Name: Digitale PCR zur Quantifizierung der zirkulierenden MicroRNAs in akuten Myokardinfarkt und kardiovaskulären Erkrankungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T14:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Erfahren Sie die digitale PCR zur präzisen Quantifizierung zirkulierender MicroRNAs als Biomarker für kardiovaskuläre Erkrankungen. Diese Methode ermöglicht absolute Quantifizierung ohne Standardkurven.

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Die Autoren haben keine Bestätigungen.

1. Gewinnung von MiRNA aus Plasma/Serum
Hinweis: Um MiRNAs angemessen zu quantifizieren, die richtige MicroRNA-Isolierung aus dem Plasma/Serum ist ein entscheidender Schritt. Eine wichtige Sache zu beachten, vor allem, weil unterschiedliche Protokolle vorhanden sind, ist zur Einhaltung des gleichen Workflows bei der Verarbeitung der Proben. In diesem Protokoll wird MiRNA aus 50 µL Serum gewonnen. Verwenden Sie nicht mehr als 200 µL als dieser Grenzwert die korrekte Extraktion.
<ol><li>Bereiten Sie Serum oder tauen Sie gefrorene Proben auf.</li>
	<li>50 µL Serum 250 µL (5 Bände) kommerzielle Lyse-Reagenz hinzufügen. Unterstützen Sie die Lyse durch aufschütteln. Legen Sie den Schlauch mit der lysate auf der Bank bei Raumtemperatur für 5 min.</li>
	<li>Spike lysate mit 3,5 µL Spike-Steuerelement (1.6 x 107 Kopien/µL) und mischen sie durch aufschütteln.</li>
	<li>Fügen Sie 50 µL Chloroform (d.h. den gleichen Betrag, der Ausgangspunkt Serumprobe) für die Phasentrennung. Schütteln Sie das Rohr für 15 S. Ort das Rohr auf der Bank bei Raumtemperatur für 2 – 3 min. kräftig.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie für die Phasentrennung das Rohr auf 12.000 x g bei 4 ° C für 15 Minuten. Hinweis: Die Proben werden nun in eine obere, wässrige Phase mit der RNA, eine weiße Interphase und eine niedrigere, Rosa organische Phase getrennt.</li>
	<li>Übertragung der oberen wässrigen Phase (100 µL), enthält die RNA in einen neuen Schlauch. Übertragen Sie weiße Interphase Material nicht, da dies die Anzahl der richtigen RNA verfälscht.</li>
	<li>Fügen Sie 150 µL (d.h.1,5 Mal die Menge der übertragenen Probe) von 100 % Ethanol. Mischen Sie die Materialien durch pipettieren sie rauf und runter. Zentrifugieren sie nicht und weitermachen Sie schnell mit dem nächsten Schritt.</li>
	<li>Pipette 250 µL der Probe auf eine kommerzielle Spin-Spalte in einer 2 mL-Kollektion-Röhre. Schließen Sie den Deckel. Zentrifugieren die Spalte > 8.000 x g bei Raumtemperatur 15 S. verwerfen der durchströmten.</li>
	<li>Die Spin-Spalte 700 µL kommerzielle waschen-Puffer-Nummer 1 hinzufügen. Schließen Sie den Deckel und Zentrifugieren die Spalte > 8.000 x g bei Raumtemperatur 15 S. verwerfen der Durchlauf-waschen-Puffer.</li>
	<li>Die Spin-Spalte 500 µL kommerzielle waschen-Puffer-Nummer 2 hinzufügen. Schließen Sie den Deckel und Zentrifugieren die Spalte > 8, 000 x g bei Raumtemperatur 15 S. verwerfen der Durchlauf-waschen-Puffer.</li>
