Name: Zerstörungsfreie Überwachung der abbaubaren Gerüst-basierten Tissue-Engineering Blutgefäß Entwicklung mit optischen Kohärenztomographie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Erfahren Sie die zerstörungsfreie Überwachung von Gefäßremodellierung und Gerüstabbau in der vaskulären Tissue-Engineering-Forschung mittels optischer Kohärenztomographie. Diese Methode ermöglicht Echtzeitbildgebung.

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Wir möchten die Wissenschaft und Technik Planung Projekt der Provinz Guangdong (2016B070701007) für die Unterstützung dieser Arbeit anerkennen.

(1) abbaubar PGA Gerüst basierte Tissue-Engineering Schiffe Kultur
<ol><li>PGA-Gerüst Herstellung<ol>
<li>Nähen Sie PGA-Netz (19 mm Durchmesser und 1 mm dick) um Silikonschlauch sterilisiert mit Ethylenoxid (17 cm lang, Durchmesser 5,0 mm und 0,3 mm dick) mit 5: 0 Naht.</li>
		<li>Nähen Sie Polytetrafluorethylen (ePTFE, 1cm Länge) mit 4: 0 Naht auf jedem Ende des PGA-Netzes und von 2 mm überlappt.</li>
		<li>Tauchen Sie PGA Gerüste mit der Hand in 1 Mol/L NaOH für 1 min, passen die räumliche Struktur des Netzes und mit Gewebekultur Grade Wasser drei Mal für 2 min einweichen. Trocknen Sie das Gerüst mit einem Papiertuch sanft pat jedes Mal. Dann vertrocknen Sie Gerüste in eine Kapuze mit einem Gebläse für 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montage der Bioreaktor und der Y-Kreuzung für die OCT-Bildgebung<ol>
<li>Einweichen der selbstentwickelten Glas zylindrische Bioreaktor (10 cm Durchmesser und 11,7 cm Höhe mit vier Lippen innen und vier Seitenarme außerhalb des Reaktors, wie in Abbildung 1dargestellt), PGA Gerüste, Silikonschlauch (Außendurchmesser 5 mm, Stärke 0,3 mm), biokompatible Rohre, Anschlüsse, Stir Bar und Ausrüstung für die Montage in einem 95 % Ethanol Tank für 2 h.</li>
		<li>Ziehen Sie PGA Gerüst durch Seitenarme des Bioreaktors verbunden zu einer Seite mit einem Stecker als auch eine andere Seite mit der Y-Kreuzung verwendet, OCT Führungsdraht zu liefern. Montieren Sie eine weitere PGA-Gerüst im Bioreaktor auf die gleiche Weise. Siehe Abbildung 1.</li>
		<li>Passen Sie ePTFE Bioreaktor Lippen durch das Anziehen mit 4: 0 Nahtmaterial.</li>
		<li>Den Bioreaktor in Ethanol Tank wieder für 1 h und Trocknen über Nacht in Haube mit Gebläse auf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aussaat von HUASMCs und statischen Bioreaktor Klimaanlage<ol>
<li>HUASMCs von menschlichen Nabelschnur Arterien durch standard Explant Techniken isolieren.</li>
		<li>Zu erweitern Sie und zu pflegen Sie, dass Zellen im glatten Muskel Zelle Wachstumsmedium bestehend aus DMEM Medium, 20 % fötalen Rinderserum, 2,36 mg/mL HEPES, 100 U/mL Penicillin G, 50 µg/mL Prolin, 20 µg/mL Alanin, 50 µg/mL Glycin, 1,5 µg/mL CuSO4, 50 µg/mL Ascorbinsäure , grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor mit 10 ng/mL und 10 ng/mL Platelet-derived Wachstumsfaktor.</li>
		<li>Samen HUASMCs in einer Konzentration von 5 × 106 Zellen/mL in den oben genannten Kulturmedium auf der PGA-Gerüste.</li>
		<li>Setzen Sie einen Stir bar (1,5 cm Länge) im Bioreaktor. Legen Sie eine Ernährungssonde (Durchmesser 5 mm, Länge 15 cm) und drei kurze Schläuche Segmente (5 mm Durchmesser, 7 cm Länge) für Gasaustausch durch den Silikon-Stopper-Deckel.</li>
		<li>Jede Änderung Luftschlauch und ein Heparin-Kappe, um die Einfüllöffnung PTFE 0,22 µm Filter zuordnen. Anpassen der Stir Bar mit einer mitreißenden Geschwindigkeit von 13 Schuss pro Minute. Montieren Sie die Glas Bioreaktor, Silikon Stopper Deckel und PGA Gerüst in der Kultursystem.</li>
		<li>HUASMCs für 45 Minuten zu halten, indem Sie lehnen den Bioreaktor alle 15 min mit Ständer, nach links und rechts zu ermöglichen. Der Reaktor Häfen und Gelenke sind alle mit Paraffin Film versiegelt.</li>
		<li>Schließen Sie die Luo-Ye Pumpe, PBS Tasche, den Fahrer mit biokompatiblen Röhren als die Perfusion System. Öffnen Sie das Laufwerk, die Rohre mit PBS zu füllen.</li>
		<li>Ort der gesamten Bioreaktor in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 ° C. Füllen Sie die Kultur-Kammer mit 450 mL Kulturmedium HUASMCs.</li>
		<li>Drücken Sie die Stopptaste und schalten Sie die Stromversorgung der Antriebseinrichtung. Wachsen Sie die gesäten Gerüste unter Statische Kultur für eine Woche.</li>
