Name: Empfindliche Messung des Mitophagy von Flow Cytometry Verwendung der pH-abhängigen fluoreszierende Reporter Mt-Otamegane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Lernen Sie eine empfindliche Durchflusszytometrie-Methode zur Messung der Mitophagie in lebenden HeLa-Zellen ohne zusätzliche Färbung. Diese Technik ermöglicht schnelle Analysen mitochondrialer Dynamik.

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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Research Foundation of Korea (2016R1D1A1B03931949) (, J. U.) und der National Research Foundation von Korea (NRF) Zuschuss gefördert durch den Korea-government(MSIT) (Nr. 2016R1A2B2008887, Nr. 2016R1A5A2007009) (, J.Y unterstützt. .)

1. Generation von HeLa-Zellen mit dem Ausdruck Mito-Otamegane (Mt-Otamegane)
<ol><li>
Vorbereitung der Mt-Otamegane lentivirus
	<ol>
<li>Bestreichen Sie eine 100-mm-Kulturschale durch Zugabe von 2 mL von 0,001 % Poly-L-Lysin/Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und für 5 min bei Raumtemperatur stehen lassen.</li>
		<li>Entfernen Sie die Poly-L-Lysin-Lösung mit einer Glaspipette verbunden mit einem Vakuum und waschen Sie der Kulturschale durch Zugabe von 2 mL 1 X PBS.</li>
		<li>Platte 1,5 x 106 HEK293T Zellen auf die beschichtete Kultur Schüssel mit 10 mL DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin und Kultur der Zellen bei 37 ° C in einem CO2 Gewebekultur Inkubator für einen Tag.</li>
		<li>Transfizieren 2 µg von Mt-Otamegane Lentivirale Plasmid29 DNA zusammen mit Verpackung DNAs (PsPAX 2 µg und pVSVG 0,25 µg) mit einem Transfection Reagens für 8 h entsprechend den Anweisungen des Herstellers.</li>
		<li>Entfernen Sie die Transfektion Medium und 8 mL frische Medien.</li>
		<li>Sammeln Sie das Medium mit Viruspartikel 48 h später. Die gesammelten Medien durch Zentrifugation bei 500 X g für 5 min zelltrümmer entnehmen und sie mit einem 0,45-µm-Spritze-Filter filtern. Hinweis: Für den langfristigen Einsatz Aliquote Lentivirale Partikel und speichern Sie die Proben bei-80 ° C. Vermeiden Sie die virale Proben um Frost-Tau-Zyklen für effiziente Virusinfektion zu unterwerfen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
HeLa-Parkin Zellen mit Mt-Otamegane Lentivirus zu infizieren
	<ol>
<li>Platte 5 x 104 -HeLa-Zellen mit dem Ausdruck Parkin (HeLa-Parkin) in der Kulturschale von 60 mm mit 4 mL DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin bei 37 ° C einen Tag vor der Ernte die Mt-Otamegane Lentivirus. Hinweis: Wegen des Fehlens von endogenen Parkin Ausdruck in HeLa Zellen30, die HeLa-Parkin Zellen hier verwendet, um mehr klar zeigen CCCP-induzierten Mitophagy. Dieses Verfahren kann auch auf andere primäre oder immortalisierte Zelllinien angewendet werden.</li>
		<li>Entfernen Sie am nächsten Tag das Wachstumsmedium zu und fügen Sie 1 mL der Mt-Otamegane Lentivirale Medien. Hinzugeben Sie eine zusätzliche 2 mL Wachstumsmedium, enthält 3 µL Polybrene-Stammlösung (8 mg/mL in destilliertem Wasser). Eines Tages in eine CO2 Gewebekultur Inkubator inkubieren.</li>
		<li>Entfernen Sie die Mt-Otamegane Lentivirale Mischung am nächsten Tag und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 X PBS. 4 mL Wachstumsmedium hinzufügen und die Zellen mit 2 µg/mL Puromycin für zwei Tage zu behandeln.</li>
		<li>Entfernen Sie nach zwei Tagen Puromycin Auswahl das Wachstumsmedium, und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1 X PBS. Wachstumsmedium hinzufügen und Kultur der Zellen in einem CO2 Inkubator bis zur Verwendung. Hinweis: Diese Methode kann angewendet werden, um Zellen zu generieren, die stabil Mt-Otamegane, einschließlich anderer Zelllinien und Primärzellen Ausdrücken.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Induktion Mitophagy mit CCCP Behandlung und FACS Probenvorbereitung
<ol style="margin-left: 40px;"><li>Platte 5 x 104 HeLa-Parkin Zellen mit dem Mt-Tages in einer 60-mm-Kultur Ausdruck Schüssel mit 4 mL DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin und Kultur sie für einen Tag bei 37 ° C in einem CO2 Gewebekultur Inkubator.</li>
	<li>Entfernen Sie das Wachstumsmedium am nächsten Tag und 4 mL frische DMEM mit 10 µM Carbonyl Zyanid m-Chlorophenylhydrazone (CCCP). Inkubieren Sie HeLa-Parkin-Mt-Otamegane Zellen in eine CO2 Gewebe-Brutkasten für 6 h.</li>
