Charakterisierung der MLKL-vermittelten Plasmamembran Bruch in Necroptosis

Diese Methoden können dazu beitragen, Schlüsselfragen zur Rolle der Pseudokinase-Mischlinien-Kinase-Domäne (MLKL) bei der Nekroptose zu beantworten, wie z. B. Membrantranslokation und Permeabilisierung bei der Lipidbindung. Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, dass sie MLKL direkt als Vollstrecker der Plasmamembranruptur bei Nekroptose einbeziehen. Die Bildgebung von lebenden Zellen hat das Gebiet der Zelltodforschung revolutioniert, insbesondere bei der MLKL-vermittelten Nekroptose.

Die Kernspinresonanz ist eine leistungsfähige Technik zur Überwachung der Lipidbindung an Proteine, wie hier für MLKL gezeigt. Beginnen Sie mit der Plattierung von fünf mal 10 auf die vierte MLKL-Knockout-Maus: embryonale Fibroblasten oder MEFs, die die Executioner-Domäne von MLKL exprimieren, fusioniert mit einer Oligomerisierungskassette und Venus in einem Milliliter supplementiertem DMEM in 24-Well-Platten für ihre Inkubation über Nacht in einem Zellkultur-Inkubator. Am nächsten Morgen behandeln Sie die Zellen 12 Stunden lang mit Doxycyclin, um die Expression des Transgens zu induzieren, gefolgt von der Zugabe von Standard-DMEM, ergänzt mit FK506-bindendem Proteindimerizer und membranundurchlässigem grünem Fluoreszenzfarbstoff, um Nekroptose zu induzieren.

Um den Zelltod zu überwachen, legen Sie die Platte in eine geeignete Bildgebungseinheit, die in einem Inkubator für Säugetiergewebekulturen untergebracht ist, und öffnen Sie die Software des Bildgebungssystems. Wählen Sie die Registerkarte "Anstehende Scans planen" und wählen Sie auf der Registerkarte "Physisches Layout" das Fach, das Gefäß, die Scan-Typen und das Scan-Muster aus. Wählen Sie auf der Registerkarte Eigenschaften die Option Schnelle Fluoreszenz und klicken Sie auf das Zeitleistenfenster und die Gesamtzahl der Zeitpunkte und die Häufigkeit der Erfassung, um die Scanzeit hinzuzufügen.

Klicken Sie dann auf Anwenden, um die Bildaufnahme zu starten. Um die Nekrottosis zu quantifizieren, wählen Sie den Aufgabenbereich und bewegen Sie den Mauszeiger über den Hintergrund mehrerer Bilder, um die neue Analyse der Objektzählung mit einem festen Segmentierungsschwellenwert über der Hintergrundebene festzulegen. Wählen Sie dann Vorschau aus, um die fluoreszierenden Objekte im aktuellen Bild zu untersuchen und die Schwellenwerte nach Bedarf zu verfeinern.

Eine sorgfältige Auswahl des Schwellenwerts kann durch Beobachtung mehrerer Vertiefungen auf der Platte und mithilfe der Vorschaufunktion in der Software durchgeführt werden. Achten Sie nur darauf, dass Sie für alle Vertiefungen in der Platte dieselbe Schwellenwerteinstellung verwenden. Um die grünen Fluoreszenzzählungen zu integrieren, wählen Sie auf der Registerkarte Neue Analyse starten den Zeitraum und die zu analysierenden Wells aus und geben Sie den Namen des Analyseauftrags ein.

Klicken Sie dann auf OK und doppelklicken Sie auf den Auftragsnamen, um die Daten für eine weitere Analyse in einem geeigneten Grafiksoftwareprogramm zu exportieren. Für die Lipidbindung des MLKL mittels Kernspinresonanzspektroskopie oder NMR aliquotieren Sie mit luftdichten Spritzen ein Milligramm pro Milliliter der interessierenden Phospholipide in saubere Glasfläschchen für einzelne NMR-Titrationsserien und halten Sie die Fläschchen fünf bis 30 Minuten lang unter einen gasförmigen Strom aus Argon oder Stickstoff. Die Dosierung von Lipiden aus flüchtigen Lösungsmitteln wie Chloroform oder Methanol muss schnell aus Lagerbeständen erfolgen, die auf Trockeneis aufbewahrt werden, um Inkonsistenzen in den Lipidkonzentrationen zwischen den Proben aufgrund von Lösungsmittelverdunstung zu minimieren.