		<li>Ändern Sie das Kulturmedium alle 3-4 Tage durch Absaugen die Hälfte des alten Mediums durch die Einfüllöffnung und Nachfüllen des Reaktors mit eine äquivalente Menge an frischem Nährmedium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung der Perfusion System für OCT-Bildgebung<ol>
<li>Pumpen Sie Flüssigkeiten in der PBS-Tasche durch biokompatible Röhren und zurück in den Beutel zu zirkulieren.</li>
		<li>Öffnen Sie die Kraft des Fahrers und regulieren Sie Pumpe-Einstellung mit einer Frequenz von 60 Schlägen pro Minute und Output systolischen Druck von 120 MmHg zu. Passen Sie die mechanischen Parameter entsprechend den Anforderungen der technischen Kreislauf Gewebekultur.</li>
		<li>Klicken Sie auf Ausführen, um die Perfusion System funktioniert. Geben Sie die oben genannten feste pulsatile Stimulation zu den Schiffen für 3 Wochen durch Druckbeaufschlagung iterativ biokompatible Röhren10,12 nach 1 Woche statische Kultur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Durchführung der optischen Bildgebung mit OCT
<ol><li>Verwenden Sie eine Lichtquelle um die axiale Auflösung des 10-20µm und die Bildtiefe von 1-2 mm Ermittlung die Struktur des TEBV basierend auf den Frequenzbereich OCT intravaskulären imaging System9sicherzustellen.</li>
	<li>Schalten Sie den Ein-/Ausschalter und öffnen Sie die Bild-Capture-Software zu.</li>
	<li>Verbinden Sie den Fiber optic imaging Katheter an den Antriebsmotor und optische Controller (DOC) mit Katheter automatischer Rückzug Funktion.</li>
	<li>Eingestellten Parameter des Bildes Erfassungsrate auf 10 Bilder pro Sekunde mit einer automatischen Rückzug Geschwindigkeit 10 mm/s.</li>
	<li>Legen Sie imaging Katheter auf Y-Kreuzung über Heparin Kappe mit einer Nadel 18G.</li>
	<li>Legen Sie den Katheter in den Silikonschlauch und identifizieren Sie die Naht Dichtheit der PGA Netz vor dem Laden PGA Gerüst auf den Bioreaktor zu.</li>
	<li>Platzieren Sie die Katheterspitze über der Region von Interesse. Passen Sie die Pullback-Gerät und überprüfen Sie für die Bild-Qualität-8.</li>
	<li>Abrufen von Bildern auf 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 28 Tage in Kultur für jede einzelne TEBV und sparen gegenüber dem Vorquartal mit Echtzeit-Beobachtung des TEBV Mikrostruktur, einschließlich Oberflächenmorphologie, interne Struktur und Zusammensetzung.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Messung für 3 Mal, um zuverlässige Messung der technischen Schiffe jedes Mal bekommen. Erfassen Sie eine Serie von Bildern während der Testphase mit dem Bild-Capture-Software.</li>
</ol>3. bildgebende Analyse
<ol><li>Verwenden Sie Bildanalyse-Software TEBV Wandstärke messen. Wählen Sie das Bild analysiert werden. Klicken Sie auf die Tracking-Tool, um die innere Seite des TEBV von der Software automatisch zu identifizieren und manuell Skizze der äußeren Seite. Ein Diagramm der Dicke wird auf dem Bildschirm angezeigt.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Messung für 5mal um zuverlässige Messung der Konstrukte zu erhalten. Die OCT-Analyse wurde von zwei unabhängigen Ermittlern geblendet, die erhaltenen Informationen durchgeführt.</li>
</ol>4. Ernte von TEBV und Gewebe Verarbeitung
<ol><li>Offen Silikon Stopper Deckel über den Bioreaktor gelegt, nach Beendigung die Kultur und das Kulturmedium zu verwerfen. EPTFE vom Bioreaktor Lippen lösen und die Silikonschläuche von der äußeren Seite der ePTFE mit einer Schere durchschneiden. Ernten Sie TEBVs aus dem Bioreaktor zu und schneiden Sie in Abschnitte für das Scannen von Elektronenmikroskopie Prüfung.</li>
	<li>Nehmen Sie den Rest des TEBVs und in 4 µm Dicke Abschnitte geschnitten. Unterstützendes Silikonschlauch herausziehen und Abschnitte mit 4 % Paraformaldehyd befestigen. Führen Sie regelmäßige histologische Färbung von Masson trichrome und Sirius rote zu prüfen, die Morphologie von Kollagen und PGA10,13,14.</li>
	<li>Um PGA Inhalte und Kollagen-Komponente zu beurteilen, beobachten Sie histologische Proben mit Sirius rote Färbung durch eine polarisierte Mikroskop. PGA-Reste sind klar abgegrenzt durch Doppelbrechung und Überrest Bereich basierend auf die Querschnittsfläche10quantifiziert werden kann.</li>
</ol>

