Digitale PCR zur Quantifizierung der zirkulierenden MicroRNAs in akuten Myokardinfarkt und kardiovaskulären Erkrankungen
3. Juli 2018
Zirkulierenden MicroRNAs haben Versprechen als Biomarker für kardiovaskuläre Erkrankungen und akute Myokardinfarkte gezeigt. In dieser Studie beschreiben wir ein Protokoll für die MiRNA-Extraktion, reverse Transkription und digitale PCR für die absolute Quantifizierung von MiRNAs im Serum von Patienten mit kardiovaskulären Erkrankungen.
Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im diagnostischen Bereich zu beantworten, z. B. ob microRNAs valide Biomarker bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind. Im Vergleich zur quantitativen Real-Time-PCR weist die digitale PCR überlegene technische Qualitäten bei der Quantifizierung von microRNAs im Blutkreislauf auf. Da die Probe in etwa 20.000 Tröpfchen unterteilt ist, sind keine doppelten Messungen erforderlich und es wird keine Standardkurve für die Quantifizierung benötigt.
Obwohl diese Methode einen Einblick in die Quantifizierung von microRNAs bei kardiovaskulären Patienten geben kann, kann sie auch auf andere Patienten und Krankheiten angewendet werden, da sich andere microRNAs als vielversprechende Biomarker bei der Krebsprogression erwiesen haben, und sie kann auch auf onkologische Patienten angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die erzeugten Tröpfchen zerbrechlich sind und mit Vorsicht behandelt werden müssen. Nachdem Sie RNA aus Serumproben isoliert haben, fahren Sie mit der reversen Transkription fort, um stabilere komplementäre DNA für die dPCR zu erhalten.
Tauen Sie zunächst das reverse Transkriptionskit auf Eis auf. Schleudern Sie dann die Enzyme und die Primer nach unten. Bereiten Sie als Nächstes den Mastermix vor, wie im Textprotokoll beschrieben.
Kombinieren Sie 10 Mikroliter des Mastermixes mit fünf Mikrolitern extrahierter RNA in jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte. Dann zentrifugieren Sie die Platte bei 2.000xg bei vier Grad Celsius für zwei Minuten. Fahren Sie mit der reversen Transkription fort, wie im Textprotokoll beschrieben.
Tauen Sie zunächst den handelsüblichen dPCR-Mix, die cDNA- und PCR-Primer auf Eis auf und zentrifugieren Sie sie unmittelbar vor der Verwendung. Bereiten Sie dann den Mastermix vor, wie im Textprotokoll beschrieben. 1,33 Mikroliter Volumen des reversen Transkriptionsprodukts zu 18,67 Mikroliter Volumen des Mastermixes geben und kurz zentrifugieren.
Übertragen Sie mit einer Pipette 20 Mikroliter der Probe in jede Vertiefung der mittleren Reihe einer Acht-Well-Kassette. Pipettieren Sie dann 70 Mikroliter Öl zur Tröpfchenerzeugung in die Ölquellen der Kassette. Legen Sie als Nächstes eine Dichtung auf die Kassette und legen Sie sie in den Tröpfchengenerator.
Schließen Sie den Tröpfchengenerator und warten Sie, bis die drei Kontrollleuchten durchgehend grün leuchten. Übertragen Sie mit einer Pipette vorsichtig 40 Mikroliter der tröpfchenförmigen Probe in separate Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Anschließend verschließen Sie die Platte mit dPCR-Folie bei 180 Grad Celsius für vier Sekunden.
Legen Sie die versiegelte PCR-Platte in den Cycler und befolgen Sie die Zyklusanweisungen im Textprotokoll. Nehmen Sie die Platte aus dem Thermocycler und legen Sie sie auf den Boden eines Plattenhalters. Setzen Sie dann die Oberseite des Plattenhalters auf die PCR-Platte.
Starten Sie abschließend die kommerzielle dPCR-Software. In diesem Protokoll wurde die digitale PCR verwendet, um microRNAs im Serum von Patienten mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen zu quantifizieren. Die Proben wurden von 16 Patienten vor, acht Stunden nach und 16 Stunden nach der perkutanen Intervention entnommen.
Patienten mit Myokardinfarkt mit ST-Hebung zeigten einen signifikanten Anstieg der miR-499-Spiegel im Vergleich zu Patienten mit stabiler koronarer Herzkrankheit. Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa einer Stunde für die Tröpfchenbildung von 96 Proben durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, darauf zu achten, dass Sie mit den Tröpfchen vorsichtig umgehen.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die digitale PCR korrekt durchführen, indem Sie die Tröpfchenbildung korrigieren, das Durchlaufen, das Lesen und die Analyse durchführen.
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Übersicht
Diese Studie stellt ein Protokoll für die Extraktion und Quantifizierung zirkulierender microRNAs als potenzielle Biomarker für kardiovaskuläre Erkrankungen vor. Mithilfe der digitalen PCR zielt die Methode darauf ab, die Genauigkeit der miRNA-Messung in Serumproben von Patienten mit kardiovaskulären Erkrankungen zu verbessern.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Kardiovaskuläre Erkrankung
- Biomarker
- MicroRNA-Analyse
Hintergrund
- Mikro-RNAs sind kleine, nicht-kodierende RNAs, die an der Genregulation beteiligt sind.
- Sie haben sich als potenzielle Biomarker für verschiedene Erkrankungen, einschließlich kardiovaskulärer Zustände, herauskristallisiert.
- Die digitale PCR bietet Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden bei der Quantifizierung von Mikro-RNAs.
- Das Verständnis von miRNA-Profilen kann zur Diagnose und zum Management kardiovaskulärer Erkrankungen beitragen.
Zweck der Studie
- Validierung von Mikro-RNAs als Biomarker für Herz-Kreislauf-Erkrankungen.
