Name: Charakterisierung der MLKL-vermittelten Plasmamembran Bruch in Necroptosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Erfahren Sie Methoden zur Charakterisierung der MLKL-vermittelten Plasmamembranruptur während der Nekroptose mittels Live-Zell-Mikroskopie, Rasterelektronenmikroskopie und NMR-basierter Lipidbindungsanalyse.

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1. Klonen und Zell-Linie-Generation
<ol><li>PCR verstärken die BNB-Region entspricht Aminosäurereste 1-140 (BNB140), von menschlichen MLKL cDNA für Rahmen standard Restriktionsenzym-basierte Klonen mit Oligomerisierung Domäne 2 x FK506-bindendes Protein (2xFKBP oder 2xFV) und Venus Leuchtstofflampen Protein in Doxycyclin (Dox) - induzierbaren retroviral Vektor pRetroX-TRE3G, BNB140zu erhalten - 2xFV-Venus (Tabelle 1, Figuren 1A-B).</li>
	<li>Primäre Mlkl- /- oder ripk3- / - Mlkl- / - Maus embryonale Fibroblasten (MEFs) erhalten aus den jeweiligen Mäusen, die in das grüne Labor durch Transiente Transfektion mit SV40-große Antigen zu verewigen mit dem Ausdruck Plasmid. Wählen Sie Zellen aus verewigt in ~ 1 – 2 Wochen, und pflegen in DMEM mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 U/mL Penicillin und Streptomycin, 1 mM Natrium Pyruvat und unwesentlichen Aminosäuren bei 37 ° C und 5 % CO2 im standard Gewebe ergänzt Kultur-Inkubatoren.</li>
	<li>Transduzieren SV40 verewigt Mlkl- / - MEFs mit umgekehrter Tetracyclin kontrollierte transaktivator (RtTA)-enthält Retrovirus von ein Plasmid enthält die Blasticidin-Resistenz-Gen (unsere modifizierte Plasmid) ausgedrückt und Leckerbissen für 1 Woche mit 5 μg/mL Blasticidin für stabil auszudrücken RtTA28Zellen auswählen.</li>
	<li>Transduzieren RtTA exprimierenden MEFs mit Dox-induzierbaren retroviralen Vektors mit der Chimäre MLKL (pRetroX-NBB140-2xFV-Venus-Puro) und wählen Sie mit 4 μg/mL Puromycin für 1 Woche, 2 Tage nach Transduktion.</li>
</ol>2. live-Cell-Mikroskopie-Bildgebung des MLKL-vermittelten Necroptosis
<ol><li>Platte, Mlkl- / - MEFs Ausdruck BNB140-2xFV-Venus bei einer Dichte von 50.000 Zellen pro Bohrloch (1 mL/na) in 24 auch Platten, und über Nacht inkubieren (Abb. 2A). Verwenden Sie Leben-Zelle Färbung für automatisierte Zellzählung (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Zellen für 12 h mit Dox zu behandeln (0,5 μg/mL) induzieren die Expression von BNB140-2xFV-Venus.</li>
	<li>Induzieren Necroptosis mit 25 nM FKBP Dimerizer (Dim) zusätzlich 25 nM Membran undurchlässig grün fluoreszierenden Farbstoff (siehe Tabelle der Materialien) in standard DMEM (siehe 1.2). Zellen Necroptosis akkumulieren den Farbstoff wie ihre Plasmamembran Integrität von BNB140kompromittiert-vermittelte riss. Führen Sie Tests in dreifacher Ausfertigung oder vervierfacht.</li>
	<li>Zur Überwachung der Necroptosis mit einfarbigen oder Dual bildgebende Systeme (siehe Tabelle der Materialien), legen Sie die Schiffe in die jeweiligen Belichtungseinheit, untergebracht in einem Säugetier Gewebekultur-Inkubator.</li>
	<li>Öffnen Sie die Software (siehe Tabelle der Materialien) und wählen Sie die Registerkarte Zeitplan kommenden scannt unter der Aufgabenliste. Hinweis: dieses Protokoll ist für die Bildgebung mit einfarbigen Systemen, aber eine ähnliche Software ist für zwei-Farben-Systeme verfügbar.</li>
	<li>Wählen Sie das "Fach, Schiff, Scantypen", und "Scan-Pattern" in der Registerkarte "Physische Layout" und "Schnell Fluoreszenz" in der Registerkarte "Eigenschaften".</li>
	<li>Fügen Sie die "Scan Zeit" durch Klicken auf das Fenster "Zeitachse" und die Gesamtzahl von Zeitpunkten und Frequenz des Erwerbs (in der Regel 1 Übernahme jeweils 0,5 h bis 1 h 6 h bis 12 h lang alle 5 min für schnelle Kinetik Necroptosis) und wählen Sie "App zunächst Bildaufnahme Ly"(roter Knopf).</li>
	<li>Necroptosis mit der Bildanalyse-Software zu quantifizieren (siehe Tabelle der Materialien) durch Auswahl aus den "Aufgabenbereich", "Counting neue Analyse von Objekten mit festen Segmentierung Schwellenwert über der Hintergrund-Ebene", die ermittelt werden, indem Sie den Cursor der Mauszeiger über Hintergrund Regionen in mehreren Bildern in der Analyse verwendet.</li>
	<li>Prüfen Sie fluoreszierende Objekte durch Auswahl mit aktuellen Bild Vorschau und verfeinern Sie die Schwellenwerte nach Bedarf.</li>
	<li>Integrieren Sie grüne Fluoreszenz zählt durch Öffnen der Registerkarte "Neue Analyse starten" zu, wählen Sie den "Zeitbereich", die Brunnen analysiert werden, geben den Auftragsnamen"Analyse", und drücken "OK".</li>
	<li>Zugang analysiert Daten aus der Registerkarte "Analyse Aufträge" durch einen Doppelklick auf den Namen des jeweiligen Auftrags und aus dem Diagramm/Export-Fenster für die weitere Analyse in externen Grafik-Software exportieren (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Quantitate Daten als grüne Fluoreszenz positiv (+ Ve) zählt/mm2 oder normalisieren die Grafen von Confluence und drücken die Daten als grüne Fluoreszenz + Ve zählt/Zusammenfluss.</li>
	<li>Optional am experimentellen Endpunkt Beflecken Zellen mit 100 nM die Membran-permeationsfähigen grün fluoreszierenden Farbstoff (siehe Tabelle der Materialien). Daten auf % Necroptotic Zellen als das Verhältnis der grünen Fluoreszenz/grüne Fluoreszenz am Endpunkt zu normalisieren.</li>
</ol>3. live-Zelle konfokalen Mikroskopie Bildgebung der Plasmamembran Rekrutierung und Permeabilisierung von MLKL
<ol><li>Platte, Mlkl- / - MEFs Ausdruck BNB140-2xFV-Venus bei einer Dichte von 20.000 Zellen pro Bohrloch (0,5 mL/na) in einem Glas unten 4-Well Mikroskopie Kammer vorbehandelt mit 50 µg/mL Fibronektin in PBS bei 37 ° C für 30 min und ~ 12 h ( inkubieren Abbildung 2B).</li>
	<li>Behandlung der Zellen mit Dox (0,5 μg/mL) für ~ 12 h induzieren die Expression von BNB140-2xFV-Venus.</li>
	<li>Induzieren Necroptosis durch Inkubation mit frischem Medium (1 mL/na) mit 25 nM Dim induzieren BNB140-2xFV-Venus-Aktivierung und Translokation in der Plasmamembran.</li>