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<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="https://scholar.google.com/scholar?hl=en&as_sdt=0%2C22&q=Application+of+optical+coherence+tomography+in+tissue+engineered+blood+vessel+culture+based+on+Luo-Ye+pump&btnG=">Application of optical coherence tomography in tissue engineered blood vessel culture based on Luo-Ye pump.</a> Chinese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 31, 687-690 (2015).</li>
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<li>Naito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+burst+pressure%3A+initial+evaluation+of+the+natural+history+of+the+biaxial+mechanical+properties+of+tissue-engineered+vascular+grafts+in+the+venous+circulation+using+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Beyond burst pressure: initial evaluation of the natural history of the biaxial mechanical properties of tissue-engineered vascular grafts in the venous circulation using a murine model.</a> Tissue Engineering Part A. 20, 346-355 (2014).</li>
<li>Smart, N., Dube, K. N., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+vessel+development+and+insight+towards+neovascular+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Coronary vessel development and insight towards neovascular therapy.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 90, 262-283 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Zu generieren entwickelt Schiffe mit strukturellen und mechanische Eigenschaften ähnlich denen von native Blutgefäße führen um zu verkürzen die Zeit für die klinische Anwendung und ist das ultimative Ziel des vaskulären Engineering. Optische bildgebende Verfahren ermöglichen die Visualisierung von Gewebezüchtungen vaskulären spezifische Komponenten, die einzelnen Konstrukte in der gesamten Kultur und Belichtung Transplantate zu einer Kultur-Umgebung überwachen kann, ohne Kompromisse bei der Sterilität7<...