	<li>Pipette 500 µL Ethanol 80 % auf die Spin-Spalte. Schließen Sie den Deckel, Zentrifugieren die Spalte > 8, 000 X g bei Raumtemperatur für 2 min. verwerfen das Sammelrohr mit dem Durchfluss.</li>
	<li>Übertragen Sie die Spin-Spalte auf eine neue 2 mL Sammelrohr. Zentrifugieren Sie die Spalte auf Hochtouren mit geöffneten Deckel um die Membran zu trocknen. Das sammelröhrchen mit Flow-through zu verwerfen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Spin-Spalte in eine neue 1,5 mL sammelröhrchen. Eluieren Sie RNA indem 30 µL RNase-freies Wasser direkt auf der Mitte der Membran. Schließen Sie den Deckel. Zentrifugieren Sie die Spalte auf Hochtouren für 1 min.</li>
	<li>Speichern der RNS bei-70 ° C. Hinweis: Die Lagerung von gereinigten RNA in RNase-freies Wasser zwischen-70 ° C bis-20 ° C garantiert kein Abbau der RNA für 1 Jahr. Nach Protokoll des Herstellers ist der Mindestbetrag der RNase-freies Wasser zum Verdünnen der RNS 10 µL. mit weniger als 10 µL können nur unzureichend Hydrat die Membran und reduzieren die Gesamtausbeute RNA.</li>
</ol>(2) reverse Transkription
Hinweis: Ergänzende DNA (cDNA) wurde unter Verwendung des folgenden 15 µL reverse Transkription (RT) Protokolls (gesamte Reaktionsvolumen) synthetisiert.
<ol><li>Tauen Sie das RT-Kit auf dem Eis. Halten Sie die Enzyme in den Gefrierschrank so lange wie möglich zu verhindern, dass sie beeinträchtigt und drehen sie Sie vor dem Gebrauch. Tauen Sie RT Primer auf Eis auf und drehen sie Sie vor dem Gebrauch.</li>
	<li>Bereiten Sie den master-Mix, wie in Tabelle 1beschrieben.</li>
	<li>Kombinieren Sie 10 µL des master-Mix und 5 µL der extrahierten RNA pro Bohrloch in einer 96-Well-Platte.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die well-Platte bei 2.000 x g bei 4 ° C für 2 min.</li>
	<li>Verwenden Sie das thermischen Zyklus-Protokoll für die reverse Transkription in Tabelle 2 beschrieben. Hinweis: Wie unten beschrieben, cDNA kann direkt verarbeitet werden in der digitalen PCR-Maschine (siehe Tabelle der Materialien); Alternativ kann es bei-20 ° c gelagert werden</li>
</ol>(3) Tröpfchen Generation und digitale PCR
Hinweis: Digitale PCR wurde durchgeführt unter Verwendung des folgenden 40 µL-Protokolls.
<ol><li>Tauen Sie den kommerziellen dPCR Mix, die vorbereiteten cDNA und die PCR-Primer auf Eis. Zentrifugieren sie kurz vor der Verwendung.</li>
	<li>Die master-Mix vorzubereiten, wie in beschrieben Tabelle 3.
</li>
	<li>1,33 μl/Well des Messguts RT hinzufügen und kurz Zentrifugieren.</li>
	<li>Pipette 20 μl der Probe in jede Vertiefung der Kassette 8-Brunnen (mittlere Reihe). Hinweis: Wenn die 8-Brunnen-Kassette nicht vollständig gefüllt ist, füllen Sie die restlichen Brunnen mit nicht-Template-Steuerelemente (NTCs), die cDNA (d. h., das RT-Produkt mit Wasser anstelle von extrahierten RNA hergestellt) weglassen oder dPCR kommerziellen Puffer. Der NTC dient als eine Kontaminationskontrolle. Wasser darf nicht in den verbleibenden Brunnen verwendet werden, weil die die Qualität der Tropfenbildung beeinträchtigen wird.</li>
	<li>Pipette 70 μL des tröpfchens Generation Öl für die Sonden in den Ölquellen (untere Zeile) der 8-Brunnen-Kassette.</li>