	<li>Legen Sie die Kammer auf eine drehenden Scheibe Laserscanning confocal Mikroskop gebaut auf einem umgekehrten Stand ausgestattet mit Umweltkontrolle und ein 63 1,4 NA Ziel und imaging-Erwerb mit Software der Wahl beginnen (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Initialisieren der Software, wählen Sie "Focus" Symbol und YFP Filterkonfiguration (Erregung Wellenlänge 515 nm).</li>
	<li>Suchen Sie das Sichtfeld und die Brennebene und engagieren Sie das Wartung-System mithilfe der Registerkarte "Definitive Fokus" zu.</li>
	<li>Um Übernahme zu beginnen, die Registerkarte "Capture" gefolgt von Zuordnung der Filterkonfiguration, geeignete EMCCD Kamera Belichtung Zeit und Intensivierung Verstärkung und Zeitraffer Aufnahmeparameter einschließlich Intervall und Länge des Erwerbs.</li>
	<li>Zelluläre Umverteilung der fluoreszierenden BNB140zu überwachen-2xFV-Venus-Protein während der Necroptosis durch den Erwerb von Bilder alle 10 s mit einer EMCCD Kamera mit einem 515 nm Laser (Film 1). Hinweis: Immunofluoreszenz geht mit fluoreszierenden Proteins Bildgebung. Venus ist eines der widerstandsfähiger fluoreszierende Proteine Immunofluoreszenz29. Fluoreszierende Proteine, anfälliger für Immunofluoreszenz sind, verwendet, Bild alle 30 s oder länger, um die Wiederherstellung des Signals zwischen bildgebenden Zeitpunkten ermöglichen.</li>
	<li>Plasmamembran Verband der BNB140überwachen-2xFV-Venus während Necroptosis, Bild alle 10 s die Probe vorbereitet in 3.3 durch Totalreflexion Fluoreszenz (TIRF) Mikroskopie unter Verwendung eines Mikroskops, ausgestattet mit einer automatisierten TIRF-Slider und eine 100 x 1,4 NA Ziel und einer EMCCD Kamera (Film 2). Führen Sie die Schritte 3,5 – 3,7, aber passen Sie den Winkel der TIRF innerhalb der TIRF Fokus Registerkarte nach Probe und unten Glasstärke der Mikroskopie Kammer. Hinweis: Plasmamembran Markierungen wie LCK-C-RFP können als Steuerelemente für die Plasmamembran Lokalisierung in TIRF Analyse verwendet werden.</li>
	<li>Durchführen Sie Bildverarbeitung zur Verbesserung der Qualität durch Faltung mit der negativen normalisierte zweite Ableitung einer Gaußschen Funktion (Marr Algorithmus).</li>
</ol>(4) Elektronenmikroskopie
<ol><li>Platte, Mlkl- / - MEFs Ausdruck BNB140-2xFV-Venus bei einer Dichte von 5 Millionen Zellen in einem Plasma beschichtet 150 mm Zelle Kulturschale und inkubieren Sie für 12 h (Abbildung 3).</li>
	<li>Behandlung der Zellen mit Doxycyclin (0,5 μg/mL) induzieren die Expression von NB1-140-2xFV-Venus für 12 h.</li>
	<li>Induzieren BNB140-2xFV-Venus-Aktivierung und Translokation in der Plasmamembran mit 25 nM Homodimerizer für 5 Minuten. Diesmal wird aus der Kinetik der Necroptosis beobachtet in live Cell Imaging gegründet.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium und beheben Zellen mit 10 mL 2,5 % Glutaraldehyd, 2 % Paraformaldehyd in 0,1 M Natrium Cacodylate Puffer pH 7,4 (Cacodylate Puffer) bei 37 ° c vorgewärmt zu</li>
	<li>Sammeln der Probenmaterials durch Schaben und Spinnen die Proben 10 min bei 500 X g. Verwerfen Sie den überstand.</li>
	<li>Postfix die Probe für 1,5 h in reduzierten 2 % Osmium ausgefällt mit 1,5 % Kaliumferrocyanid in 0,1 M Natrium Cacodylate Puffer. Osmium ausgefällt ist eine Färbung Agent in TEM Kontrast am meisten benutzt. Wir benutzten TEM als vorläufige Analyse vor SEM der Zelle Necroptosis unterziehen.</li>
	<li>Spülen Sie die Probe 5 Mal in Reinstwasser für 5 min bei 500 X g, gefolgt von Spülungen im Puffer (siehe 4.6), Wasser und Ethanol auf eine automatische Prozessor. Verwerfen Sie den überstand.</li>
	<li>Für die SEM Fleck vorher festen Proben mit 1 % Uranyl Acetat und Blei Aspartat-Schwermetall Fleck31.</li>
	<li>Die Proben durch eine abgestufte Reihe von Alkohol und Propylen oxid Lösungen zu entwässern.</li>
	<li>Einbetten der Probenmaterials in harten Harz32 , einen Harz-Block zu erhalten.</li>
	<li>Schneiden Sie dicke Schichten von 0,5 μm zu bestimmen, den richtigen Bereich der Analyse.</li>
	<li>Bestreichen Sie die Proben mit einem hauchdünnen Film von elektrisch leitfähigen Metall (Iridium).</li>
	<li>Image und analysieren die Proben (Abbildung 3). Für die Quantifizierung, ein Low-Vergrößerung Bild der Block Harzoberfläche mit exponierten Zellen wird gescannt, bei 5 keV mit einem Elektronenmikroskop.</li>
	<li>Zellen in einzelne Bilder von SEM zu visualisieren oder imaging-Software genutzt werden kann, um mehrere Felder-of-View in einem zusammenhängenden Bild30beitreten. Etwa 100 Zellen verwendet werden, um den Bruch der Zellen in der Necroptosis auf diese Weise durch die Erzeugung einer hochauflösenden Montage im Software der Wahl zu bewerten (siehe Tabelle der Materialien). Hinweis: Scoring nekrotische Morphologie von SEM normale Zelle Funktionen mit dem Fortschreiten der Pre-nekrotische oder nekrotischen Phänotypen vergleicht. Zu diesen Features gehören Plasmamembran Änderungen einschließlich Mikrovilli verschwinden, Abflachung, Brüche in den Zellen von 10 nm bis 1 µm Größe oder Verlust der Organelle Struktur über mindestens 30 – 40 % der cytosolischen Zellbereich.</li>
</ol>(5) Lipid-Bindung des MLKL durch Kernresonanzspektroskopie (NMR)
<ol><li>15N beschriftet BNB1-156 von standard Protein-Expression und Reinigung wie oben beschrieben24vorzubereiten.</li>
	<li>Auflösen von 500 µg 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol Ammoniumsalz (18:0 PI) und 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) Ammoniumsalz (18:1 PI) in 500 µL des eiskalten Kchl3 jeweils für Endkonzentrationen von 1 mg/mL.</li>
	<li>1 mg/mL 18:0 und 18:1 PI im Wasserbad Beschallung für 1 min bei Raumtemperatur beschallen oder bis zu 5 min in ein Eis-Wasser-Gemisch.</li>
	<li>
Aliquoten 1 mg/mL 18:0 und 18:1 PI in sauberes glasvials für individuelle NMR Titration Serie (Abbildung 4). Transfer-Lipide in organischen Lösungsmitteln mit luftdichten Glas Spritzen.
	<ol>
<li>Aliquoten 132 µL 1 mg/mL 18:1 PI (molare Masse = 880.137 g/Mol) in Kchl3 für eine endgültige Wiederfreisetzung Volumen von 1.200 µL bei 125 µM Konzentration. Hinweis: Für 5 mm NMR Röhrchen, bereiten Sie serielle Verdünnung Mengen von > 1.000 µL und endgültige NMR probieren Sie Mengen von > 500 µL. Vorbereitung 3 mm NMR Röhrchen, serielle Verdünnung Datenmengen > 300 µL und endgültige NMR probieren Sie Mengen von > 150 µL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aliquoten 1 mg/mL porcinen Gehirn L-α-Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate Ammoniumsalz in 20:9:1 Kchl3/MeOH/H2O (Gehirn PI (4,5) P2) in saubere Glasflaschen.</li>
