In-vitro- Differenzierung von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) Maus-Herstellung von T-Helferzellen (T_HGM)

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der CD4-T-Zellen zu beantworten, z. B. welche Untergruppe der T-Helferzellen die Hauptquelle für GM-CSF in der Pathogenese von Entzündungskrankheiten wie Multipler Sklerose ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie mehr als 50%GM-CSF-exprimierende T-Zellen aus naiven CD4-T-Zellen ohne oder nur wenige interferierende gamma OI17-Expressionszellen erzeugt, was eine wesentliche zelluläre Quelle für die Untersuchung der Regression und Funktion von THGM, einer neuen Untergruppe von T-Helferzellen, darstellt. Das Verfahren wird von Yi Lu, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert.

Beginnen Sie damit, die Haut einer sechs bis acht Wochen alten Maus mit einer Pinzette über den Bauch zu heben und einen etwa vier Zentimeter langen Schnitt unterhalb des Brustkorbs auf der linken Seite des Tieres zu machen. Öffnen Sie den Peritonealsack, um die Milz freizulegen, und übertragen Sie die Milz mit einer sterilen Pinzette auf ein 70-Mikrometer-Sieb, das mit zwei Millilitern Zellisolationspuffer vorgetränkt ist. Wenn zwei bis drei Milz entnommen wurden, mazerieren Sie mit dem Ende einer Fünf-Milliliter-Spritze das Milzgewebe und spülen Sie das Sieb mehrmals mit ein bis zwei Millilitern Zellisolationspuffer aus, bis alle Zellen in das Röhrchen gespült wurden.

Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern Ammoniumchlorid-Kalium-Lysepuffer mit vier Grad Celsius. Nach zwei Minuten schonenden Mischens stoppen Sie die Lyse mit 10 Millilitern vollständigem RPMI-Medium und zentrifugieren Sie die Zellen sofort. Um die CD4-positiven T-Zellen zu isolieren, resuspendieren Sie das Pellet der weißen Blutkörperchen in fünf Millilitern Zellisolationspuffer und filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 30-Mikrometer-Sieb in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen, um alle Ablagerungen zu entfernen.

Nach der Zählung resuspendieren Sie die Zellen einmalig 10 bis zu den siebten Zellen pro 90 Mikroliter Pufferkonzentration und fügen Sie 10 Mikroliter anti-CD4-konjugierte magnetische Kügelchen pro einmal 10 zu den siebten Zellen für eine 15-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius hinzu, wobei alle fünf Minuten gemischt wird. Während die Zellen inkubieren, stellen Sie eine Trennsäule auf einen Magnetständer und befeuchten Sie die Säule mit zwei Millilitern Puffer. Waschen Sie dann die Zellen mit fünf Millilitern Puffer und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Puffer.

Laden Sie die Probe auf die Säule und sammeln Sie die negative CD4-Fraktion in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen. Wenn alle Zellen die Säule durchlaufen haben, waschen Sie das Reservoir dreimal mit einem Milliliter Puffer pro Waschgang, bevor es trocknet. Füllen Sie die Säule nach dem letzten Waschen in ein neues konisches 15-Milliliter-Röhrchen und tauchen Sie die Säule mit zwei Millilitern Zellisolationspuffer ein, um die positive Bead-Fraktion auszustoßen.

Sammeln Sie dann die CD4-positiven Zellen durch Zentrifugation. Für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung der naiven T-Zellen resuspendiert man das bead-sortierte CD4-positive Zellpellet in 500 Mikroliter Puffer und mischt die Zellen mit einem entsprechenden fluoreszenzkonjugierten Antikörpercocktail an. Nach 20 bis 30 Minuten auf lichtgeschütztem Eis waschen Sie die Zellen in fünf Millilitern frischem Puffer und resuspendieren das Pellet in 500 Mikrolitern frischem Puffer

Filtern Sie die Zellen durch ein Nylonnetz und geben Sie die Zellen in ein FACS-Rohr, das mit 500 Mikrolitern Puffer vorbeschichtet ist. Gate zur Selektion der CD4-positiven, CD25-negativen und CD44-Liganden mit hohen CD62-Liganden. Sortieren Sie dann die naiven CD4-positiven CD25-negativen CD44-Liganden mit hohem CD62-Ligand und hohem T-Zell-Gehalt in ein neues 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und pelletieren Sie die isolierten naiven CD4-positiven T-Zellen durch Zentrifugation.