Tissue-Engineering Blutgefäße (TEBVs) ist die vielversprechendste Material als eine ideale Gefäßprothese1. Um Transplantate klinisch nützlich mit ähnlichen strukturellen und funktionellen Eigenschaften als native Schiffe zu entwickeln, wurden mehrere Techniken so Gefäßfunktion2,3zu erhalten. Zwar gab es veränderter Gefäße mit akzeptablen Durchgängigkeit Raten während der Implantation und in Phase III klinische Studie4, zeigen langfristige Kultur und hohen Kosten auch die Notwendigkeit der Überwachung der Entwicklung des TEBVs. Verständnis der extrazellulären matrix(ECM) Wachstum, Umbau und Anpassung Prozesse in TEBVs in der biomimetischen Chemo-mechanischen Umgebung bieten wichtige Informationen für die Entwicklung des Vascular Tissue Engineering.
Die ideale Strategie verfolgen die Entwicklung von kleinem Durchmesser veränderter Gefäße5 sollte zerstörungsfrei, STERIL, längs-, dreidimensionale und quantitative. TEBVs unter verschiedenen Kulturbedingungen konnte durch diese bildgebende Modalität, sogar einschließlich Änderungen vor und nach der vaskulären Transplantation bewertet werden. Strategien, um die Funktionen des Lebens zu beschreiben, veränderter Gefäße benötigt werden. Optische bildgebende Verfahren ermöglichen die Visualisierung und Quantifizierung von Gewebe Abscheidung und Biomaterialien. Weitere Vorteile sind die Möglichkeit, tiefen Gewebe und markierungsfreie Bildgebung mit hoher Auflösung6,7zu aktivieren. Bild-spezifische Moleküle und weniger leicht zugängliche optische Geräte zur Echtzeit-Überwachung ist jedoch ein erhebliches praktisches Hindernis, das die umfassende Anwendung der nichtlinearen optischen Mikroskopie begrenzt hat. Optische Kohärenztomografie (OCT) ist ein optischer Ansatz mit intravaskulären bildgebende Modalität als weit verbreitete klinische Instrument zur kardialen interventionellen Therapie8führen. In der Literatur berichtete die OCT-Methode als eine Möglichkeit, die Wandstärke des TEBVs9,10, gepaart mit affirmativen bildgebender Verfahren für Vascular Tissue engineering Research zu bewerten. In der Erwägung, dass die Dynamik der vaskulären entwickelt wurde Wachstum und Umbau nicht beobachtet.
In dieser Handschrift die, ausführlich wir die Erstellung von biologisch abbaubaren Polymeren Gerüst-basierte TEBVs für vier Wochen Kultur. Menschlichen Nabelschnur Arterien vaskulären glatten Muskelzellen (HUASMCs) sind erweitert und in eine poröse abbaubaren Polyglycolic Säure (PGA) Gerüste im Bioreaktor ausgesät. Biologisch abbaubare Polymere die Rolle in einem temporären Substrat für das Tissue Engineering und haben eine gewisse Verschlechterung Rate11. Um entsprechende Übereinstimmung zwischen Gerüst Abbau und Neo-gewebsneubildung zu gewährleisten, sind ECM und PGA Gerüste entscheidende Faktoren für die effektive Gefäße Umgestaltung. Die Perfusion System simuliert der biomechanischen Mikroumgebung von einheimischen Schiffen und unterhält eine konsequente Verformung unter Druck-Stimulation.
Das Ziel des vorliegenden Protokolls ist eine relativ einfache und zerstörungsfreie Strategie für TEBVs imaging und Langzeitüberwachung der Kultur zu beschreiben. Dieses Protokoll kann zur Visualisierung der morphologischen Veränderungen und Dickenmessung von veränderter Gefäße unter verschiedenen Kulturbedingungen genutzt werden. Darüber hinaus können die Analysen der Polymer-basierten Materialien Abbau in der Gewebetechnik Gerüste für die Identifizierung durchgeführt werden. Durch die Kombination von Methoden des Scannens Elektron können microscopic(SEM) und polarisierte Mikroskop verwendet in diesem Protokoll, Korrelation und Quantifizierung der extrazellulären Matrix Verteilung und PGA Abbau erfolgen die Bewertung Gerüst erleichtern kann, Abbau in Kombination mit OCT-Bildgebung.

