Spritze-injizierbaren Mesh Elektronik für stabile chronische Nagetier Elektrophysiologie

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Neurowissenschaften zu beantworten, z. B. wie sich Alterungsprozesse im Gehirn manifestieren, wie sich das Gehirn entwickelt und wie Hirnerkrankungen entstehen und fortschreiten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Netzelektronik nach der Implantation in das Gehirn keine chronische Immunantwort bei Gliose auslöst und eine nahtlose Integration mit dem umgebenden Nervengewebe ermöglicht. Tao Zhou, Doktorand in der Lieber-Gruppe, und Jung Min Lee, Postdoktorand in der Lieber-Gruppe, werden das Verfahren vorführen.

Um den Vorgang zu starten, laden Sie einen sauberen Siliziumwafer in einen thermischen Verdampfer und verdampfen Sie 100 Nanometer Nickel. Als nächstes wird SU-8 2000.5 Negativ-Fotolack mit 400 Umdrehungen pro Minute auf den Wafer geschleudert, um eine ungefähre SU-8-Dicke von 400 bis 500 Nanometern zu erreichen. Laden Sie den Wafer in einen Masken-Aligner, um den SU-8 mit einer Fotolithographie-Maske zu belichten, die der unteren Mesh-SU-8-Schicht entspricht.

Bei einer I-Line-Dosis von 100 Millijoule pro Quadratzentimeter exponieren. Tauchen Sie den Wafer in ein Tray des SU-8-Entwicklers. Rühren Sie die Lösung zwei Minuten lang vorsichtig um, bis sich das Maschenmuster in der SU-8 vollständig entwickelt hat.

Spülen Sie dann die Waffel eine Minute lang in einer Schale mit Isopropylalkohol ab und föhnen Sie sie trocken. Den Wafer auf einer heißen Platte bei 180 Grad Celsius eine Stunde lang hart backen. Anschließend wird LOR 3A mit 4.000 Umdrehungen pro Minute auf den Wafer geschleudert, um eine Dicke von etwa 300 Nanometern zu erreichen.

Spin Coat S1805 positiver Fotolack bei 4.000 Umdrehungen pro Minute für eine ungefähre Dicke von 500 Nanometern. Laden Sie anschließend den Wafer in einen Masken-Aligner, um den S1805 mit der Fotolithographie-Maske zwei zu belichten, die den Metallverbindungen und den Ein- und Ausgangspads entspricht. Belichten Sie den Wafer mit einer H-Linien-Dosis von 40 Millijoule pro Quadratzentimeter und tauchen Sie ihn dann in ein Tablett mit CD-26-Fotolackentwickler.

Rühren Sie die Lösung eine Minute lang vorsichtig um, bis sich das Metallverbindungsmuster vollständig entwickelt hat. Spülen Sie den Wafer eine Minute lang in einer Schale mit entionisiertem Wasser ab und föhnen Sie ihn trocken. Als nächstes verdampfen Sie drei Nanometer Chrom thermisch, gefolgt von 80 Nanometern Gold.

Tauchen Sie den Wafer etwa drei Stunden lang in ein flaches Becherglas mit Remover PG, bis das Metall vollständig unterschnitten ist, so dass das Metall nur noch in den gewünschten Verbindungs- und Eingangs- und Ausgangspadbereichen der Mesh-Elektronik verbleibt. Wiederholen Sie die Spin-Beschichtung, die Lithographie, das Verdampfen und heben Sie ab, um drei Nanometer Chrom und 50 Nanometer Platin in den Elektrodenbereichen zu verbleiben. Wiederholen Sie anschließend die Spin-Beschichtung und die Fotolithographie von SU-8, um die oberste SU-8-Netzschicht zu definieren.

Behandeln Sie den Wafer eine Minute lang mit Sauerstoffplasma bei 50 Watt. Tauchen Sie den Wafer anschließend etwa drei Stunden lang in Nickelätzlösung ein, bis sich die Mesh-Elektronik vollständig vom Siliziumwafer gelöst hat. Verwenden Sie eine Pasteurpipette, um die freigesetzten Netzelektroniksonden aus dem Nickelätzen in ein 100-Milliliter-Becherglas mit deionisiertem Wasser zu übertragen.

Übertragen Sie dann die Netzelektronik mindestens dreimal in ein frisches Becherglas mit entionisiertem Wasser, um eine Spülung zu gewährleisten. Um die Netzelektronik in eine Nadel zu laden, führen Sie eine Glaskapillarnadel in das 100-Milliliter-Becherglas von PBS ein, in dem sich die Netzelektronik befindet. Positionieren Sie das Ende der Nadel in der Nähe der Eingangs- und Ausgangspads einer Netzelektroniksonde und ziehen Sie die Spritze manuell zurück, um eine Netzelektroniksonde in die Nadel zu ziehen.

Drücken und ziehen Sie den Spritzenkolben, während er noch in Kochsalzlösung eingetaucht ist, um die Position der Netzelektronik in der Nadel einzustellen. Um Mesh-Elektronik in ein Mäusegehirn zu injizieren, verwenden Sie einen Zahnbohrer und einen stereotaktischen Rahmen, um eine Kraniotomie an den gewünschten Koordinaten am Schädel zu eröffnen. Öffnen Sie eine zweite Kraniotomie außerhalb der Injektionsstelle, um eine Graphikschraube oder einen Draht aus Edelstahl einzuführen.

Befestigen Sie dann einen Klemmuntergrund mit Zahnzement am Schädel. Ein etwa einen Millimeter breiter Schnitt im Substrat verbessert die Zuverlässigkeit des Falzschritts im weiteren Verlauf des Verfahrens. Montieren Sie anschließend den Pipettenhalter mit der Nadel mit der Mesh-Elektronik mit einer rechtwinkligen Endklemme in den stereotaktischen Rahmen.