	<li>Legen Sie eine Dichtung auf die 8-Brunnen-Kassette und legen Sie die Kassette in die tropfengenerators. Schließen Sie die tropfengenerators. Warten Sie, bis die 3 leuchtet durchgehend grün sind. Hinweis: Tröpfchen sind nun generiert.</li>
	<li>Vorsichtig und langsam transfer 40 μL der Tröpfchen gebildet Probe (obere Zeile) in separaten Vertiefungen einer 96-Well-Platte pipettieren.</li>
	<li>Nach Abschluss der Tropfenbildung an den Proben, versiegeln die PCR-Platte mit einer durchstechbare dPCR Folie bei 180 ° C für 4 s.</li>
	<li>Legen Sie die Folie versiegelt PCR-Platte in der Cycler und Zyklus, wie beschrieben in Tabelle 4, mit einer Rampe-Rate von 2,5 ° C/s.</li>
</ol>(4) Tropfen lesen und analysieren
<ol><li>Übertragen Sie die Platte aus der Thermocycler auf der Basis der Kennzeichenhalter. Ziehen Sie die PCR-Platte, indem man oben auf den Kennzeichenhalter auf die PCR-Platte.</li>
	<li>Starten Sie die kommerzielle dPCR Software.</li>
	<li>Geben Sie die probennamen, den Namen des Experiments und das Ziel in der Einrichtung. Wählen Sie die absolute Quantifizierung.</li>
	<li>Starten Sie das Droplet lesen durch Klicken auf Ausführen. Wählen Sie FAM/HEX oder FAM/VIC als Erkennung Chemie, bei der Arbeit mit Hydrolyse-Sonden. Hinweis: Die kommerzielle dPCR Software wird dann automatisch-die Daten analysieren.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Tröpfchen-Nummern in der Ergebnistabelle um eine richtige Tröpfchen-Generation zu gewährleisten.</li>
	<li>Wählen Sie alle Brunnen mit der gleichen quantifizierte MiRNA und klicken Sie auf analysieren. Verwenden Sie den 2D Blot positivere Tröpfchen markieren und manuell korrigieren Sie die Auto-analysiert Daten (Abbildung 1).</li>
</ol>5. korrekte Berechnungen auf die Probe
<ol><li>Normalisieren Sie die Probe die Probe mit der Normalisierungsfaktor (NF) multipliziert. NF = Medianalle Proben[C. Elegans MiR-39 Messungen] / [C. Elegans MiR-39]gegebene Probe
</li>
	<li>Berechnen Sie die endgültige MiRNA-Serum-Konzentration, bereinigt um Verdünnungsfaktoren (DF). [MiRNA] Final = [MiRNA]Rohwert x DFRT x DFdPCR x DFEx Wo: [MiRNA] Rohwert = die MiRNA quantifiziert durch kommerzielle dPCR Software; DFRT = Verdünnungsfaktor der Vorlage in reverse Transkription; DFdPCR = Verdünnungsfaktor der Vorlage im dPCR; DF-Ex = Verdünnungsfaktor bei der Extraktion.</li>
</ol>(6) synthetisches Oligonukleotid Verdünnungsreihe
<ol><li>Lyophilisierter synthetisches Oligonukleotid auf Eis Auftauen. Zentrifugieren Sie es kurz.</li>
	<li>Verdünnen Sie die lyophilisierten synthetisches Oligonukleotid in Nuklease-freies Wasser, eine Endkonzentration von 10 Pmol / µL. kurz Zentrifugieren.</li>
	<li>Verdünnen Sie es in Nuklease-freies Wasser, wie in Tabelle 5beschrieben. Zentrifugieren Sie die Verdünnung kurz zwischen jedem Verdünnungsschritt bei 8.000 x g für 10 s.</li>
	<li>Fahren Sie mit der reversen Transkription wie in Schritt 2 beschrieben und analysieren Sie die Proben mit digitalen PCR zu, wie in Schritt 3 und Schritt 4 beschrieben.</li>
</ol>