	<li>Stellen Sie Fläschchen unter einem gasförmigen Strom von Argon (Ar) oder Stickstoff (N2) mit mäßiger Strömung organisches Lösungsmittel verdunsten ohne zu spritzen gegen die Glaswände Fläschchen. 5 bis 30 min ist in der Regel ausreichend für Volumina von 10 bis 200 µL organischen Lösungsmittel.</li>
	<li>Ordnen Sie Glas Ampulle(n) auf Grund einer Büchner oder große Pinzette Isolierflasche mit Gummistopfen verschließen und befestigen Sie Kunststoffschlauch mit einer Vakuumleitung verbunden. Evakuieren Sie Kolben unter milden Vakuum über Nacht, verbleibende organische Stoffe zu entfernen.</li>
	<li>Lipid-Film-Aliquote mit Inertgas überlagert, mit einem luftdichten Deckel verschließen und bei-20 ° C für den Einsatz innerhalb eines Monats oder-80 ° C für die längerfristige Lagerung lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie NMR Probe Puffer ohne Waschmittel (-Det) mit 20 mM NaXHyPO4 pH 6,8, 10 % D2O und Waschmittel (+ Det) mit 20 mM NaXHyPO4 pH 6,8, 10 % D2O, 0,34 mM n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM).</li>
	<li>Hinzufügen + Det Puffer Glasfläschchen mit Lipid-Film auf gewünschte Konzentration zu erreichen und im Wasserbad für bis zu 30 min, abwechselnd Beschallung für 10 min beschallen gefolgt durch Sichtkontrolle. Hinweis: Beschallung kann Probe warm. Raumtemperatur für 15 min vor der endgültigen Protein Probe Rekonstitution abkühlen lassen.</li>
	<li>Führen Sie serielle Verdünnung der Lipid-Reinigungsmittel-Mizellen in + Det Puffer mit Beschallung von 1:1 Mischungen für die gewünschte Konzentration-Serie. Ab 125 µM Lipidkonzentration, werden drei Wiederholungen 62,5 µM, 31,3 µM und 15,6 µM Lipid in 0,34 mM DDM ergeben.</li>
	<li>Bereiten Sie Kontrolle und NMR-Proben von Protein und Zusatzstoffe in - Det zu verweisen und + Det Puffer, beziehungsweise. Protein und Additive zu jeder Verdünnung der Lipid in + Det Puffer hinzufügen. Hinweis: Für 15N BNB156, Protein ist hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 40 µM und ergänzt mit 2 mM deuterierter Dithiothreitol, Cys Rückstände reduziert zu halten.</li>
	<li>Übertragen Sie das entsprechende Volumen der Proben auf 5 mm oder 3 mm NMR Röhrchen (siehe Hinweis im Schritt 5.4).</li>
	<li>Manuell laden Sie Proben in NMR-Gerät oder in ein Automatisierungs-Plattform wie der SampleCase Loader vereinbaren.</li>
	<li>Zusammengesetzte NMR-Spektren mit standard Puls-Programme für 1H Proton Spektren als Qualitätskontrolle gefolgt von 2D 1H -15N Korrelation Spektren entweder als transversale Entspannung optimiert Spektroskopie (TROSY) zu erwerben oder Heteronuclear mehrere Quantum Kohärenz (SOFAST-HMQC)33. Hinweis: Verwendung von 3 mm NMR Röhrchen erfordert 64 Scans für 1 H -15N TROSY (~ 3 h) oder 1H -15N SOFAST-HMQC (~ 90 min). Scan-Nummern sind für 5 mm NMR Röhrchen halbiert.</li>
	<li>Verarbeitete 2D NMR-Spektren können eine CARA Repository34 zur Analyse oder anderer Software der Wahl für den Benutzer hinzugefügt werden.</li>
	<li>
Analysieren Sie Software, indem Sie kommentieren 2D NMR-Resonanzen für drei gut dispergierte und gelöst Spitzen für jedes Protein-Staat. Notieren Sie die Peak-Amplituden für jede der sechs Gipfel für jeden Puffer Zustand mit BNB156 (Abb. 5A).
	<ol>
<li>CARA verwenden, um eine Batch-Integration-Liste erstellen (Klicken Sie auf Main Menu Rubrik "Spektrum | Setup-Batch-Liste"...) Alle Spektren gesammelt und zu analysieren, mit einer einzigen Spitze Aufgabendatei (Klicken Sie auf Main Menu Überschrift "Gipfel | Importieren Sie Peaklist"... ...und wählen Sie eine benutzerdefinierte .peaks-Datei mit 6 total Gipfeln, 3 für jedes Protein Staates innerhalb definiert).</li>
		<li>Feinabstimmung der Einstellungen vornehmen ("Integrator | Tune Peak Modell"...) der X-Breite 0,06 ppm und Y-Breite 0,30 ppm (Klicken Sie auf Main Menu Überschrift "Integrator | Tune Peak Modell"...) vor der Aufnahme der endgültigen Ausgabe in zwei Menüauswahl (1.) Klicken Sie auf Main Menu Überschrift "Integrator | Integrieren Sie Batch-Liste") (2. Klicken Sie auf Main Menu Überschrift "Gipfel | Integration-Tabelle exportieren") (Abb. 5B). Hinweis: Die Rückgrat Amid Resonanzen für Rückstände M21, V53 und L105 wurden für den BNB156 geschlossen-Brace Staat zugewiesen. Der Open-Brace-Staat war Rückgrat Amid Resonanzen von Rückständen G130 und A141 und Epsilon Proton Sidechain-Resonanz der W133 mit 3D NMR-Experimente-24zugeordnet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Normalisieren Sie Proben für den direkten Vergleich von verschiedenen Magneten oder Probe Bedingungen durch Mittelung der drei Open-Brace Amplituden der Referenzproben und berechnen einen Normalisierungsfaktor im Zusammenhang mit den beiden Referenzen. Berechnen Sie die skalierten Amplituden für BNB156 Resonanzen mit den Normalisierungsfaktor und Einstellung negative Amplituden auf NULL (Tabelle 2). Beispiele: (1) Vergleich von Proben aus verschiedenen Magneten: Magnet A, BNB156DDM und Magnet B, BNB156+ DDM. (2) Waschmittel Vergleich: 0,34 mM DDM und 1,7 mM DDM.</li>
	<li>Berechnen Sie für jede Resonanz, dass die skalierte Bruchteil des geschlossen - oder Open-Klammer durch Division mit der Palette von Mindest-und maximale Amplitude der alle Spektren enthalten entsprechende Hinweise frei BNB156 und vollständig offen-Brace BNB156 in gesammelt Waschmittel.</li>
	<li>Die normalisierte NMR-Amplituden als Funktion der Lipidkonzentration des Grundstückes und vergleichen den Bruchteil der öffnen-Brace BNB156 unter verschiedenen Bedingungen (Abbildung. 5 C). Hinweis: Alternativ kann Analyse des Bruchs der geschlossen-Brace Konformation gegen Lipidkonzentration durchgeführt werden um Lipid Bindung an BNB156zu vergleichen. Wir bevorzugen die frühere Analyse, weil es schneller und bessere Berichte auf den Bruch-durch Lipide engagiert.</li>
</ol>