	<li>Entfernen Sie das Wachstumsmedium 6 h später zu und waschen Sie die Zellen mit 2 mL 1 X PBS. Lösen Sie die Zellen, indem mit Trypsin/EDTA-Lösung behandeln und inaktivieren die Trypsin durch Zugabe von Wachstumsmedium mit 10 % FBS. Übertragen Sie die Zellen in einer 15 mL konische Rohr.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 X g für 5 min.</li>
	<li>Vorsichtig herausnehmen Sie das Wachstumsmedium durch Absaugen und aufzuwirbeln Sie die Zellen mit 1 mL kalten 1 X PBS.</li>
	<li>Übertragen Sie Zellen in das entsprechende FACS-Rohr und legen Sie es auf dem Eis. Hinweis: Bereiten Sie nicht infizierte HeLa-Zellen als Negativkontrolle. Hinweis: Zellen sind auf Eis für mehrere Stunden lebensfähig, und Mt-Otamegane Fluoreszenz Signale auch stabil bleiben.</li>
</ol>(3) FACS Analyse der mitophagy
Hinweis: In dieser Studie wurden die Zellen mit einem Durchflusszytometer, ausgestattet mit einem 405 nm und 561 nm Laser analysiert. Zellen waren begeistert mit einem violetten Laser (405 nm) mit Emission bei 610 ± 10 nm erkannt, mit einem BV605-Detektor und mit einem Gelb-Grün-Laser (561 nm) mit Emission bei 610 ± 10 nm durch eine PE-CF594-Detektor gleichzeitig erkannt (Abbildung 1).
<ol><li>
Anspritzung von lebenden Zellen
	<ol>
<li>Schalten Sie das Durchflusszytometer und den Computer und melden Sie sich bei der Analyse-Software.</li>
		<li>Generieren Sie ein neues Experiment oder duplizieren Sie vorhandener Experiment. Zellen mit violetten begeistern (405 nm) und gelb-grün (561 nm) Laser und Emission bei 610 ± 10 nm Detektor erkennen, wählen Sie BV605 und PE-CF594 neben forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC) im Fenster "Parameter" als erforderlich Fluorophore. Hinweis: Alle Fluorophore sollte in einem linearen Modus hinzugefügt werden.</li>
		<li>Vortex aggregiert jedes Zellprobe kurz zu Zelle zu zerstreuen.</li>
		<li>Das Rohr mit einer Kontrolle HeLa-Parkin Zellprobe, die nicht mit Mt-Otamegane Lentivirus auf die Probe spritzenport infiziert ist, und drücken Sie "run" auf die Cytometer.</li>
		<li>Passen Sie in der Dot-Plot des FSC gegen SSC die FSC und SSC Spannung um Zellen in der Mitte des Dot-Plot zu platzieren.</li>
		<li>Zeichnen Sie ein P1-Tor mit dem Polygon-Symbol aller lebenden Zellen und beseitigen Sie abgestorbene Zellen und zellenrückstand (Abbildung 2A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Anpassen der Spannungen für die violette und grüne laser
	<ol>
<li>Legen Sie das Rohr mit HeLa-Parkin Zellen infiziert mit Mt-Otamegane Lentivirus auf die probeninjektion port und drücken Sie "run" auf die Cytometer.</li>
		<li>In der Dot-Plot des BV605 (405 nm) gegen SSC, die BV605 Spannung so einstellen, dass HeLa-Parkin Zellen mit dem Ausdruck Mt-Otamegane von Kontrollzellen klar abgegrenzt sind, die Mt-Otamegane (Abb. 2 b) nicht ausdrücken.</li>
		<li>In der Dot-Plot von PE-CF594 (561 nm) gegen SSC, die PE-CF594-Spannung so einstellen, dass HeLa-Parkin Zellen mit dem Ausdruck Mt-Otamegane von Kontrollzellen (Abb. 2 b) klar abgegrenzt sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Den Anteil der Zellen im Mitophagy bewerten
	<ol>
<li>Erwerben Sie die BV605 im Vergleich zu PE-CF594-Dot-Plot anhand einer linearen Skala. Zeichnen Sie ein Tor mit dem Polygon-Symbol um die Zellen mit dem Mt-Otamegane Ausdruck, und beseitigen Sie Zellen, die nicht mit dem Ausdruck Mt-Otamegane (Abbildung 3A). Die Mt-Otamegane Fluoreszenz-positiven Zellpopulation bezeichnet man als die "Mt-Otamegane" Tor.</li>
		<li>Erstellen Sie ein weiteres Dot-Plot des BV605 im Vergleich zu PE-CF594 zeigt nur "Mt-Otamegane"-geschlossene Zellen. Zeichnen Sie in dieser Dot-Plot ein Tor um unbehandelten Mt-Tages-positiven Zellen. Die basale Mitophagy Aktivität des Steuerelements HeLa Zellen ist niedrig, und das Verhältnis der Emission bei PE-CF594/BV605 ist kleiner als 1. Somit ist dieses Tor als "niedrig" Tor bezeichnet.</li>
		<li>Zeichnen Sie ein weiteres Tor mit der oben genannten Region von "niedrig" Tor. Dieses Tor wird als "hoch" Tor bezeichnet, da es Zellen mit hohen Mitophagy Aktivität, das heißt, Zellen mit einem hohen Anteil an Emission bei PE-CF594/BV605 (Abb. 3 b enthält).</li>
		<li>Um den Prozentsatz der Zellen in der "hohen" Tor zu berechnen, wählen Sie Menü "Zeigen Bevölkerung Hierarchie". "Prozent der Wert des übergeordneten Elements" (% Elternteil) gibt den Prozentsatz der Zellen in der "hohen" Tor der Mt-Otamegane-positiven Bevölkerung.</li>
		<li>Stellen Sie mindestens 10.000 Ereignisse in das "Mt-Otamegane" stoppen Tor aufnehmen und jede Probe laufen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