<ol><li>Schulte, C., Zeller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-based+diagnostics+and+therapy+in+cardiovascular+disease+-+summing+up+the+facts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Diagnosis+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease - summing up the facts.</a> Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).</li>
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<li>Forootan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+determine+limit+of+detection+and+limit+of+quantification+in+quantitative+real-time+PCR+%28qPCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR).</a> Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).</li>
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<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7, 2409(2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Digitale PCR ist ein relativ neuer Endpunkt-Methode von PCR, die die direkte absolute Quantifizierung von Nukleinsäuren innerhalb einer Probe ermöglicht. Die Methode besitzt bestimmte Vorteile, wie eine verminderte Variabilität, einer erhöhten täglichen Reproduzierbarkeit und eine höhere Sensitivität11,12. Darüber hinaus durch die Partitionierung der Probe in etwa 20.000 einzelne Reaktionen und Endpunkt Analysen dPCR ist robuster, störender Substanzen in der PCR ...

Zirkulierenden MiRNAs wurden als vielversprechender Marker für eine Reihe von Krankheiten, einschließlich Herz-Kreislauf-Krankheit1identifiziert. Die MiRNAs sind klein, nicht-kodierenden einsträngige RNA-Moleküle (ca. 22 Nukleotide lang) engagieren sich in der Posttranskriptionale Verordnung über die Änderung der Boten-RNA Übersetzung und beeinflussende Gene Expression2, und in den Blutkreislauf in physiologischen und pathologischen Zuständen freigegeben werden. Quantitative Ausdruck der spezifischen MiRNAs der Pathologie zugeordnet werden kann, und einige MiRNAs zeigen hohe Gewebe und Krankheit Spezifität1. Im Herz-Kreislauf-Krankheiten sind MiRNAs attraktive Kandidaten geworden, da neue Biomarker weil sie bemerkenswert stabil im Serum sind und leicht können mit Hilfe der PCR Methode3quantifiziert werden. Der potenzielle Wert der MiRNAs als Biomarker für Myokardinfarkt wurde in kleinen Studien ausgewertet, aber eine Validierung in großen Kohorten fehlt2. Zum Beispiel MiR-499 findet man hoch in den Herzmuskel zum Ausdruck gebracht, und es hat gezeigt, dass ein AMI4,5,6deutlich erhöht werden. Darüber hinaus regelt es programmierte Zelltod (Apoptose) und die Differenzierung von Kardiomyozyten und engagiert sich daher in mehrere Mechanismen, die nach einem AMI-7. Abgesehen von einigen kleinen Studien Berichterstattung eine Überlegenheit und inkrementellen Wert von MiRNAs für die Diagnose von AMI Überlegenheit oder Gleichheit zu hoher Empfindlichkeit kardiale Troponins nicht noch in groß angelegten Studien2,5 nachweislich ,6,8. Weitere prospektiven Studien in großen Kohorten sind daher erforderlich, um die mögliche diagnostische Wertigkeit von MiRNAs zu beurteilen. Darüber hinaus Methoden zur Quantifizierung der MiRNA optimiert werden müssen und standardisierte Verwendung vergleichbarer Protokolle9. Standardisierte Tests möglicherweise inkonsistente Ergebnisse reduzieren und können helfen MiRNAs, potenzielle Biomarker für die routinemäßige klinische Anwendung werden als Biomarker müssen reproduzierbar Sicherstellung ihrer klinischen Anwendbarkeit quantifiziert werden.
Vor kurzem, hat dPCR als eine Endpunktanalyse eingeführt. Es Partitionen die Probe in etwa 20.000 individuelle Reaktionen10. Das dPCR System nutzt dann eine mathematische Poisson statistische fluoreszierende Signale (positive und negative Reaktionen), wodurch eine absolute Quantifizierung ohne eine Standardkurve10. Bei der Kombination von dPCR mit fluoreszierenden Hydrolyse Sonden wird die hochspezifische direkte absolute Quantifizierung von MiRNAs ermöglicht. Digitalen Polymerase-Kettenreaktion hat gezeigt, dass überlegene technische Eigenschaften (einschließlich eine verminderte Variabilität, einer erhöhten täglichen Reproduzierbarkeit, ein hohes Maß an Linearität und eine hohe Empfindlichkeit) zur Quantifizierung der MiRNA-Ebenen in weisen die Zirkulation im Vergleich zu quantitative Echtzeit-PCR-10,11. Diese überlegene technische Qualitäten könnte dazu beitragen, um aktuelle Beschränkungen bei der Verwendung von zirkulierenden MiRNAs als Biomarker zu mildern und führen zur Gründung der MiRNAs als Biomarker in großen multizentrischen klinischen Herz-Kreislauf- sowie eine diagnostische Methode in allgemeine. In einer früheren Studie haben wir vor kurzem angewendet dPCR für die absolute Quantifizierung der zirkulierenden MiRNAs bei Patienten mit einem AMI und konnten überlegene diagnostische Potenzial im Vergleich zu der Quantifizierung von MiRNAs qPCR12zeigen.
In dieser Publikation wollen wir zeigen, dass mit dPCR ist eine genaue und reproduzierbare Methode zur Quantifizierung der zirkulierenden Herz-Kreislauf-MiRNAs direkt. Die absolute Quantifizierung der MiRNA-Niveaus im Serum, mit digitalen PCR zeigt Potenzial für den Einsatz in großen multizentrischen Herz-Kreislauf-klinische Studien. In dieser Publikation beschreiben wir ausführlich, wie Sie digitale PCR effizient zu erfüllen und um die absolute MiRNA Kopienzahl im Serum zu erkennen.