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<li>Perez, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+workflow+for+the+automatic+segmentation+of+organelles+in+electron+microscopy+image+stacks%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">A workflow for the automatic segmentation of organelles in electron microscopy image stacks.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 126(2014).</li>
<li>Walton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lead+aspartate%2C+an+en+bloc+contrast+stain+particularly+useful+for+ultrastructural+enzymology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).</li>
<li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biology. 2 (11), 329(2004).</li>
<li>Rossi, P., Xia, Y., Khanra, N., Veglia, G., Kalodimos, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((15N+and+13C-+SOFAST-HMQC+editing+enhances+3D-NOESY+sensitivity+in+highly+deuterated%2C+selectively+%5B1H%2C13C%5D-labeled+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">15N and 13C- SOFAST-HMQC editing enhances 3D-NOESY sensitivity in highly deuterated, selectively [1H,13C]-labeled proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 66 (4), 259-271 (2016).</li>
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<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+sequence+determinants+control+human+and+mouse+receptor+interacting+protein+3+%28RIP3%29+and+mixed+lineage+kinase+domain-like+%28MLKL%29+interaction+in+necroptotic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3 (RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL) interaction in necroptotic signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (23), 16247-16261 (2013).</li>
<li>Tanzer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+divergence+of+the+necroptosis+effector+MLKL%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Evolutionary divergence of the necroptosis effector MLKL.</a> Cell Death & Differentiation. 23 (7), 1185-1197 (2016).</li>
</ol>