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Hier präsentieren wir Ihnen eine schnelle und empfindliche Methode für die Verwendung von Durchflusszytometrie, zelluläre Mitophagy Aktivität in den Zellen, die mit dem Ausdruck Mt-Otamegane zu messen. Durchläuft ein hohes Maß an Mitophagy Zellen weisen ein erhöhtes Verhältnis von PE-CF594 (561 nm) / BV605 (405 nm) Erregung. So kann Mitophagy Aktivität als der Anteil der Zellen ausstellenden ein hohes Verhältnis von 561/405 ausgedrückt werden. Wir berechnen den Prozentsatz der Zellen in der Region "hohe" Tor auf einem Pu...

Mitochondrien sind Organellen, die Zellproliferation und Physiologie unverzichtbar sind. Mitochondrien sind für die Erzeugung von mehr als 80 % der ATP-Versorgung über Oxidative Phosphorylierung verantwortlich, und sie bieten auch verschiedene Stoffwechsel Zwischenprodukte für Biosynthese und Metabolismus1,2. Neben ihrer Rolle in der Energieversorgung und des Stoffwechsels spielen Mitochondrien zentrale Rollen in viele andere wichtige Prozesse, einschließlich reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS)-Generation, die Regulierung der Zelltod und intrazellulären Ca2 + Dynamik3 . Veränderungen in der Funktion der Mitochondrien wurden mit menschlichen Krankheiten, einschließlich Krebs, Diabetes Mellitus und verschiedenen neurodegenerativen Krankheiten4,5verbunden. Erhöhte mitochondriale Dysfunktion und mitochondriale DNA-Mutationen sind auch gedacht, um zum normalen Alterungsprozess Prozesse6,7,8beitragen. Qualitätskontrolle ist daher ein zentrales Thema in den Mitochondrien. Mitochondrien sind hochdynamische Organellen, die ständig ihre Form zwischen längliche Netzwerke und kurze, fragmentierte Form ändern können. Mitochondrien Dynamik spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Funktion der Mitochondrien sowie deren Abbau durch Mitophagy9.
Mitophagy ist ein Mechanismus, den selektiven Abbau der ganze Mitochondrien Autophagie Maschinen. Mitophagy ist der Grundsatz Mechanismus zugrunde liegende mitochondriale Umsatz und die Entfernung von beschädigten oder gestörte Mitochondrien. In diesem Prozess sind Mitochondrien vor umgeben durch eine Membran, was zur Bildung von autophagosom, die dann mit Lysosomen für hydrolytische Abbau9verschmelzen. Vorherigen genetischen Drosophila deutet an, dass zwei der Parkinson-Krankheit-Genen, PTEN-induzierte vermeintliche Kinase 1 (PINK1) (PARK6) und Parkin (PARK2), funktionieren in der gleichen Weg10,11. Untersequenz Studien haben gezeigt, dass der PINK1-Parkin Weg verantwortlich ist für die Beseitigung der beschädigten Mitochondrien und Mängel in diesem Weg führen dysfunktionalen Mitophagy und dazu, Krankheiten beim Menschen12,13 beitragen kann. Defekte in Mitophagy Prozesse wurden vor kurzem in verschiedenen menschlichen Krankheiten, einschließlich Krebs, Herz-Kreislauferkrankungen, Erkrankungen der Leber und Neurodegenerative Krankheit 14gefunden. Neuere Studien haben darüber hinaus auch gezeigt, dass Mitophagy entscheidend für viele physiologische Prozesse, z. B. Differenzierung und Entwicklung der Immunantwort15,16,17,18 ,19, was darauf hindeutet, dass Mitophagy eine aktivere Rolle bei der Kontrolle der Zellfunktionen spielen kann.