Am Ende der Verdunstungszeit ordnen Sie die Fläschchen mit einer großen Pinzette am Boden eines Buchner-Kolbens an. Verschließen Sie den Kolben mit einem Gummistopfen und befestigen Sie einen Kunststoffschlauch, der an eine Vakuumleitung angeschlossen ist, um den Inhalt des Fläschchens über Nacht unter leichtem Vakuum zu evakuieren und alle organischen Rückstände zu entfernen. Geben Sie am nächsten Morgen NMR-Puffer, der mit Reinigungsmittel in der entsprechenden experimentellen Konzentration ergänzt ist, in jedes Glasfläschchen mit einem Lipidfilm und beschallen Sie das Fläschchen in einem Wasserbad bis zu 30 Minuten lang, wobei Sie die Beschallung alle 10 Minuten unterbrechen, um die Solubilisierung des Lipidfilms zu überprüfen.

Lassen Sie die Fläschchen am Ende der Beschallung 15 Minuten lang abkühlen und führen Sie eine serielle Verdünnung der Lipid-Detergenz-Mizellen in Detergenzien-positivem NMR-Puffer durch, wobei die Mischungen 1:1 für die gewünschte Konzentrationsreihe beschallt werden. Bereiten Sie Kontroll- und Referenz-NMR-Proben von Proteinen und Zusatzstoffen in Detergenzien-negativen bzw. Detergenzi-positiven NMR-Puffern vor und fügen Sie jeder Lipidverdünnung in Detergenzien-positivem Puffer Protein und Zusatzstoffe hinzu. Übertragen Sie dann das entsprechende Probenvolumen in NMR-Röhrchen geeigneter Größe und laden Sie die Proben auf das NMR-Gerät.

Eine vollständige Nekroptose von MLKL-Knockout-MEFs kann innerhalb einer Stunde nach der Dimer-vermittelten Oligomerisierung von Doxycyclin-vorinkubierten Zellen beobachtet werden, die das fusionierte Transgen exprimieren. Diese schnelle kinetische Nekroptose unterstützt die Rolle von MLKL als mutmaßlicher Vollstrecker der Plasmamembranruptur, was zur Produktion von Plasmamembran-assoziierten Venus puncta innerhalb von ein bis zwei Minuten nach der Behandlung führt, wobei die Dimer- und Venuscodierung der Zellperipherie und eine allmähliche Zellrundung innerhalb von zwei bis drei Minuten zur Folge haben. Unter schneller Nekroptose ändern die Zellen ihre Morphologie innerhalb von fünf Minuten nach der Oligomerisierung von ihrer normalen länglichen Form zu abgerundet und geschwollen, nach 10 Minuten teilweise gerissen und nach 20 Minuten mit verschwundenem Zytosol weitgehend abgebaut.

In-vitro-Lipidbindungsexperimente, die durch NMR-Spektroskopie überwacht wurden, zeigen große strukturelle Veränderungen im MLKL-Executioner-Domänenprotein bei der Lipidbindung, um die inhibitorische Klammerregion von der geschlossenen N-Helix zur offenen und intrinsisch ungeordneten Konformation zu verdrängen, sowie Informationen pro Rest über Mischungen beider Konformere. Der prozentuale Anteil geschlossener und offener Konformere in einer gegebenen Probe kann ebenfalls überwacht werden, was einen unterstützenden Beweis für die Interaktion der MLKL-Henkerdomäne mit Phospholipiden liefert und auf eine direkte Verbindung zwischen MLKL und der Plasmamembran hindeutet. Bei dem Versuch, den Zelltod mit diesem Verfahren zu quantifizieren, ist es wichtig zu wissen und sich daran zu erinnern, dass der DNA-bindende Farbstoff eine höhere Fluoreszenzschwelle aufweist als normalerweise genetisch kodierendes Fluoreszenzprotein.

Aus diesem Grund können sie parallel verwendet werden. Beachten Sie auch, dass mizellare Lipide temperaturempfindlich sind und daher die Temperatur der NMR-Probe möglicherweise optimiert werden muss. Nach diesem Verfahren könnten also andere Techniken wie die Totalreflexionsmikroskopie und die Elektromikroskopie verwendet werden, um zu untersuchen, wie schnell der Zellbruch bei Zellen erfolgt, die sich einer Nekroptose unterziehen, und wo der Bruch auf der Plasmamembran lokalisiert ist.

Darüber hinaus kann eine mikroskalige Thermophorese durchgeführt werden, um die MLKL-Bindung an mizellare Lipide orthogonal zu validieren. Die in diesem Video beschriebenen Techniken ebneten den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Nekroptose, um die Rolle von MLKL als Vollstrecker des Plasmamembranbruchs zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Chloroform äußerst gefährlich sein kann und dass bei diesem Verfahren immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen und das Arbeiten in einem gut belüfteten Bereich getroffen werden sollten.