<table><tbody><tr><td>RNA-Extraktion</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Kit (50)</td><td>Qiagen-Probe & Assay Technologies, Hilden, Deutschland</td><td>217184</td><td>Kit für die microRNA-Extraktion. Das Kit enthält den kommerziellen Puffer RWT (im Manuskript als Nummer eins bezeichnet)&nbsp; und RPE (im Manuskript als Nummer zwei bezeichnet).</td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmol</td><td>Qiagen-Probe & Assay Technologies, Hilden, Deutschland</td><td>219610</td><td>Spike-in für die Normalisierung, Sequenz: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3'</td></tr><tr><td>Reverse Transcription</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 Reaktionen)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4366597</td><td>Kit für die reverse Transkription von microRNA</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays M</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Assays für die reverse Transkription</td></tr><tr><td>has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Assay-Nummer 001352</td></tr><tr><td>cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Assay-Nummer 000200</td></tr><tr><td>PCR-Platte, 96-Well, segmentierte, halbröckige</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>AB0900</td><td>96-Well-Platte für die reverse Transkription</td></tr><tr><td>Microseal ' B&rsquo; Versiegelung versiegelt</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>MSB1001</td><td>Folie zur Gewährleistung einer ordnungsgemäßen Lagerung</td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1851196</td><td>Cycler für die reverse Transkription</td></tr><tr><td>Droplet Digital PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 nmol RNA Oligo has-miR-499-5p</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Custom</td><td>Sequenz: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGUUU-3'ddPCR</td></tr> <tr><td>Supermix für Sonden (kein dUTP)</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863024</td><td>Supermix für die Tröpfchengenerierung</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Assays</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Assays für die digitale PCR (Fluoreszenzhydrolysesonde)</em</td></tr><tr><td>>has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Assay Nummer 001352, kommerzielle Primer</td></tr><tr><td>cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)</td><td>Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA</td><td>4440887</td><td>Assay Nummer 000200, kommerzielle Primer</td></tr><tr><td>DG8 Kartuschen und Dichtungen</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1864007</td><td>Kartusche nimmt bis zu 8 Proben für die Tröpfchenerzeugung</td></tr><tr><td>auf DG8 Kartusche Halter</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863051</td><td>Hält Kartuschen in der Tröpfchenerzeugung</td></tr><tr><td>Tröpfchenerzeugungsöl für Sonden</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863005</td><td>Öl für die Tröpfchenerzeugung</td></tr><tr><td>ddPCR 96-Well-Platten</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>12001925</td><td>96-Well-Platte für ddPCR</td></tr><tr><td>PCR-Platte mit Heißsiegel, Folie, durchstechbar</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1814040</td><td>Durchstechbare Folie, kompatibel mit Droplet Reader</td></tr><tr><td>ddPCR Droplet Reader Oil</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863004</td><td>Öl, das bei der Tröpfchenlesung</td></tr><tr><td>verwendet wird QX100 oder QX200 Droplet Generator</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863002</td><td>Droplet Generator, erzeugt die Tröpfchen aus der Proben-/Ölemulsion</td></tr><tr><td>PX1 PCR Plate Sealer</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1814000</td><td>Versiegelt die Platte vor PCR</td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1851196</td><td>Cycler für ddPCR</td></tr><tr><td>QX100 oder QX200 Droplet Reader</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863003</td><td>Liest PCR-positive und PCR-negative Tröpfchen mit einem optischen Detektor</td></tr><tr><td>ddPCR-Pufferkontrolle für Sonden</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1863052</td><td>Blindkontrolle&nbsp; und zum Auffüllen der restlichen Vertiefungen von 8-Well</td></tr><tr><td><Cassettestrong>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantaSof Software</td><td>Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA</td><td>1864011</td><td>Programm zur Tröpfchenlesung</td></tr><tr><td>Prism Windows 5</td><td>GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA</td><td></td><td>Programm zur statistischen Analyse</td></tr></tbody></table>

digitale pcr zur quantifizierung der zirkulierenden micrornas in akuten myokardinfarkt und kardiovaskulären erkrankungen