Wir bieten Protokolle für Techniken, die wir zusammen als die vermeintliche Henker der Plasmamembran Bruch24MLKL verwickelt. Neben der Entschlüsselung der regulatorischen Netzwerk, das MLKL-vermittelten Necroptosis regelt, können diese Techniken unabhängig verwendet werden, andere geeignete biologische Systeme zu charakterisieren. Praktisch gesehen, sind diese Techniken Medium zu niedrigen Durchsatz Discovery-Tools.
Wir haben routinemäßig verwendet live Cell Imaging von...

Identifizierung von genetischen Komponenten des Necroptosis hat die Verwendung von Tiermodellen, die Implikation des Necroptosis in Physiologie und Krankheit1,2,3,4,5testen erleichtert. Ko von RIPK3 oder MLKL bei Mäusen hatten minimal Implikation in Entwicklung und Erwachsenen Homöostase, was darauf hindeutet, dass diese Necroptosis nicht für wichtig Leben3,6. Darüber hinaus enthalten bestimmte Arten entweder RIPK3 oder MLKL Gene, Unterstützung der unwesentliche Rolle der Necroptosis in Tiere7,8. Auf der anderen Seite hat anspruchsvolle ko Tiermodellen mit verschiedenen Pathologien im Labor induziert eine wichtige Rolle bei Entzündungen, angeborene Immunität und Virusinfektion9,10, Necroptosis ergeben 11 , 12.
Necroptosis kann auf verschiedene Weise durch Signalisierung durch verschiedene angeborene Immunität Sensoren aktiviert werden alle die sich bei der Aktivierung von RIPK31,13,14. Aktive RIPK3 wiederum phosphorylates und aktiviert MLKL3,4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15,16,17,18. Die meisten studierte, und vielleicht der komplexeste Weg, führt zu einer Aktivierung des RIPK3 beinhaltet Tod Rezeptor Ligatur, die gabelt basierend auf die nachgelagerten Zusammensetzung der Signalisierung komplexe entweder induzieren Apoptose oder Necroptosis1. Necroptosis entsteht, wenn durch RIPK1 Signalisierung begünstigt wird und zu Engagement von RIPK319,20 führt. Dieses Ergebnis ist leicht begünstigt auf pharmakologische Hemmung oder genetische Löschung von Caspase 8, eine vermeintliche endogener Inhibitor des Necroptosis, die Necroptosis in Schach hält. RIPK1 bindet an und aktiviert RIPK3. Eine weitere Möglichkeit, Necroptosis zu aktivieren ist durch Toll-Like-Rezeptoren TLR3/TLR4 Signaltechnik, die eingreift und aktiviert RIPK3 durch TIR-Domain-haltigen Adapter-induzierende Interferon-β (SIMPE)21. Noch ist eine andere Art zu sterben durch Necroptosis durch Aktivierung der DNA-Sensor DAI, der direkt eingreift und aktiviert RIPK322.
MLKL ist ein cytosolischen Protein, bestehend aus einer N-terminalen Helix-Bundle (NB)-Domäne und einer C-terminalen Pseudokinase Domäne (PsKD) durch eine regulatorische Klammer Region3verbunden. In normalen Zellen ist MLKL in das Zytosol gefunden wo es angenommen wird, in einem inaktiven Komplex mit RIPK314. Aktivierung des Necroptosis löst RIPK3 Phosphorylierung des MLKL in der Aktivierung der PsKD und möglicherweise weitere Standorte in der NB und Klammer3,15,23. Phosphorylierung bewirkt eine Konformationsänderung in MLKL, der Dissoziation von RIPK314führt. Schlecht verstandene Konformationsänderungen lassen Sie die Klammer aus dem PsKD24. Die Klammer, die 2 Helices enthält, vermittelt Oligomerisierung von MLKL in einem vermeintlichen Trimer durch die C-terminale Helix25. Die N-terminale Helix der Orthese hemmt die NB-Domäne, die für Membran Permeabilisierung24,26unerlässlich. Isoliert reicht die NB Domäne Permeabilisierung der Plasmamembran und Necroptosis16,24,27induzieren. Die Pro-Necroptotic-Aktivität der NB wurde in Maus einen Mangel an MLKL (Mlkl- / - MEFs) embryonalen Fibroblasten rekonstituiert. NB ist ein Lipid-bindende Domäne, die bevorzugt die Phospholipid-Phosphatidylinositol-4,5-Diphosphat (PIP2) eingreift. Wir haben einen schrittweisen Mechanismus der Aktivierung des MLKL, wobei Klammer Oligomerisierung erleichtert die Einstellung des MLKL in der Plasmamembran über schwachen Wechselwirkungen der NB mit dem PIP2 polare Kopfgruppe24vorgeschlagen. An der Membran erfährt die NB geregelten Exposition eine zusätzliche High-Affinity-Bindungsstelle für PIP2, die durch die Orthese in inaktiven MLKL maskiert wird. Insgesamt destabilisieren mehrere Interaktionen der NB mit PIP2 der Plasmamembran zu seinen Bruch, obwohl der molekulare Mechanismus dieser Ereignisse sind nicht geklärt.
Hier zeigen wir spezifische Methoden verwendet, um die Funktion des MLKL als Vollstrecker des Necroptosis24charakterisieren. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die minimalsten Domain MLKL, NB und Klammer (NBB) die Klammer Hemmung unterliegt und durch erzwungene Dimerisierung induzieren Plasmamembran Bruch und Necroptosis aktiviert werden können. Wir beschreiben unsere induzierbaren Expressionssystems kombiniert mit erzwungenen drogeninduzierte FKBP-vermittelte Dimerisierung für live Cell Imaging und Elektronenmikroskopie der Zellen Necroptosis. Darüber hinaus zeigen wir unsere in-vitro- NMR-Analyse der Interaktionen der BNB mit Phosphatidylinositols (PIPs).

