Die modulare und einfach zu implementierende Screening-Methodik, die in diesem Papier vorgestellt wird, ermöglicht die Auswahl spezifischer Nukleinsäuresonden zur Nutzung der Nukleaseaktivität als Biomarker von Krankheiten.

Kinetisches Screening der Nuklease-Aktivität mit Nukleinsäuresonden

Die hier beschriebenen Protokolle bieten einen Leitfaden zur Visualisierung und Quantifizierung der Aktivität von Neutrophilenproteasen im menschlichen Sputum. Die Anwendungen einer solchen Analyse reichen von der Bewertung entzündungshemmender Behandlungen über die Validierung von Biomarkern, das Screening von Medikamenten bis hin zu klinischen Studien mit großen Kohorten.

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Dieses Protokoll beschreibt einen CRISPR-Cas-vermittelten, synthetischen Multianalyt-Urin-Biomarker-Test, der eine Point-of-Care-Krebsdiagnostik durch die Ex-vivo-Analyse tumorassoziierter Proteaseaktivitäten ermöglicht.

CRISPR-Cas-vermittelter synthetischer Multianalyt-Urin-Biomarker-Test für tragbare Diagnostik

Erfahren Sie, wie Nanosensoren die Protease-Aktivität in vivo erfassen und nicht-invasive Diagnostik ermöglichen. Diese Methode nutzt Urinproben zur Früherkennung von Krankheiten wie Krebs.

Nanosensoren Protease-Aktivität In Vivo für die nicht-invasive Diagnostik zu erkennen

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