Empfindliche Messung des Mitophagy von Flow Cytometry Verwendung der pH-abhängigen fluoreszierende Reporter Mt-Otamegane

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine empfindliche Technik zur Messung der zellulären Mitophagieaktivität mittels Durchflusszytometrie bereitzustellen. Hier zeigen wir, dass diese Methode erfolgreich eingesetzt wurde, um den dramatischen Anstieg der HeLa-Zell-Mitophagie nach Behandlung mit CCCP, einem mitochondrialen Entkoppler, zu beurteilen. Mit dieser Technik kann die Mitophagenaktivität sehr schnell und einfach gemessen werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie die Mitophagenaktivität in lebenden Zellen ohne zusätzliche Färbung empfindlich messen können. Daher wird diese Technik letztendlich dazu beitragen können, den Mechanismus und die physiologische Rolle von Mitophagen zu verstehen. Das Verfahren wird von Jee-Hyun Um und Young Yeon Kim aus meinem Labor demonstriert.

Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung des mt-Keima, eines Keima-Lentivirus, das auf Mitochondrien abzielt. Zuerst säen HEK293T Zellen in einer mit Poly-L-Lysin beschichteten Kulturschale und kultivieren sie einen Tag lang bei 37 Grad Celsius in einem Gewebekultur-Inkubator. Am nächsten Tag HEK293T Zellen mit mt-Keima, lentiviraler DNA und Verpackungs-DNase mit einem Transfektionsreagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers transfizieren.

Nach acht Stunden Transfektion entfernen Sie das Transfektionsmedium und fügen Sie acht Milliliter frisches Medium hinzu. Sammeln Sie das Medium mit Viruspartikeln 48 Stunden später und entfernen Sie Zelltrümmer durch Zentrifugation. Anschließend filtrieren Sie das virenhaltige Medium mit einem 0,45-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilter.

Einen Tag vor der Ernte des mt-Keima-Lentivirus werden HeLa-Parkin-Zellen in einer 60-Millimeter-Kulturschale plattiert und mit vier Millilitern Wachstumsmedium einen Tag lang bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator kultiviert. Am nächsten Tag das Wachstumsmedium entfernen, einen Millimeter mt-Keima-Virusmedium hinzufügen, weitere zwei Milliliter Wachstumsmedium mit 3 Mikrolitern Polybrene-Stammlösung hinzufügen und die Zellen einen Tag lang in einem CO2-Inkubator inkubieren. 24 Stunden nach der Infektion entfernen Sie das Virusmedium, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und fügen Sie vier Milliliter Wachstumsmedium hinzu.

Um nicht infizierte Zellen zu entfernen, behandeln Sie die Zellen zwei Tage lang mit zwei Mikrogramm pro Mikroliter Puromycin. Bereiten Sie frische Medien mit 10 mikromolaren CCCP vor. Entfernen Sie das Kulturmedium und fügen Sie vier Milliliter frisches Wachstumsmedium hinzu, das CCCP enthält.

Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem CO2-Inkubator für sechs Stunden. Entfernen Sie das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Trennen Sie die Zellen durch Behandlung mit Trypsin-EDTA-Lösung.

Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und suspendieren Sie sie wieder in einem Milliliter PBS. Übertragen Sie die Zellen in ein FACS-Röhrchen und legen Sie sie auf Eis. Schalten Sie für die Durchflusszytometrie das Durchflusszytometer ein und starten Sie die Analysesoftware.

Generieren Sie ein neues Experiment und wählen Sie im Parameterfenster BV605 für den violetten Laser und PE-CF594 für den gelb-grünen Laser aus. Führen Sie zunächst eine Kontrollprobe von Zellen durch, die nicht mit dem mt-Keima-Lentivirus infiziert sind. Zeichnen Sie im Diagramm der Vorwärtsstreuung im Vergleich zur Seitenstreuung ein Tor mit dem Polygonsymbol um die lebenden Zellen und eliminieren Sie tote Zellen und Zelltrümmer.

Dann laufen HeLa-Parkin-Zellen, die mit dem mt-Keima-Lentivirus infiziert sind. Im Punktdiagramm von BV605 gegen Seitenstreuung wird die Spannung so eingestellt, dass HeLa-Parkin-Zellen, die mt-Keima exprimieren, deutlich von Kontrollzellen unterschieden werden, die mt-Keima nicht exprimieren. Als nächstes stellen Sie im Punktdiagramm von PE-CF594 im Vergleich zur Seitenstreuung die Spannung so ein, dass HeLa-Parkin-Zellen, die mt-Keima exprimieren, deutlich von Kontrollzellen unterschieden werden.

Wählen Sie dann im Punktdiagramm von BV605 versus PE-CF594 die mt-Keima-positive Zellpopulation aus, indem Sie mit dem Polygonsymbol ein Gate zeichnen. Erstellen Sie als Nächstes ein weiteres Punktdiagramm von BV605 im Vergleich zu PE-CF594, das nur mt-Keima-Gated Zellen zeigt. Zeichnen Sie in diesem Punktdiagramm ein Tor um unbehandelte mt-Keima-positive Zellen.

Dieses Gate wird als Low Gate bezeichnet. Zeichnen Sie dann ein weiteres Tor, das den Bereich über dem unteren Tor enthält. Dieses Tor wird als hohes Tor bezeichnet, da es Zellen mit hoher Mitophagieaktivität enthält.

Wählen Sie dann das Menü "Bevölkerungshierarchie anzeigen" aus. Der Wert für den Prozentsatz des übergeordneten Elements stellt den Prozentsatz der Zellen im oberen Gate in der mt-Keima-positiven Population dar. Führen Sie nun jede Probe aus und zeichnen Sie mindestens 10 000 Ereignisse im mt-Keima Stop-Gate auf.

Die durchflusszytometrische Analyse von unbehandelten HeLa-Zellen, die mt-Keima exprimieren, zeigte ein niedriges Mitophagieniveau. Die CCCP-Behandlung induzierte einen dramatischen Anstieg der Mitophagiezellen im High Gate. Der Prozentsatz der Mitophagiezellen stieg sechs Stunden nach der CCCP-Behandlung um mehr als das 10-fache.

Dieser Anstieg der Mitophagie durch die CCCP-Behandlung wurde durch die gleichzeitige Behandlung mit Bafilomycin A vollständig aufgehoben. Sobald die Zellen, die Mito-Keima exprimieren, bereit sind, kann die Mitophagenmessung mittels Durchflusszytometrie innerhalb einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig vorbereitet wird. Für eine genaue Mitophagenanalyse mittels Durchflusszytometrie ist es wichtig, die richtigen High- und Low-Gates einzurichten. Bei der Analyse neuartiger Zellen ist es notwendig, bekannte Zellen wie HeLa-Zellen als Kontrolle zu verwenden.

Darüber hinaus ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Mitophagen durch zusätzliche Merkmale wie eine Abnahme des mitochondrialen Proteins und eine Verringerung der mitochondrialen DNA vollständig bestätigt werden sollten. Diese Technik kann auf eine Vielzahl von Zelltypen angewendet werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mitophagen mittels Durchflusszytometrie analysiert.