- Nachweis der Wirksamkeit der digitalen PCR bei der Quantifizierung zirkulierender miRNAs.
- Bereitstellung eines zuverlässigen Protokolls für Forscher auf diesem Gebiet.
Verwendete Methoden
- Extraktion von miRNAs aus Serumproben.
- Reverse Transkription zur Synthese komplementärer DNA.
- Digital-PCR zur absoluten Quantifizierung von miRNAs.
- Vergleich der Digital-PCR mit der quantitativen Echtzeit-PCR.
Hauptergebnisse
- Die digitale PCR zeigte eine überlegene Genauigkeit bei der Quantifizierung von miRNA.
- Die Methode ermöglicht die Analyse von Tausenden von Tröpfchen ohne die Notwendigkeit von Standardkurven.
- Die potenzielle Anwendbarkeit der Methode erstreckt sich über kardiovaskuläre Erkrankungen hinaus auf andere Krankheiten wie Krebs.
- Bei neuen Anwendern der Technik wurden Schwierigkeiten beim Umgang mit empfindlichen Tröpfchen festgestellt.
Schlussfolgerungen
- Die Studie unterstützt die Verwendung zirkulierender microRNAs als Biomarker für kardiovaskuläre Erkrankungen.
- Die digitale PCR ist ein aussichtsreiches Werkzeug für die präzise Quantifizierung von miRNAs.
- Weitere Forschung könnte die Anwendung dieser Methode auf andere Krankheiten ausweiten.
Häufig gestellte Fragen
Exemplarische Branchenrelevanz
Die Quantifizierung zirkulierender Mikro-RNAs mittels digitaler PCR bietet einen reproduzierbaren, hochsensitiven Ansatz zur Biomarker-Validierung in der kardiovaskulären Forschung. Diese Methode unterstützt die Target-Validierung und Assay-Entwicklung, indem sie eine absolute Quantifizierung ohne Standardkurven ermöglicht und somit die Variabilität in multizentrischen Studien verringert. Das Verfahren erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem es die Expression von miRNAs mit der Pathologie verknüpft und somit Entscheidungen über die Weiterverfolgung oder Einstellung therapeutischer Hypothesen unterstützt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Quantifizierung krankheitsspezifischer miRNAs wie miR-499 beim akuten Myokardinfarkt (AMI).
- Operationaler Wert: Liefert absolute Kopienzahlen von miRNAs ohne Standardkurven und verbessert so die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Standorten.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die biomarkerbasierte Selektion von Wirkstoffkandidaten, indem miRNA-Spiegel mit kardiovaskulären Erkrankungen verknüpft werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt validierte biologische Systeme (cDNA aus serumgebundener RNA) für nachgeschaltete Screening-Workflows.
- Operativer Wert: Liefert Ergebnisse mit hoher Linearität und geringer Variabilität, die sich für die Assay-Standardisierung eignen.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Verarbeitung von 96 Proben in etwa einer Stunde nach Inbetriebnahme und unterstützt damit Screening im mittleren Durchsatz.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationale Kontinuität: Verbindet die Entdeckungsphase der miRNA-Quantifizierung mit der präklinischen Validierung über krankheitsrelevante Serum-Biomarker.
- Mechanistische Entlastung: Verringert die Uneindeutigkeit bei der Target-Validierung, indem die miRNA-Expression mit kardiovaskulären Schäden korreliert wird.
- Biomarker-Ausrichtung: Unterstützt die Entwicklung translationaler Biomarker durch Quantifizierung von miRNAs mit hoher Gewebe- und Krankheitsspezifität.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Hypothesenprüfung bis zur Identifizierung von Leitstrukturen ein und liefert quantitative miRNA-Daten, die Aufschluss über die Zielverlässlichkeit und die Bereitschaft des Assays geben.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch Quantifizierung der Freisetzung von miRNAs aus kardiovaskulären Zellen in den Kreislauf.
- Screening: Erzeugt analysenfertige, standardisierte Ergebnisse mit hoher Empfindlichkeit zur Bewertung von Biomarker-Kandidaten.
- Analytik: Ermöglicht den direkten Vergleich von miRNA-Spiegeln unter verschiedenen Bedingungen mittels absoluter Quantifizierung ohne Standardkurven.
- Translationale Forschung: Fördert die Biomarker-Kontinuität, indem zirkulierende miRNA-Profile mit kardiovaskulären Pathologien verknüpft werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Quantifizierungsplattform, die für kardiovaskuläre und onkologische Indikationen anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit hinsichtlich der Gültigkeit von Biomarkern durch die quantifizierung von miRNA mit geringer Variabilität und hoher Empfindlichkeit.
- Operationaler Wert: Gewährleistet Reproduzierbarkeit und Standardisierung durch eine tropfenbasierte Partitionierung, die Doppelmessungen eliminiert.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Projekten, indem mechanistische Unklarheiten in der Beziehung zwischen Biomarkern und Zielstrukturen verringert werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Weiterentwicklung anhand quantitativer, mit der Pathologie verknüpfter miRNA-Daten.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der RNA-Isolierung, reversen Transkription und Tropfenhandhabung, um Probenverluste zu vermeiden.
- Benötigt Ausrüstung zur Tropfengenerierung, PCR-Cycler und dPCR-Software für eine genaue Quantifizierung.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise im Bereich Tropfenbildung und -versiegelung über mehrere Teams hinweg voraus, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
- Erfordert Anpassungen, wenn die Methode auf andere Probenarten als Serum angewendet wird, beispielsweise Plasma oder Gewebelysate.
- Beinhaltet praktische Einschränkungen wie die empfindliche Handhabung von Tropfen, die die Durchsatzleistung bei unerfahrenen Anwendern beeinträchtigen kann.