<table><tbody><tr><td>Klonierung und Zellliniengenerierung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pRetroX-TRE3G</td><td>Clontech</td><td>631188</td><td></td></tr><tr><td>Tet-On-Transaktivator-Plasmid</td><td></td><td></td><td>Llambi et al., 2016</td></tr><tr><td>Embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus mlkl-/</td><td></td><td></td><td>-Dillon et al., 2014</td></tr><tr><td>Blasticidin S Hydrochlorid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2647100 CAS#3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Quantifizierung des Zelltods und Lebendzellmikroskopie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doxycyclin</td><td>Clontech</td><td>631311 CAS# 24390-14-5</td><td></td></tr><tr><td>B/B Homodimerizer AP20187</td><td>Takara</td><td>635059 CAS# 195514-80-8</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Grün</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Syto16</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7578</td><td></td></tr><tr><td>NMR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 N Ammoniumchlorid</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>NLM-467-10 CAS# 12125-02-9</td><td></td></tr><tr><td>Deuteriertes DTT</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-2622-1</td><td></td></tr><tr><td>Deuteriumoxid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>617385-1 CAS# 7789-20-0</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&beta;-D-Maltopyranosid</td><td>Anatrace</td><td>D310 CAS# 69227-93-6</td><td></td></tr><tr><td>L-&alpha;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (Gehirn, Schwein) (Ammoniumsalz)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>840046X CAS# 383907-42-4</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (Ammoniumsalz) (18:0 PI)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>850143 CAS# 849412-67-5</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol) (Ammoniumsalz) (18:1)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850149 CAS# 799268-53-4</td><td></td></tr><tr><td>Specialized Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte FLR oder ZOOM</td><td>Essen BioScience, Inc.</td><td></td><td>Bildgebung für die Lebendzellmikroskopie</td></tr><tr><td>Helios NanoLab 660 DualBeam&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Elektronenmikroskop</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte 2011A Rev2 v20111.3.4288 (FLR)</td><td>Essen BioScience, Inc.</td><td>http://www.essenbioscience.com</td><td>Bildgebende Analysen,</td></tr><tr><td>FEI MAPS</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>https://www.fei.com/software/maps/ EM-Analyse</td><td></td></tr>, <tr><td>TopSpin v3.2</td>, <td>Bruker BioSpin</td> http://www.bruker.com <td>NMR-Datenerfassung</td><td></td></tr>, <tr><td>CARA v1.9.1.7</td><td></td><td>http://cara.nmr.ch/&nbsp;</td><td>Analyse von NMR-Daten</td></tr><tr><td>Slidebook</td><td>3i (Intelligent Imaging Innovations)</td><td>https://www.intelligent-imaging.com/slidebook</td><td>Konfokale Mikroskopie</td></tr></tbody></table>