<table><tbody><tr><td>PGA Mesh</td><td>Synthecon-Silikonschlauch</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cole Parmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Connector</td><td>Cole Parmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>intravaskuläres OCT-System</td><td>St. Jude Medical, Inc</td><td>ILUMIEN&trade; OPTIS&Handel; SYSTEM</td><td></td></tr><tr><td>Rasterelektronenmikroskopisch</td><td>Philips</td><td>FEI Philips XL-30</td><td></td></tr><tr><td>polarisiertes Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>Olympus BX51</td><td></td></tr><tr><td>Nähte</td><td>Johnson & & Johnson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pulsierende Pumpe</td><td>Guangdong Cardiovascular Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightLab Bildgebungssoftware</td><td>St. Jude Medical, Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zerstörungsfreie Überwachung der abbaubaren gerüst-basierten tissue-engineering blutgefäß entwicklung mit optischen kohärenztomographie

Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography

Veränderter vascular Grafts mit strukturellen und mechanischen Eigenschaften ähnlich wie natürliche Blutgefäße werden voraussichtlich die wachsende Nachfrage nach arterielle Bypass. Charakterisierung von der Wachstumsdynamik und Umbau Prozess der abbaubaren Polymer Gerüst-basierten Tissue-engineering Blutgefäße (TEBVs) mit pulsatile Stimulation ist entscheidend für das Vascular Tissue Engineering. Optische bildgebende Verfahren zeichnen sich als leistungsfähige Werkzeuge für die Überwachung der Vaskularisierung des technischen Gewebes ermöglicht hochauflösende Bildgebung in Echtzeit-Kultur. Dieses Papier zeigt eine zerstörungsfreie und schnelle Echtzeit-imaging-Strategie, um das Wachstum zu überwachen und Umbau des TEBVs in langfristige Kultur mithilfe optischer Kohärenztomografie (OCT). Geometrische Morphologie wird ausgewertet, darunter Gefäße Umgestaltung Prozess, Wandstärke und Vergleich der TEBV Dicke in verschiedenen Kultur-Zeitpunkte und Anwesenheit der pulsatile Stimulation. Zu guter Letzt OCT bietet praktische Möglichkeiten für Echtzeit-Beobachtung der Abbau des Polymers in die Rekonstruktion Gewebe unter pulsatile Stimulation oder nicht und in jedem Gefäß-Segment, verglichen mit der Bewertung des Polymer Abbau mit scanning Electron microscopic(SEM) und polarisierte Mikroskop.

Die dreidimensionalen Kultursystems bestand aus einer Kultur Kammer in den Bioreaktor und die Perfusion System mit einem geschlossenen Kreislauf Flüssigkeit10,13 (Abbildung 1). Die OCT-Bildgebung-Katheter eingefügt in das distale Ende des Y-Kreuzung und zog sich zurück in den Silikonschlauch für die Bildgebung. OCT-Bildgebung wurde zuerst verwendet, um die strukturelle Charakterisierung von biologisch...

Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die zerstörungsfreie und langperiodischer Überwachung des Prozesses der vaskulären Umbau und Abbau Gerüst in Echtzeit-Kultur von biologisch abbaubaren Polymeren Gerüst-basierten Tissue-engineering Blutgefäße mit pulsatile stimulation mit der optischen Kohärenztomographie wird hier beschrieben.

Zerstörungsfreie Überwachung der abbaubaren Gerüst-basierten Tissue-Engineering Blutgefäß Entwicklung mit optischen Kohärenztomographie

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Gefäßgewebe-Engineering zu beantworten, wie die Überwachung der Dynamik des Ingenieur-Gefäßwachstums und Umbau während der Langzeitkultur. Der Hauptvorteil der Verwendung der optischen Kohärenztomographie (OCT) besteht darin, dass es sich um eine leicht verfügbare, echtzeit- und zerstörungsfreie Bildgebungsstrategie handelt, um die strukturellen Merkmale und den Umbauprozess von technischen Gefäßen zu charakterisieren. Demonstriert wird das Verfahren auch von Shangmin Liu und Wentao Ma, Technikern aus meinem Labor.Um dieses Verfahren zu beginnen, fertigen Sie das PGA-Gerüst, wie im Textprotokoll Dip PGA Gerüste in einem Mol-pro-Liter-Natriumhydroxid für eine Minute beschrieben, um die räumliche Struktur des Netzes einzustellen. Dann die Gerüste dreimal für jeweils zwei Minuten in gewebekulturtaugliches Wasser einweichen. Jedes Mal das Gerüst vorsichtig mit einem Tissuepapier trocknen.Dann trocknen Sie die Gerüste in einer Haube mit einem Gebläse für eine Stunde aus. Um den Bioreaktor und die Y-Kreuzung für die OCT-Bildgebung zu montieren, können Sie zunächst den selbst entwickelten glaszylindrischen Bioreaktor, DIE PGA-Gerüste, die Silikonrohre, die biokompatiblen Rohre, die Steckverbinder, die Rührstange und die Ausrüstung für die Montage in einem 95-prozentigen Ethanoltank für zwei Stunden einweichen. Ziehen Sie das PGA-Gerüst durch die Seitenarme des Bioreaktors, die mit einem Stecker an einer Seite verbunden sind, sowie mit der Y-Kreuzung, mit der der OCT-Führungsdraht geliefert wird.Montieren Sie ein weiteres PGA-Gerüst im Bioreaktor auf die gleiche Weise. Passen Sie das Polytetrafluorethylen an die Lippen des Bioreaktors an, indem Sie es mit 4-0 Nähten anziehen. Den Bioreaktor noch einmal für eine Stunde in den Ethanoltank geben, bevor man ihn über Nacht in einer Haube mit eingeschaltetem Gebläse trocknet.Jetzt isolieren menschliche Nabelarterie glatte Muskelzellen aus menschlichen Nabelarterien durch Standard-Explantationstechniken In der Ursache der Rettung der Zellen in PGA-Gerüste, vermeiden Sie ein Tropfen der Zellsuspension auf den Boden des Bioreaktors. Bedecken Sie den Bioreaktor auch so schnell wie möglich nach dem Zellbestuhlung mit einem Silikon-Stopperdeckel, um eine Kontamination zu verhindern. Erweitern und pflegen Sie die Zellen in glatten Muskelwachstum Medium.Säen Sie die menschlichen Nabelarterie glatte Muskelzellen mit einer Konzentration von 5 Millionen Zellen pro Milliliter im oben genannten Kulturmedium auf die PGA-Gerüste. Nachdem Sie einen Sir-Bar in den Bioreaktor platziert haben, bedecken Sie ihn mit dem Silikonstopfendeckel, der ein Zuführrohr und drei kurze Schlauchsegmente für den Gasaustausch enthält. Befestigen Sie PTFE 0,22 Mikron-Filter an jedem Luftwechselrohr und befestigen Sie eine