Trotz den letzten Bestätigung des Mitophagy spielt eine wichtige Rolle in beiden Qualitätskontrolle in den Mitochondrien und menschlicher Erkrankungen, die molekularen Mechanismen, die Mitophagy bleiben schlecht verstanden. Obwohl Mitophagy-bezogene Mechanismen in der Hefe systematisch untersucht worden sind, haben Studien zur Erforschung Mitophagy-bezogene Mechanismen in Säugetierzellen hauptsächlich auf den PINK1-Parkin Weg konzentriert. Frühere Studien haben festgestellt, dass die PINK1-Parkin-Weg in erster Linie verantwortlich für die selektive Entfernung von beschädigten Mitochondrien über Mitophagy12,20,21. Jedoch haben neuere Studien berichtet, dass bei einigen Modellen auch in Abwesenheit von funktionalen PINK122,23,24Mitophagy aktiviert werden kann. Diese Ergebnisse legen nahe, dass neben den PINK1-Parkin Weg, dort eine zusätzliche unbekannten Weg, die Mitophagy aktivieren können.
Das Fehlen eine bequeme Methode, um Mitophagy Tätigkeit zu beurteilen ist ein Haupthindernis zu erkunden die Wege, die Mitophagy und ihre Rolle bei der pathophysiologischen Ereignisse zu regulieren. Elektronenmikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Autophagosome verschlungen Mitochondrien direkt sichtbar zu machen. Elektronen-Mikroskopie hat jedoch Einschränkungen bei der Quantifizierung der Mitophagy Aktivität. Obwohl die Strategien, mit denen Mikrotubuli-assoziierten Protein-1 Kette 3 (LC3) Licht-konjugierte fluoreszierende Sonden, wie GFP-LC3, sind derzeit die am weitesten verbreitete Ansätze25, die vergängliche Natur des Signals LC3-basierte und seine hohe falsch-Positive Signale begrenzen seine Empfindlichkeit zur Erkennung von Mitophagy in Zellen26. Eine Kombination von westlichen Beflecken zur Messung der mitochondrialen Protein-Ebene, die Quantifizierung der mitochondrialen DNA und Fluoreszenz-Mikroskopie-Analyse zu Mitochondrien mit autophagosom oder Lysosomen colocalize wäre ein guter Ansatz für die Bewertung Mitophagy. Allerdings rufen Quantifizierung Einschränkungen und mangelnder Komfort von bestehenden Methoden für neue Ansätze. Die Einführung einer neuen pH-abhängig fluoreszierenden Proteins, das mitochondriale Ziel Otamegane (Mt-Otamegane), verbessert stark die Fähigkeit, Mitophagy27zu erkennen. Durch die Verschmelzung der mitochondrialen Zielversionen Abfolge von Cytochrom C Oxidase Untereinheit VIII (COX VIII) in Otamegane, richtet sich die Mt-Otamegane an der mitochondrialen Matrix. Die große Verschiebung in der Erregung Höhepunkt des Tages von 440 nm auf 586 nm (entsprechend pH 7 und pH 4, beziehungsweise) kann genutzt werden, um Mitophagy mit guten sensibel in in Vitro und in Vivo Experimente28,29 bewerten . Noch wichtiger ist, verursacht der Widerstand der Mt-Otamegane lysosomalen Abbau die Integration des Mt-Otamegane Signals in Lysosomen, ermöglicht die einfache quantitative Messung der Mitophagy Tätigkeit. Die Fluoreszenz-Änderung, die in Mt-Otamegane Auftritt kann entweder konfokalen Mikroskopie analysiert werden oder flow Cytometry28,29. Jedoch hat eine Flow Cytometry basierende Methode zur Messung der Mitophagy Tätigkeit mit Mt-Tages im Detail bis heute nicht erbracht.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für eine Flow Cytometry basierende Technik zur Messung Mitophagy Aktivität in den Zellen mit Mt-Otamegane. Obwohl wir hier gezeigt haben, dass Flow Cytometry Analyse erfolgreich CCCP-induzierten Mitophagy in HeLa-Zellen mit dem Ausdruck Parkin erkannt, kann diese Technik auf eine Vielzahl von Zelltypen angewendet werden.