charakterisierung der mlkl-vermittelten plasmamembran bruch in necroptosis

Characterization of MLKL-mediated Plasma Membrane Rupture in Necroptosis

Necroptosis ist ein programmierter Zelle Tod Weg, ausgelöst durch die Aktivierung des Rezeptors Interaktion Proteinkinase 3 (RIPK3), die phosphorylates und aktiviert die gemischte Abstammung Kinase-ähnliche Domäne Pseudokinase, MLKL, Bruch oder permeabilize der Plasmamembran . Necroptosis ist eine entzündliche Weg mehrere Pathologien einschließlich Autoimmunität, infektiöse und Herz-Kreislauferkrankungen, Schlaganfall, Neurodegeneration und Krebs zugeordnet. Hier beschreiben wir Protokolle, die verwendet werden, um MLKL als der Henker der Plasmamembran Bruch in Necroptosis zu charakterisieren. Wir visualisieren den Prozess der Necroptosis in Zellen mittels live Cell Imaging mit konventionellen und konfokale Fluoreszenzmikroskopie und in festen Zellen mittels Elektronenmikroskopie, die zusammen die Umverteilung von MLKL aus dem Zytosol in das Plasma enthüllt Membran vor Induktion von großen Löchern in der Plasmamembran. Wir präsentieren in Vitro Kernspinresonanz (NMR) Analyse mit Lipiden, um vermeintliche Modulatoren des MLKL-vermittelten Necroptosis zu identifizieren. Basierend auf dieser Methode, identifizierten wir quantitative Lipid-verbindliche Präferenzen und Phosphatidyl-Inositol Phosphate (PIPs) als kritische Bindemittel der MLKL, die für die Plasmamembran targeting und Permeabilisierung in Necroptosis erforderlich sind.

Visualisierung von regulierten Necroptosis Ausführung in lebenden Zellen wurde möglich durch induzierbaren Ausdruck eines minimalen abgeschnittene MLKL Konstrukts, BNB140-2xFV-Venus. Dieses Konstrukt behält die Fähigkeit, Plasmamembran Permeabilisierung induzieren und durch Dim-induzierte Oligomerisierung FKBP-Kassette (2xFV) aktiviert ist. Wir beobachten und Quantifizierung der Necroptosis durch live-Cell-Mikroskopie imaging, Überwachung kinetisch (alle 5 min) die Aufnahme ein...

Wir berichten Methoden zur Charakterisierung von MLKL-vermittelten Plasmamembran Bruch in Necroptosis einschließlich konventioneller und konfokale live-Cell-Mikroskopie Bildgebung, Scannen, Elektronenmikroskopie und NMR-basierte Lipid-Bindung.

Charakterisierung der MLKL-vermittelten Plasmamembran Bruch in Necroptosis

Necroptosis is a programmed cell death pathway triggered by activation of receptor interacting protein kinase 3 (RIPK3), which phosphorylates and ...

Diese Methoden können dazu beitragen, Schlüsselfragen zur Rolle der Pseudokinase-Mischlinien-Kinase-Domäne (MLKL) bei der Nekroptose zu beantworten, wie z. B. Membrantranslokation und Permeabilisierung bei der Lipidbindung. Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, dass sie MLKL direkt als Vollstrecker der Plasmamembranruptur bei Nekroptose einbeziehen. Die Bildgebung von lebenden Zellen hat das Gebiet der Zelltodforschung revolutioniert, insbesondere bei der MLKL-vermittelten Nekroptose.Die Kernspinresonanz ist eine leistungsfähige Technik zur Überwachung der Lipidbindung an Proteine, wie hier für MLKL gezeigt. Beginnen Sie mit der Plattierung von fünf mal 10 auf die vierte MLKL-Knockout-Maus: embryonale Fibroblasten oder MEFs, die die Executioner-Domäne von MLKL exprimieren, fusioniert mit einer Oligomerisierungskassette und Venus in einem Milliliter supplementiertem DMEM in 24-Well-Platten für ihre Inkubation über Nacht in einem Zellkultur-Inkubator. Am nächsten Morgen behandeln Sie die Zellen 12 Stunden lang mit Doxycyclin, um die Expression des Transgens zu induzieren, gefolgt von der Zugabe von Standard-DMEM, ergänzt mit FK506-bindendem Proteindimerizer und membranundu

characterization-mlkl-mediated-plasma-membrane-rupture

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Bestimmung intrazellulärer Signalereignisse, die in lebensfähigen Zellen durch physikalische Interaktion mit benachbarten toten oder sterbenden Zellen induziert werden. Das Protokoll konzentriert sich auf Signalereignisse, die durch Rezeptor-vermittelte Erkennung der toten Zellen induziert werden, im Gegensatz zu ihrer phagozytären Aufnahme oder Freisetzung löslicher Mediatoren.

