Zerstörungsfreie Überwachung der abbaubaren Gerüst-basierten Tissue-Engineering Blutgefäß Entwicklung mit optischen Kohärenztomographie

Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die zerstörungsfreie und langperiodischer Überwachung des Prozesses der vaskulären Umbau und Abbau Gerüst in Echtzeit-Kultur von biologisch abbaubaren Polymeren Gerüst-basierten Tissue-engineering Blutgefäße mit pulsatile stimulation mit der optischen Kohärenztomographie wird hier beschrieben.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Gefäßgewebe-Engineering zu beantworten, wie die Überwachung der Dynamik des Ingenieur-Gefäßwachstums und Umbau während der Langzeitkultur. Der Hauptvorteil der Verwendung der optischen Kohärenztomographie (OCT) besteht darin, dass es sich um eine leicht verfügbare, echtzeit- und zerstörungsfreie Bildgebungsstrategie handelt, um die strukturellen Merkmale und den Umbauprozess von technischen Gefäßen zu charakterisieren. Demonstriert wird das Verfahren auch von Shangmin Liu und Wentao Ma, Technikern aus meinem Labor.

Um dieses Verfahren zu beginnen, fertigen Sie das PGA-Gerüst, wie im Textprotokoll Dip PGA Gerüste in einem Mol-pro-Liter-Natriumhydroxid für eine Minute beschrieben, um die räumliche Struktur des Netzes einzustellen. Dann die Gerüste dreimal für jeweils zwei Minuten in gewebekulturtaugliches Wasser einweichen. Jedes Mal das Gerüst vorsichtig mit einem Tissuepapier trocknen.

Dann trocknen Sie die Gerüste in einer Haube mit einem Gebläse für eine Stunde aus. Um den Bioreaktor und die Y-Kreuzung für die OCT-Bildgebung zu montieren, können Sie zunächst den selbst entwickelten glaszylindrischen Bioreaktor, DIE PGA-Gerüste, die Silikonrohre, die biokompatiblen Rohre, die Steckverbinder, die Rührstange und die Ausrüstung für die Montage in einem 95-prozentigen Ethanoltank für zwei Stunden einweichen. Ziehen Sie das PGA-Gerüst durch die Seitenarme des Bioreaktors, die mit einem Stecker an einer Seite verbunden sind, sowie mit der Y-Kreuzung, mit der der OCT-Führungsdraht geliefert wird.

Montieren Sie ein weiteres PGA-Gerüst im Bioreaktor auf die gleiche Weise. Passen Sie das Polytetrafluorethylen an die Lippen des Bioreaktors an, indem Sie es mit 4-0 Nähten anziehen. Den Bioreaktor noch einmal für eine Stunde in den Ethanoltank geben, bevor man ihn über Nacht in einer Haube mit eingeschaltetem Gebläse trocknet.

Jetzt isolieren menschliche Nabelarterie glatte Muskelzellen aus menschlichen Nabelarterien durch Standard-Explantationstechniken In der Ursache der Rettung der Zellen in PGA-Gerüste, vermeiden Sie ein Tropfen der Zellsuspension auf den Boden des Bioreaktors. Bedecken Sie den Bioreaktor auch so schnell wie möglich nach dem Zellbestuhlung mit einem Silikon-Stopperdeckel, um eine Kontamination zu verhindern. Erweitern und pflegen Sie die Zellen in glatten Muskelwachstum Medium.

Säen Sie die menschlichen Nabelarterie glatte Muskelzellen mit einer Konzentration von 5 Millionen Zellen pro Milliliter im oben genannten Kulturmedium auf die PGA-Gerüste. Nachdem Sie einen Sir-Bar in den Bioreaktor platziert haben, bedecken Sie ihn mit dem Silikonstopfendeckel, der ein Zuführrohr und drei kurze Schlauchsegmente für den Gasaustausch enthält. Befestigen Sie PTFE 0,22 Mikron-Filter an jedem Luftwechselrohr und befestigen Sie eine Heparinkappe am Zuführrohr.

Stellen Sie die Rührstange mit einer Rührgeschwindigkeit von 13 Runden pro Minute ein. Dann montieren Sie den Glasbioreaktor, den Silikonstopfendeckel und das PGA-Gerüst in das Kultursystem. Lassen Sie die Zellen 45 Minuten haften, indem Sie den Bioreaktor alle 15 Minuten mit einem Ständer nach links und rechts lehnen.

Schließen Sie nun die LOO-OH-YEE Pumpe, den phosphatgepufferten Salinebeutel und den Treiber mit den biokompatiblen Rohren an, um das Überflusssystem zu erstellen. Öffnen Sie den Treiber, um die Rohre mit PBS zu füllen. Platzieren Sie den gesamten Bioreaktor in einem befeuchteten Inkubator mit 5 Prozent CO2 bei 37 Grad Celsius.

Füllen Sie die Kulturkammer mit 450 Millilitern des Kulturmediums. Die gesäten Gerüste unter statischer Kultur für eine Woche anbauen, das Kulturmedium alle drei bis vier Tage verändern, indem die Hälfte des alten Mediums durch das Zuführrohr angesaugt und der Reaktor mit einer entsprechenden Menge an frischem Kulturmedium nachgefüllt wird. Um das Profusionssystem für die OCT-Bildgebung vorzubereiten, pumpen Flüssigkeiten in den PBS-Beutel, um sie durch die biokompatiblen Schläuche und zurück in den Beutel zu zirkulieren.