Für die Differenzierung von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor oder GM-CSF T-Helferzellen resuspendieren Sie die sortierten T-Zellen in einer Konzentration von einmalig 10 bis sechs Zellen pro Milliliter in vollständigem RPMI-Medium, das 50 mikromolare Beta-Mercaptoethanol enthält, und aspirieren Sie den Anti-CD3-Epsilon-Antikörper aus jeder Vertiefung einer vorbeschichteten 48-Well-Platte. Säen Sie dann 2,5 mal 10 bis fünfte Zellen zusammen mit IL7, Anti-CD28 und Anti-IFN-Gamma in jede Vertiefung aus und inkubieren Sie die Zellen drei Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Verwenden Sie am dritten Tag der Kultur ein Mikroskop, um die Zelldifferenzierung zu überprüfen und die Zellen für die Zentrifugation zu ernten.

Resuspendieren Sie das Pellet zwei Wäschen lang in frischem vollständigem RPMI-Medium und resuspendieren Sie die Zellen nach dem zweiten Waschen zum Zählen in einem Milliliter frischem vollständigem Medium. Teilen Sie die Zellen in drei gleich große Volumina auf und stimulieren Sie das erste Aliquot der Zellen mit PMA und Ionomycin in Gegenwart eines Proteintransporthemmers für vier bis sechs Stunden. Am Ende der Stimulation ernten Sie die Zellen für die Färbung mit Anti-CD4-Antikörpern.

Nach 30 Minuten fixieren Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern Fixierungspuffer für 20 bis 60 Minuten, gefolgt von zwei Waschgängen in einem Milliliter Permeabilisierungspuffer pro Waschgang. Färben Sie dann 30 Minuten lang im Dunkeln auf intrazelluläre Zytokinexpression. Für die quantitative PCR-Analyse der differenzierten Zellzytokin-Genexpression aktivieren Sie die Zellen drei Stunden lang mit plattengebundenem Anti-CD3-Epsilon.

Verwenden Sie dann ein Reagenz zur Phenol-RNA-Extraktion, um die Gesamt-RNA zu isolieren und die cDNA-Vorbereitung für die quantitative PCR zu ermöglichen. Um die Zytokinsekretion durch die differenzierten Zellen zu beurteilen, stimulieren Sie die Zellen 24 Stunden lang erneut mit plattengebundenem Anti-CD3-Epsilon und analysieren Sie die Kulturüberstände auf IL17 und GM-CSF mittels ELISA. Etwa 55% der Zellen, die unter GM-CSF-T-Helferzell-Differenzierungsbedingungen kultiviert wurden, exprimierten GM-CSF, während nur etwa 2% der Zellen, die unter T-Helfer-17-Bedingungen differenziert wurden, dieses Zytokin exprimierten.

Im Vergleich zu den Differenzierungsbedingungen von T-Helfer 17, die zu einer IL17-Produktion von etwa 8% der Zellen führen, induzierten die Differenzierungsbedingungen der GM-CSF-T-Helferzellen die IL17-Expression nur in etwa 1% der Zellen. Bemerkenswert ist, dass nur ein Bruchteil der Zellen unter beiden Kulturbedingungen IFN gamma oder IL4 exprimiert. GM-CSF T-Helfer differenzierte Zellen zeigen eine signifikant höhere Expression von CSF2 mRNA, aber eine deutlich geringere Expression von IL17 im Vergleich zu den T-Helfer 17 Zellen.

Dies korreliert mit der GM-CSF-Proteinexpression, die in Kulturüberständen von T-Helfern GM-CSF und T-Helfer 17 Zellen beobachtet wurde, mit der dreifachen Konzentration des Zytokins, die in T-Helfern GM-CSF Zellkulturen nachgewiesen wurde, und überhaupt keinem messbaren IL17. T-Helfer-GM-CSF-Zellen weisen auch eine etwas geringere Expression von Rorc, eine höhere Stat5-Expression und eine etwas geringere Expression von Stat3 auf als T-Helfer-17-Zellen, was darauf hindeutet, dass die Differenzierung von T-Helferzellen GM-CSF und IL17 zwar von unterschiedlichen Transkriptionsfaktoren bestimmt wird, sie jedoch einige gemeinsame Merkmale aufweisen können. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, alle Schritte in der biologischen Sicherheitswerkbank durchzuführen, um die Zellen und die Reagenzien steril zu halten.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die Transkriptomanalyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. welche wichtigen Gene von THGM-Zellen exprimiert werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Immunologie, um zu erforschen, wie aus T-Zellen gewonnene GM-CSF zu Entzündungen bei Nagetieren beiträgt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Beta-Mercaptoethanol und RNA-Extraktionsreagenzien äußerst gefährlich sein kann und bei der Verwendung dieser Reagenzien immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung von Abzügen getroffen werden sollten.