Heparinkappe am Zuführrohr.Stellen Sie die Rührstange mit einer Rührgeschwindigkeit von 13 Runden pro Minute ein. Dann montieren Sie den Glasbioreaktor, den Silikonstopfendeckel und das PGA-Gerüst in das Kultursystem. Lassen Sie die Zellen 45 Minuten haften, indem Sie den Bioreaktor alle 15 Minuten mit einem Ständer nach links und rechts lehnen.Schließen Sie nun die LOO-OH-YEE Pumpe, den phosphatgepufferten Salinebeutel und den Treiber mit den biokompatiblen Rohren an, um das Überflusssystem zu erstellen. Öffnen Sie den Treiber, um die Rohre mit PBS zu füllen. Platzieren Sie den gesamten Bioreaktor in einem befeuchteten Inkubator mit 5 Prozent CO2 bei 37 Grad Celsius.Füllen Sie die Kulturkammer mit 450 Millilitern des Kulturmediums. Die gesäten Gerüste unter statischer Kultur für eine Woche anbauen, das Kulturmedium alle drei bis vier Tage verändern, indem die Hälfte des alten Mediums durch das Zuführrohr angesaugt und der Reaktor mit einer entsprechenden Menge an frischem Kulturmedium nachgefüllt wird. Um das Profusionssystem für die OCT-Bildgebung vorzubereiten, pumpen Flüssigkeiten in den PBS-Beutel, um sie durch die biokompatiblen Schläuche und zurück in den Beutel zu zirkulieren.Öffnen Sie die Leistung des Treibers und regulieren Sie die Pumpeneinstellung mit einer Frequenz von 60 Schlägen pro Minute und einem systemtolischen Ausgangsdruck von 120 Millimeter Quecksilber. Passen Sie die mechanischen Parameter an die Bedürfnisse der gewebetechnischen Gefäßkultur an. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, damit das Überflusssystem funktioniert.Stellen Sie den Gefäßen drei Wochen lang die fixe pulsatile Simulation zur Verfügung, indem Sie die biokompatiblen Röhren nach einer Woche statischer Kultur iterativ unter Druck setzen. Verwenden Sie eine Lichtquelle, um die axiale Auflösung von zehn bis zwanzig Mikrometern und die Bildtiefe von ein bis zwei Millimetern zu gewährleisten, um die Struktur der gewebetechnischen Blutgefäße oder TEVBs basierend auf dem intravenkulären Bildgebungssystem OCT zu identifizieren. Schalten Sie den Netzschalter ein und öffnen Sie die Bildaufnahmesoftware Verbinden Sie den glasfaseroptischen Bildgebungskatheter mit der automatischen Rückzugsfunktion des Katheters an den Antriebsmotor und den optischen Controller.Legen Sie die Parameter der Bildaufnahmerate auf zehn Bilder pro Sekunde fest, mit einer automatischen Rückziehgeschwindigkeit von zehn Millimetern pro Sekunde. Befestigen Sie nun den Bildkatheter über die Heparinkappe mit einer 18-Spur-Nadel an der y-Kreuzung. Legen Sie den Katheter in das Silikonrohr und identifizieren Sie die Strukturdichtheit des PGA-Netzes, bevor Sie das PGA-Gerüst auf den Bioreaktor laden.Platzieren Sie nun die Katheterspitze über dem Interessengebiet. Passen Sie das Rückziehgerät an, und überprüfen Sie die Bildqualität. Erwerben Sie Bilder an einem, vier, sieben, zehn, 14, 17, 21 und 28 Tagen in Kultur für jede einzelne TEBV.Speichern Sie diese Bilder sequenziell mit einer Echtzeitbeobachtung der TEBV-Mikrostruktur einschließlich Oberflächenmorphologie, interner Struktur und Zusammensetzung. Wiederholen Sie die Messung dreimal, um jedes Mal eine zuverlässige Messung der konstruierten Gefäße zu erhalten. Erfassen Sie eine Reihe von Bildern während des Tests mit der Bildaufnahme-Software.Um