<table><tbody><tr><td><stark>REAGENZIEN</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>poly-L-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Wellgene</td><td>LS202-02</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyklon</td><td>SH30013.02</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Turbofect</td><td>Thermoskanne wissenschaftlich</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; m Spritzenvorsatzfilter</td><td>sartorius</td><td>16555</td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Polybren</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>8 mg/ml</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>2 mg/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Carbonylcyanid m-Chlorphenylhydrazin (CCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2759</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Wellgen</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD Bioscience</td><td>LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>FACSDIVA</td><td>BD Bioscience</td><td>FACSDIVA (v8.0.1)</td><td></td></tr></tbody></table>

empfindliche messung des mitophagy von flow cytometry verwendung der ph-abhängigen fluoreszierende reporter mt-otamegane

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy ist ein Prozess der selektiven Entfernung von beschädigten oder unnötige Mitochondrien Autophagie Maschinen. Enge Verbindungen wurden zwischen defekten Mitophagy und verschiedenen menschlichen Krankheiten, einschließlich der neurodegenerativen Erkrankungen, Krebs und Stoffwechselerkrankungen gefunden. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass diese Mitophagy in normalen zellulären Prozessen, wie z. B. Differenzierung und Entwicklung beteiligt ist. Die genaue Rolle der und molekularen Mechanismen, die Mitophagy erfordern jedoch weiteren Studien. Daher ist es wichtig, eine robuste und bequeme Methode zur Messung der Veränderungen im Mitophagy Aktivität zu entwickeln. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Beurteilung der quantitativ Mitophagy Tätigkeit mittels Durchflusszytometrie mit den Mitochondrien gezielt fluoreszierenden Proteins Otamegane (Mt-Otamegane). Dieser Assay Flow Cytometry kann Mitophagy Aktivität schneller und sensibler als bei konventionellen Mikroskopie oder Immunoblotting-basierte Methoden analysieren. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um Mitophagy Aktivität in verschiedenen Zelltypen zu analysieren.