Identifizierung von intrazellulärer Induzierte in lebenden Zellen durch Interaktion Signalisierung mit Benachbarte Zellen, die eine programmierten Zelltods

Wir beschreiben die Erkennung des NLRP3-Inflammasome-Aktivierung auf zellulärer Basis mit Fluoreszenz-Mikroskopie und Färbung für aktive Caspase-1 und den Adapter, ASC. Ein Laktat-Dehydrogenase-Release-Assay wird vorgestellt, um Pyroptotic Lyse auf Basis einer Bevölkerung zu erkennen. Diese Techniken können angepasst werden, um viele Aspekte der Inflammasome Biologie zu studieren.

Erkennung von Inflammasome Aktivierung und Pyroptotic Zelltod in murinen Makrophagen Knochenmark abgeleitet

Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Fluoreszenz basierende Assays, die die Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz durch fluorometrisch und bildgebende Untersuchungen in lebenden Zellen misst. Dieser Test kann verwendet werden, für das screening von Drogen oder Zielgene, die Plasmamembran Wiederverschließen in Säugetierzellen zu regulieren.

Hochdurchsatz-Messung der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz in Säugerzellen

Dieses Protokoll beschreibt eine umfassende Methode zur Beurteilung der Caspase-Aktivierung (Caspase-1, Caspase-3, Caspase-7, Caspase-8, Caspase-9 und Caspase-11) als Reaktion auf In-vitro - und In-vivo-Modelle (in Mäusen) von Infektionen, sterilen Beleidigungen und Krebs, um die Initiierung von Zelltodwegen wie Pyroptose, Apoptose, Nekroptose und PANoptose zu bestimmen.

Evaluierung der Caspase-Aktivierung zur Beurteilung des angeborenen Immunzelltods

Die Tyramid-Signalverstärkung während der Immunfluoreszenzfärbung ermöglicht den sensitiven Nachweis von phosphoryliertem RIPK3 und MLKL während der ZBP1-induzierten Nekroptose nach HSV-1-Infektion.

Tyramid-Signalamplifikation zur Immunfluoreszenzfärbung der ZBP1-abhängigen Phosphorylierung von RIPK3 und MLKL nach HSV-1-Infektion in menschlichen Zellen

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von CLON-G, um die Lebensdauer der Neutrophilen auf mehr als 5 Tage zu verlängern, und bietet ein zuverlässiges Verfahren zur Beurteilung des Neutrophilentods mit Durchflusszytometrie und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie.

Verlängerung der Lebensdauer von Neutrophilen mit CLON-G und einem In-vitro-Spontantod-Assay

Dieses Protokoll basiert auf LPS und ATP-induziertem Tod von PMA-differenzierten THP-1-Makrophagen. Wir verwenden die Durchflusszytometrie zur Analyse von Annexin V und 7-AAD-Doppelfärbung, um den Zelltod zu erkennen, wobei wir die gesamte Zelle verwenden und Rasterelektronenmikroskopie einsetzen, um die Zellmembranmorphologie zu beobachten.

LPS und ATP-induzierter Tod von PMA-differenzierten THP-1-Makrophagen und deren Validierung

Dieses Protokoll beschreibt ein Lebendzell-Bildgebungsverfahren zur Überwachung der lysosomalen Membranpermeabilisierung während der Nekroptose unter Verwendung von Fluoreszenzsonden, die Veränderungen der Integrität der lysosomalen Membran und der Versauerung nachweisen.

Lebendzell-Bildgebung der Permeabilisierung der lysosomalen Membran während der Nekroptose

Wir beschreiben, wie man in der Nähe Membran und globalen intrazellulären Calcium-Dynamik in kultivierten Astrozyten mit Totalreflexion und Epifluoreszenzmikroskopie messen.

Messen in der Nähe Plasmamembran und Global intrazellulären Calcium-Dynamics in Astrozyten

Regulierte Endozytose regelt die Zelloberflächenexpression Ebenen der Mehrheit der Membranproteinen. Hier nutzen wir reduzierbar, Membran impermeante Biotinylierungsreagenzien die endocytischen Rate der Dopamin-Transporter (DAT), ein polytoper Membranprotein zu messen. Das Verfahren ermöglicht eine einfache Methode zur Messung der Endozytose von den meisten Plasmamembranproteinen.

Mess-Plasmamembranprotein endocytischen Preise von Reversible Biotinylierung

Erfahren Sie Methoden zur Charakterisierung der MLKL-vermittelten Plasmamembranruptur während der Nekroptose mittels Live-Zell-Mikroskopie, Rasterelektronenmikroskopie und NMR-basierter Lipidbindungsanalyse.

Charakterisierung der MLKL-vermittelten Plasmamembran Bruch in Necroptosis

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