die Bildanalysesoftware zur Messung der gewebetechnischen Wandstärke des Blutgefäßes zu verwenden, wählen Sie zunächst das zu analysierende Bild aus. Klicken Sie dann auf das Tracking-Tool, um die Innenseite des gewebegefertigten Blutgefäßes mit der Software automatisch zu identifizieren und die Außenseite manuell zu skizzieren. Auf dem Bildschirm wird ein Dickendiagramm angezeigt.Wiederholen Sie die Messung fünfmal, um eine zuverlässige Messung der Konstrukte zu erhalten. Erwägen Sie, zwei unabhängige Ermittler zu verwenden, die verpflichtet sind, Informationen zu erhalten. Öffnen Sie den Silikonstopfendeckel, der nach Demstrich der Kultur über den Bioreaktor gelegt wird, und verwerfen Sie das Kulturmedium.Lösen Sie das Polytetrafluorethylen von den Bioreaktorlippen und schneiden Sie die Silikonrohre von der Außenseite des Polytetrafluorethylens mit einer Schere. Ernten Sie die TEBVs aus dem Bioreaktor und schneiden Sie sie für eine Rasterelektronenmikroskopie-Untersuchung in Abschnitte. Ziehen Sie das unterstützende Silikonrohr heraus und fixieren Sie die Abschnitte mit 4 Prozent Leistungsformaldehyd.Führen Sie routinemäßige histologische Färbung mit Massons trichromem und sirious rot durch, um die Morphologie von Kollagen und PGA zu untersuchen. Um den PGA-Gehalt und die Kollagenkomponente zu bewerten, beobachten Sie histologische Proben mit sirious roten Färbungen durch ein polarisiertes Mikroskop. OCT-Bilder werden nach vier Wochen Kultur mit histopathologischen Funden von TEBVs verglichen.Das OCT-Bild zeigt kompakte Mikrostrukturen und spezifische Komponenten im Vergleich zur histologischen Bewertung. Das Kulturmedium, das Silikonrohr, das TEBV und das PGA-Fragment sind sichtbar. Massons trichrome Färbung zeigt Kollagenfasern, die in einer bestimmten Richtung verteilt sind, zusammen mit PGA-Resten in der Medienschicht der konstruierten Gefäße.Sirius rote Färbung zeigt PGA-Reste und eine Kollagenkomponente mit einem polarisierten Mikroskop. Rasterelektronenmikroskopie von technischen Gefäßen zeigt eine kompakte Mikrostruktur. In der Zwischenzeit nimmt diese intraluminale bildgebende Modalität eine zerstörungsfreie und einfache Überwachung von TEBVs an, einschließlich des Umbauprozesses und der visuellen Morphologie in situ in der lang andauernden Kultur.Wie hier gezeigt, erfolgt die Umgestaltung früher und die morphologischen Veränderungen manifestieren sich deutlicher in der dynamischen Gruppe durch den Vergleich der TEBV-Dicke. Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der Gefäßgewebetechnik den Weg, um Strukturmerkmale und den langfristigen Umbauprozess von technischen Gefäßen zu erforschen. Eine klare Darstellung von Polymerresten durch polarisierte Mikroskopie in Kombination mit OCT-Bildgebung könnte für die Beurteilung des Gerüstabbaus nützlich sein.

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Research

Forschung

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Bioengineering

Biotechnik

Unsere Gruppe hat einen Bioreaktor Kultur-System, das die physiologische pulsatile Belastungen des Herz-Kreislauf-System, um implantierbare kleinem Durchmesser Gefäßprothesen regenerieren imitiert entwickelt.

Engineering Biological-Based Gefäßprothesen Mit einem Pulsatile Bioreaktor

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