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Zirkulierende Serum Mikro-RNAs (MiRNAs) haben gezeigt, dass Versprechen als Biomarker für die Herz-Kreislauf-Krankheiten und akutem Myokardinfarkt (AMI), wird von den Herz-Kreislauf-Zellen in den Blutkreislauf freigesetzt. Zirkulierenden MiRNAs sind sehr stabil und quantifiziert werden kann. Quantitative Ausdruck der spezifischen MiRNAs kann mit der Pathologie und einige MiRNAs zeigen hohe Gewebe und Krankheit Spezifität verknüpft werden. Neue Biomarker für Herz-Kreislauf-Krankheiten zu finden ist von Bedeutung für die medizinische Forschung. Vor kurzem wurde digital Polymerase-Kettenreaktion (dPCR) erfunden. dPCR, kombiniert mit fluoreszierenden Hydrolyse Sonden ermöglicht eine spezifische direkte absolute Quantifizierung. dPCR stellt überlegene technische Eigenschaften, einschließlich eine geringe Variabilität, hohe Linearität und hohe Empfindlichkeit im Vergleich zu den quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR). Somit ist dPCR eine genaue und reproduzierbare Methode zur Quantifizierung der MiRNAs, speziell für den Einsatz in großen multizentrischen klinischen Herz-Kreislauf-direkt. In dieser Publikation beschreiben wir, wie effektiv digitale PCR durchzuführen, um die absolute Kopienzahl in Serumproben zu beurteilen.

Digitale PCR kombiniert mit fluoreszierenden Hydrolyse Sonden ermöglicht Forschern direkt die absoluten Beträge der spezifischen MiRNAs in Kopien/µL zu quantifizieren. Wie das Beispiel in dPCR in etwa 20.000 einzelnen PCR-Reaktionen, partitioniert ist dPCR erfordert keine technischen repliziert10. Das dPCR System nutzt eine mathematische Poisson statistische Analyse der fluoreszierenden Signale (die sich zwischen positiven und negativen Reaktionen) eine absolute Qu...

Zirkulierenden MicroRNAs haben Versprechen als Biomarker für kardiovaskuläre Erkrankungen und akute Myokardinfarkte gezeigt. In dieser Studie beschreiben wir ein Protokoll für die MiRNA-Extraktion, reverse Transkription und digitale PCR für die absolute Quantifizierung von MiRNAs im Serum von Patienten mit kardiovaskulären Erkrankungen.

Digitale PCR zur Quantifizierung der zirkulierenden MicroRNAs in akuten Myokardinfarkt und kardiovaskulären Erkrankungen

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im diagnostischen Bereich zu beantworten, z. B. ob microRNAs valide Biomarker bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind. Im Vergleich zur quantitativen Real-Time-PCR weist die digitale PCR überlegene technische Qualitäten bei der Quantifizierung von microRNAs im Blutkreislauf auf. Da die Probe in etwa 20.000 Tröpfchen unterteilt ist, sind keine doppelten Messungen erforderlich und es wird keine Standardkurve für die Quantifizierung benötigt.Obwohl diese Methode einen Einblick in die Quantifizierung von microRNAs bei kardiovaskulären Patienten geben kann, kann sie auch auf andere Patienten und Krankheiten angewendet werden, da sich andere microRNAs als vielversprechende Biomarker bei der Krebsprogression erwiesen haben, und sie kann auch auf onkologische Patienten angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die erzeugten Tröpfchen zerbrechlich sind und mit Vorsicht behandelt werden müssen. Nachdem Sie RNA aus Serumproben isoliert haben, fahren Sie mit der reversen Transkription fort, um stabilere komplementäre DNA für die dPCR zu erhalten.Tauen Sie zunächst

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Hier beschreiben wir eine optimierte Multiplex-Reverse-Transkriptase-quantitative PCR (qRT-PCR)-Protokoll in Kombination mit einer mikrofluidischen Plattform als zeit-und kosteneffektiver High-Throughput-Screening-Tool für microRNA (miRNA) Expression, besonders beim Arbeiten mit geringen Mengen der Probe.

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimierte Multiplex qRT-PCR in Nanoliter-Maßstab auf dem Fluidigm Dynamische ArrayTM IFCs

Messung von Biomarkern in komplexen biologischen Proben wird zunehmend Führung klinische Entscheidungsfindung. Wir beschreiben eine sehr empfindliche Methode, um gleichzeitig die Herzmyosin bindendes Protein-C, Creatin-Kinase-MB und Troponin I im Serum von Patienten mit Myokardinfarkt und gesunden Kontrollpersonen.