Öffnen Sie die Leistung des Treibers und regulieren Sie die Pumpeneinstellung mit einer Frequenz von 60 Schlägen pro Minute und einem systemtolischen Ausgangsdruck von 120 Millimeter Quecksilber. Passen Sie die mechanischen Parameter an die Bedürfnisse der gewebetechnischen Gefäßkultur an. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, damit das Überflusssystem funktioniert.

Stellen Sie den Gefäßen drei Wochen lang die fixe pulsatile Simulation zur Verfügung, indem Sie die biokompatiblen Röhren nach einer Woche statischer Kultur iterativ unter Druck setzen. Verwenden Sie eine Lichtquelle, um die axiale Auflösung von zehn bis zwanzig Mikrometern und die Bildtiefe von ein bis zwei Millimetern zu gewährleisten, um die Struktur der gewebetechnischen Blutgefäße oder TEVBs basierend auf dem intravenkulären Bildgebungssystem OCT zu identifizieren. Schalten Sie den Netzschalter ein und öffnen Sie die Bildaufnahmesoftware Verbinden Sie den glasfaseroptischen Bildgebungskatheter mit der automatischen Rückzugsfunktion des Katheters an den Antriebsmotor und den optischen Controller.

Legen Sie die Parameter der Bildaufnahmerate auf zehn Bilder pro Sekunde fest, mit einer automatischen Rückziehgeschwindigkeit von zehn Millimetern pro Sekunde. Befestigen Sie nun den Bildkatheter über die Heparinkappe mit einer 18-Spur-Nadel an der y-Kreuzung. Legen Sie den Katheter in das Silikonrohr und identifizieren Sie die Strukturdichtheit des PGA-Netzes, bevor Sie das PGA-Gerüst auf den Bioreaktor laden.

Platzieren Sie nun die Katheterspitze über dem Interessengebiet. Passen Sie das Rückziehgerät an, und überprüfen Sie die Bildqualität. Erwerben Sie Bilder an einem, vier, sieben, zehn, 14, 17, 21 und 28 Tagen in Kultur für jede einzelne TEBV.

Speichern Sie diese Bilder sequenziell mit einer Echtzeitbeobachtung der TEBV-Mikrostruktur einschließlich Oberflächenmorphologie, interner Struktur und Zusammensetzung. Wiederholen Sie die Messung dreimal, um jedes Mal eine zuverlässige Messung der konstruierten Gefäße zu erhalten. Erfassen Sie eine Reihe von Bildern während des Tests mit der Bildaufnahme-Software.

Um die Bildanalysesoftware zur Messung der gewebetechnischen Wandstärke des Blutgefäßes zu verwenden, wählen Sie zunächst das zu analysierende Bild aus. Klicken Sie dann auf das Tracking-Tool, um die Innenseite des gewebegefertigten Blutgefäßes mit der Software automatisch zu identifizieren und die Außenseite manuell zu skizzieren. Auf dem Bildschirm wird ein Dickendiagramm angezeigt.

Wiederholen Sie die Messung fünfmal, um eine zuverlässige Messung der Konstrukte zu erhalten. Erwägen Sie, zwei unabhängige Ermittler zu verwenden, die verpflichtet sind, Informationen zu erhalten. Öffnen Sie den Silikonstopfendeckel, der nach Demstrich der Kultur über den Bioreaktor gelegt wird, und verwerfen Sie das Kulturmedium.

Lösen Sie das Polytetrafluorethylen von den Bioreaktorlippen und schneiden Sie die Silikonrohre von der Außenseite des Polytetrafluorethylens mit einer Schere. Ernten Sie die TEBVs aus dem Bioreaktor und schneiden Sie sie für eine Rasterelektronenmikroskopie-Untersuchung in Abschnitte. Ziehen Sie das unterstützende Silikonrohr heraus und fixieren Sie die Abschnitte mit 4 Prozent Leistungsformaldehyd.

Führen Sie routinemäßige histologische Färbung mit Massons trichromem und sirious rot durch, um die Morphologie von Kollagen und PGA zu untersuchen. Um den PGA-Gehalt und die Kollagenkomponente zu bewerten, beobachten Sie histologische Proben mit sirious roten Färbungen durch ein polarisiertes Mikroskop. OCT-Bilder werden nach vier Wochen Kultur mit histopathologischen Funden von TEBVs verglichen.

Das OCT-Bild zeigt kompakte Mikrostrukturen und spezifische Komponenten im Vergleich zur histologischen Bewertung. Das Kulturmedium, das Silikonrohr, das TEBV und das PGA-Fragment sind sichtbar. Massons trichrome Färbung zeigt Kollagenfasern, die in einer bestimmten Richtung verteilt sind, zusammen mit PGA-Resten in der Medienschicht der konstruierten Gefäße.

Sirius rote Färbung zeigt PGA-Reste und eine Kollagenkomponente mit einem polarisierten Mikroskop. Rasterelektronenmikroskopie von technischen Gefäßen zeigt eine kompakte Mikrostruktur. In der Zwischenzeit nimmt diese intraluminale bildgebende Modalität eine zerstörungsfreie und einfache Überwachung von TEBVs an, einschließlich des Umbauprozesses und der visuellen Morphologie in situ in der lang andauernden Kultur.

Wie hier gezeigt, erfolgt die Umgestaltung früher und die morphologischen Veränderungen manifestieren sich deutlicher in der dynamischen Gruppe durch den Vergleich der TEBV-Dicke. Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der Gefäßgewebetechnik den Weg, um Strukturmerkmale und den langfristigen Umbauprozess von technischen Gefäßen zu erforschen. Eine klare Darstellung von Polymerresten durch polarisierte Mikroskopie in Kombination mit OCT-Bildgebung könnte für die Beurteilung des Gerüstabbaus nützlich sein.