Befestigen Sie den seitlichen Auslass des Pipettenhalters an einer Fünf-Milliliter-Spritze, die in einer Spritzenpumpe mit einem 0,5 bis einen Meter langen Kapillarschlauch befestigt ist. Verwenden Sie dann den stereotaktischen Rahmen, um die Nadelspitze an der gewünschten Startposition im Gehirn zu positionieren. Positionieren Sie die Kamera so, dass die Oberseite der Netzelektroniksonde in der Glasnadel angezeigt wird.

Initiieren Sie den Durchfluss, indem Sie die Spritzenpumpe auf eine niedrige Drehzahl einstellen und auf Start drücken. Erhöhen Sie langsam die Durchflussrate, wenn sich die Maschenelektroniksonde nicht in der Nadel bewegt. Wenn sich die Netzelektroniksonde innerhalb der Nadel zu bewegen beginnt, verwenden Sie den stereotaktischen Rahmen, um die Nadel mit der gleichen Geschwindigkeit zurückzuziehen, mit der die Netzelektroniksonde injiziert wird, wobei die markierte ursprüngliche Position der Netzelektronik als Führung verwendet wird.

Lassen Sie die Kochsalzlösung weiter fließen und ziehen Sie die Nadel zurück, bis die Nadel aus dem Schädel ausgetreten ist. Stoppen Sie dann den Durchfluss aus der Spritzenpumpe. Verwenden Sie bei diesem Verfahren den stereotaktischen Rahmen, um die Nadel vorsichtig über den Spalt zum flachen, flexiblen Kabelklemmsubstrat zu führen, wobei die Lösung mit der Spritzenpumpe fließt, um einen Durchhang in den Netz-Elektronikverbindungen zu erzeugen.

Sobald sich die Nadel über dem Klemmsubstrat und über dem Spalt befindet, setzen Sie den Fluss mit einer schnellen Geschwindigkeit fort, um die Netzelektronik-Eingangs- und Ausgabepads auf das Klemmsubstrat zu injizieren. Biegen Sie mit einer Pinzette und einer Pipette mit entionisiertem Wasser die Eingangs- und Ausgangspads in einem 90-Grad-Winkel so nah wie möglich an der ersten Eingabe. Sobald die Eingangs- und Ausgangspads ausgerichtet und gefaltet und im 90-Grad-Winkel zum Mesh-Schaft gefaltet sind, trocknen Sie sie an Ort und Stelle mit sanft strömender Druckluft.

Schneiden Sie das Klemmsubstrat an einer geraden Kante ab, die etwa 0,5 bis einen Millimeter von der Kante der Ein- und Ausgabepads entfernt ist. Schneiden Sie außerdem überflüssige Teile des Klemmsubstrats ab, die das Einsetzen in den auf der Leiterplatte montierten 32-Kanal-zif-Steckverbinder behindern. Stecken Sie dann die Eingangs- und Ausgangspads in den zif-Anschluss auf der Leiterplatte und schließen Sie die Verriegelung.

Verwenden Sie die Messelektronik, um die Impedanz zwischen den Kanälen und der Schraube zu messen, um eine erfolgreiche Schnittstelle zu bestätigen. Wenn die Impedanzwerte zu hoch sind, lösen Sie den zif-Stecker, passen Sie die Einsteckung an und testen Sie erneut, bis die erfolgreiche Verbindung bestätigt wurde. Decken Sie anschließend den zif-Stecker und die freiliegenden Mesh-Elektronikverbindungen zum Schutz mit Zahnzement ab.

Drehen Sie die Leiterplatte an der Lücke im Substrat um und befestigen Sie die Leiterplatte mit Zement auf dem Mäuseschädel. Für frei bewegliche Aufnahmen lösen Sie die Maus aus dem Halterung, nachdem Sie die Vorverstärkerplatine eingesetzt und die Referenzschraube geerdet haben. Nehmen Sie mit dem Datenerfassungssystem für die gewünschte Zeit auf, während sich die Maus frei verhält.

Hier sehen Sie die repräsentativen lokalen Feld-Heatmaps von den elektronischen Sonden mit 32-Kanal-Netzen, die in den Hippocampus und den somatosensorischen Kortex der Maus injiziert wurden. Die Daten wurden aufgezeichnet, während die Maus zwei Monate und vier Monate nach der Injektion ihren Käfig frei erkundete. Die Amplitude des lokalen Feldpotentials wird entsprechend dem Farbbalken auf der rechten Seite farbcodiert.

Hochpassfilterspuren, schwarz, die eine Spike-Aktivität zeigen, sind auf dem Spektrogramm für jeden der 32 Kanäle überlagert. Hier sind die Spitze, die nach dem Sortieren der gezeichneten Daten isoliert wurde. An 26 der 32 Kanäle wurde sowohl zwei Monate nach der Injektion als auch vier Monate nach der Injektion eine Single-Unit-Spike-Aktivität festgestellt.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die E/A-Schnittstelle zu testen, um die erfolgreiche elektrische Verbindung mit der Mesh-Elektroniksonde zu bestätigen. Die Messimpedanz hilft bei der Fehlerbehebung bei der Fehlerursache und ist entscheidend, um Probleme mit der Schnittstelle oder Herstellung zu identifizieren. Nach diesem Verfahren kann eine Histologie durchgeführt werden, um die zelluläre Umgebung um jede aufgezeichnete Elektrode herum zu untersuchen.

Im Gegensatz zu herkömmlichen, starren Hirnsonden kann die Netzelektronik während der Histologie im Gewebe belassen werden, so dass elektrophysiologische Daten genau mit immunhistochemischen Analysen korreliert werden können.