Eine empfindliche und spezifische Quantifizierung Methode zur Bestimmung der Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C durch Elektrochemilumineszenz Immunoassay

Zirkulierende microRNAs haben in letzter Zeit als vielversprechend und neue Biomarker für verschiedene Krebsarten und anderen Krankheiten. Das Ziel dieses Artikels ist es, drei verschiedene Sonden-basierten Echtzeit-PCR-Plattformen und Methoden, die zur Verfügung zu quantifizieren und zu bestimmen, die Fülle der zirkulierenden microRNAs sind zu diskutieren.

Sonde-basierte Echtzeit-PCR Ansätze zur quantitativen Messung von microRNAs

Es wird eine empfindliche und genaue Methode zur Quantifizierung zellfreier microRNAs unter Verwendung einer farbstoffbasierten Chemie und einer digitalen Tröpfchen-PCR-Technologie beschrieben.

Zirkulierende MicroRNA Quantifizierung der Basis von DNA-bindenden Farbstoff Chemie und Droplet Digital-PCR

MicroRNAs spielen eine wichtige regulatorische Rolle und werden als neue therapeutische Targets für verschiedene menschliche Krankheiten entstehen. Es hat sich gezeigt, dass miRNAs in Lipoproteinen hoher Dichte durchgeführt werden. Wir haben ein vereinfachtes Verfahren entwickelt, um schnell gereinigter HDL für miRNA-Analyse von Humanplasma geeignet isolieren.

Schnelle und vereinfachte Verfahren für Hochdurchsatz-Isolierung von miRNA aus Highly Purified High Density Lipoprotein

Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll zur Messung der absoluten Werte der Plasma MiRNA, quantitative Real-Time reverse Transkription PCR verwenden, mit oder ohne Vorverstärkung. Dieses Protokoll bietet besseres Verständnis für die Menge an Plasma MiRNAs und qualitative Bewertung der entsprechenden Daten aus verschiedenen Studien oder Labors ermöglicht.

Absolute Quantifizierung von MicroRNA-Plasmaspiegel bei Cynomolgus Affen, über Quantitative Real-Time Reverse Transkription PCR

Mikro-RNAs (MiRNAs) sind kurz und stark homologe RNA-Sequenzen, dienen als Posttranskriptionale Regulatoren der Messenger-RNAs (mRNAs). Aktuelle MiRNA Nachweismethoden unterscheiden sich in der Sensitivität und Spezifität. Wir beschreiben eine Protokoll, die in Situ Hybridisierung und Immunostaining für die gleichzeitige Erkennung von MiRNA und Protein-Moleküle auf Maus Herz Gewebeschnitte verbindet.

Gewebespezifische MiRNA Expression Profiling in Maus Herz Abschnitte In Situ Hybridisierung

In diesem Artikel wird ein Protokoll zum Nachweis der microRNA-Expression in den Nieren eines Mausmodells für akutes Nierenversagen unter Verwendung einer quantitativen Echtzeit-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion vorgestellt. Dieses Protokoll konzentriert sich auf ein Mausmodell mit ischämischer Nierenschädigung und die sorgfältige Extraktion von microRNA-Proben.

Eine quantitative Nachweismethode für microRNAs in der Niere eines Mausmodells mit ischämischer Nierenschädigung

Dieses Protokoll beschreibt die detaillierte Methode der digitalen Tröpfchen-PCR (dd-PCR) zur präzisen Quantifizierung von zirkulären RNA (circRNA)-Spiegeln in Zellen unter Verwendung divergenter Primer.

Quantifizierung zirkulärer RNAs mittels digitaler Tröpfchen-PCR

Das Rattenmodell der akuten Myokardinfarkt (AMI) ist nützlich, um die Folge eines MI auf die kardiale pathophysiologischen und physiologischen Funktion zu untersuchen.

Akuter Myokardinfarkt bei Ratten

Erfahren Sie die digitale PCR zur präzisen Quantifizierung zirkulierender MicroRNAs als Biomarker für kardiovaskuläre Erkrankungen. Diese Methode ermöglicht absolute Quantifizierung ohne Standardkurven.

Digitale PCR zur Quantifizierung der zirkulierenden MicroRNAs in akuten Myokardinfarkt und kardiovaskulären Erkrankungen

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