Ein Beispiel der Flow-zytometrie-Analyse von CCCP-induzierten Mitophagy in HeLa-Parkin Zellen ist in Abbildung 4dargestellt. Verwenden die oben beschriebene Flow Cytometry Analysemethode, erkennen wir eine dramatische Zunahme in Mitophagic Zellen im "hohen" Tor. Der Anteil der Zellen im "hohen" Tor wurde erhöht, mehr als 10-Mal im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen (Abb. 4A). Diese Zunahme der Mitophagy Aktivität wurde dur...

Mitophagy, den selektiven Abbau von Mitochondrien, hat im mitochondrialen Homöostase in Verbindung gebracht und ist in den verschiedenen menschlichen Krankheiten dereguliert. Bequeme experimentelle Methoden zur Messung Mitophagy Aktivität sind jedoch sehr beschränkt. Hier bieten wir eine sensible Test zur Messung der Mitophagy Tätigkeit mit Durchflusszytometrie.

Empfindliche Messung des Mitophagy von Flow Cytometry Verwendung der pH-abhängigen fluoreszierende Reporter Mt-Otamegane

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine empfindliche Technik zur Messung der zellulären Mitophagieaktivität mittels Durchflusszytometrie bereitzustellen. Hier zeigen wir, dass diese Methode erfolgreich eingesetzt wurde, um den dramatischen Anstieg der HeLa-Zell-Mitophagie nach Behandlung mit CCCP, einem mitochondrialen Entkoppler, zu beurteilen. Mit dieser Technik kann die Mitophagenaktivität sehr schnell und einfach gemessen werden.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie die Mitophagenaktivität in lebenden Zellen ohne zusätzliche Färbung empfindlich messen können. Daher wird diese Technik letztendlich dazu beitragen können, den Mechanismus und die physiologische Rolle von Mitophagen zu verstehen. Das Verfahren wird von Jee-Hyun Um und Young Yeon Kim aus meinem Labor demonstriert.Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung des mt-Keima, eines Keima-Lentivirus, das auf Mitochondrien abzielt. Zuerst säen HEK293T Zellen in einer mit Poly-L-Lysin beschichteten Kulturschale und kultivieren sie einen Tag lang bei 37 Grad Celsius in einem Gewebekultur-Inkubator. Am nächsten Tag HEK293T Zellen mit mt-Keima, lentiviraler DNA und Verpackungs-DNase mit ein

sensitive-measurement-mitophagy-flow-cytometry-using-ph-dependent

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein robustes Konzept für die Lieferung von Organellen in den sauren Lumen der Hefe Vakuole für den Abbau und Recycling-Monitor beschrieben. Die Methode beruht auf der spezifischen Markierung von Zielorganellen mit einem genetisch kodierten Dual-Emissions-Fluoreszenz-pH-Biosensor und Visualisierung von einzelnen Zellen mittels Fluoreszenz-Mikroskopie.

Eine Fluoreszenz-Mikroskopie Assay zur Überwachung Mitophagy in der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Beschrieben wird hier ein Verfahren zur Detektion und Quantifizierung der mitochondrialen Außenmembran-Proteine ​​durch Immunmarkierung von Mitochondrien aus Nagetiergewebe und Analyse durch Durchflusszytometrie Strom isoliert. Diese Methode kann erweitert werden, um funktionale Aspekte der mitochondrialen Subpopulationen zu bewerten.

Immundetektion von Außenmembranproteinen mittels Durchflusszytometrie von isolierten Mitochondrien

Hierin beschreiben wir detailliert einen Zeitraffer-Videomikroskopie-Ansatz zur Messung der zeitlichen Rekrutierung von EYFP-Parkin während der selektiven Entfernung geschädigter Mitochondrien. Dieser dynamische Prozess der EYFP-Parkin-abhängigen Entfernung geschädigter Mitochondrien kann unter verschiedenen experimentellen Bedingungen als Indikator für die zelluläre Gesundheit verwendet werden.

Zeitraffer-Video-Mikroskopie für die Beurteilung der EYFP-Parkin Aggregation als Marker für Cellular Mitophagie

Hier wurde die multispektrale bildgebende Durchflusszytometrie mit einem analytischen Merkmal, das helle Detailbilder von 3 Autophagie-Markern vergleicht und deren Co-Lokalisierung zusammen mit der LC3-Spotzählung quantifiziert, verwendet, um Autophagie objektiv, quantitativ und statistisch robust zu messen.

Assessing Autophagic Flux durch Messung von LC3, p62 und LAMP1 Co-Lokalisierung mittels Multispektral Imaging Flow Cytometry

Mitophagy, den Prozess der Clearing beschädigt Mitochondrien ist für mitochondriale Homöostase und Gesundheit Wartung notwendig. Dieser Artikel stellt einige der neuesten Mitophagy Nachweismethoden in menschlichen Zellen, Caenorhabditis Elegansund Mäuse.

In Vitro und In Vivo Nachweis von Mitophagy in menschlichen Zellen, C. Elegansund Mäuse

Dieser Artikel beschreibt eine leistungsfähige Methode zur Quantifizierung von Mitochondrien oder Lysosomen in lebenden Zellen. Die Kombination aus Lysosomen oder Mitochondrien-spezifische Farbstoffe mit Gewebekulturen konjugierten Antikörpern gegen Oberflächenmarker ermöglicht die Quantifizierung dieser Organellen in gemischten Zell-Populationen, wie primäre Zellen mithilfe von Gewebeproben, geerntet Multicolor Durchflusszytometrie.

Multicolor Flow Cytometry-basierte Quantifizierung der Mitochondrien, Lysosomen in T-Zellen

Xenobiotische Efflux-Pumpen sind hochaktiv in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und verursachen die Extrusion von TMRM, einem mitochondrialen Membranpotenzial fluoreszierender Farbstoff. Hier stellen wir ein Protokoll zur genauen Messung des mitochondrialen Membranpotenzials in HSPCs durch TMRM in Gegenwart von Verapamil, einem Efflux-Pumpeninhibitor, vor.

Verbesserung der Genauigkeit der zytometrischen Bewertung des mitochondrialen Membranpotenzials in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen durch die Hemmung von Efflux-Pumpen

Mitophagie ist der primäre Mechanismus der mitochondrialen Qualitätskontrolle. Die Bewertung der Mitophagie in vivo wird jedoch durch das Fehlen zuverlässiger quantitativer Assays behindert. Hier wird ein Protokoll zur Beobachtung der Mitophagie in lebenden Zellen unter Verwendung eines zellpermierten grün-fluoreszierenden Mitochondrienfarbstoffs und eines rot fluoreszierenden Lysosomenfarbstoffs vorgestellt.

Visualisierung der Mitophagie mit Fluoreszenzfarbstoffen für Mitochondrien und Lysosomen

Die Erforschung der Mitophagie durch Elektronenmikroskopie, genetische Sensoren und Immunfluoreszenz erfordert kostspielige Geräte, qualifiziertes Personal und einen erheblichen Zeitaufwand. Hier demonstrieren wir die Wirksamkeit eines kommerziellen Fluoreszenzfarbstoff-Kits bei der Quantifizierung des Mitophagie-Prozesses sowohl in Caenorhabditis elegans als auch in einer Leberkrebszelllinie.

Nachweis von Mitophagie in Caenorhabditis elegans und Säugetierzellen mit organellenspezifischen Farbstoffen

Dieses Protokoll beschreibt zwei Methoden zur quantitativen Analyse der Mitophagie in β-Zellen der Bauchspeicheldrüse: erstens eine Kombination zellpermeabler Mitochondrien-spezifischer Farbstoffe und zweitens einen genetisch kodierten Mitophagie-Reporter. Diese beiden Techniken ergänzen sich und können je nach Bedarf eingesetzt werden, was Flexibilität und Präzision bei der quantitativen Qualitätskontrolle der Mitochondrien ermöglicht.

Komplementäre Ansätze zur Untersuchung des Mitophagieflusses in β-Zellen der Bauchspeicheldrüse

Lernen Sie eine empfindliche Durchflusszytometrie-Methode zur Messung der Mitophagie in lebenden HeLa-Zellen ohne zusätzliche Färbung. Diese Technik ermöglicht schnelle Analysen mitochondrialer Dynamik.

Empfindliche Messung des Mitophagy von Flow Cytometry Verwendung der pH-abhängigen fluoreszierende Reporter Mt-Otamegane

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