Name: Ganze Zelle Elektrophysiologie des primären kultivierten murinen Enterochromaffinen Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Erfahren Sie die Elektrophysiologie einzelner Enterochromaffin-Zellen aus primären murinen Darmkulturen. Diese Methode ermöglicht detaillierte Studien zur Zellerregbarkeit und gastrointestinalen Physiologie.

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Die Autoren danken Frau Lyndsay Busby für Amtshilfe und Herr Robert Highet von Mayo Clinic Division of Engineering bei Design und 3D Druck des Kultur-Gericht-Einsatzes. Diese Arbeit wurde von NIH K08 AB (DK106456), Pilot und Machbarkeit Grant an AB von Mayo Clinic Center für Zelle signalisieren in Gastroenterologie (NIH P30DK084567) und 2015 amerikanischen gastroenterologischen Association Research Scholar Award (AGA RSA) AB und NIH unterstützt. R01, GF (DK52766).

<ol><li>Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%22normal%22+endocrine+cell+of+the+gut%3A+changing+concepts+and+new+evidences%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).</li>
<li>Rogers, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+activity-triggered+glucagon-like+peptide-1+secretion+from+primary+murine+L-cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells.</a> The Journal of Physiology. 589, Pt 5 1081-1093 (2011).</li>
<li>Strege, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+channel+NaV1.3+is+important+for+enterochromaffin+cell+excitability+and+serotonin+release%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Sodium channel NaV1.3 is important for enterochromaffin cell excitability and serotonin release.</a> Scientific Reports. 7 (15650), (2017).</li>
<li>Bellono, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterochromaffin+cells+are+gut+chemosensors+that+couple+to+sensory+neural+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways.</a> Cell. 170 (1), 185-198 (2017).</li>
<li>Alcaino, C., Knutson, K., Gottlieb, P. A., Farrugia, G., Beyder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+ion+channel+Piezo2+is+inhibited+by+D-GsMTx4%5BTitle%5D)+AND+%22Channels%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive ion channel Piezo2 is inhibited by D-GsMTx4.</a> Channels. 11 (3), 245-253 (2017).</li>
<li>Kim, M., Javed, N. H., Yu, J. G., Christofi, F., Cooke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+activates+Galphaq+signaling+pathways+and+5-hydroxytryptamine+release+from+human+carcinoid+BON+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation activates Galphaq signaling pathways and 5-hydroxytryptamine release from human carcinoid BON cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 108 (7), 1051-1059 (2001).</li>
<li>Modlin, I. M., Kidd, M., Pfragner, R., Eick, G. N., Champaneria, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+characterization+of+normal+and+neoplastic+human+enterochromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The functional characterization of normal and neoplastic human enterochromaffin cells.</a> The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (6), 2340-2348 (2006).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+ion+channel+Piezo2+is+important+for+enterochromaffin+cell+response+to+mechanical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive ion channel Piezo2 is important for enterochromaffin cell response to mechanical forces.</a> The Journal of Physiology. 595 (1), 79-91 (2017).</li>
<li>Li, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+cellular+origins+for+serotonin-expressing+and+enterochromaffin-like+cells+in+the+gastric+corpus%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Distinct cellular origins for serotonin-expressing and enterochromaffin-like cells in the gastric corpus.</a> Gastroenterology. 146 (3), 754-764 (2014).</li>
<li>Psichas, A., Tolhurst, G., Brighton, C. A., Gribble, F. M., Reimann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+primary+cultures+of+murine+small+intestine+intended+for+the+study+of+gut+hormone+secretion+and+live+cell+imaging+of+enteroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), 55687(2017).</li>
<li>Raghupathi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+unique+release+kinetics+of+serotonin+from+guinea-pig+and+human+enterochromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Identification of unique release kinetics of serotonin from guinea-pig and human enterochromaffin cells.</a> The Journal of Physiology. 591, Pt 23 5959-5975 (2013).</li>
<li>Nozawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPA1+regulates+gastrointestinal+motility+through+serotonin+release+from+enterochromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">TRPA1 regulates gastrointestinal motility through serotonin release from enterochromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3408-3413 (2009).</li>
<li>Reimann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+functional+role+of+voltage+gated+cation+conductances+in+the+glucagon-like+peptide-1+secreting+GLUTag+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line.</a> The Journal of Physiology. 563, Pt 1 161-175 (2005).</li>
</ol>

EG-Zell-Funktion vollständig zu verstehen erfordert eine qualitativ hochwertige Primärkultur Methode, Zellen für die ganze Zelle Elektrophysiologie zu generieren. Primärkulturen von GI Epithel hatte traditionell schwierig, da niedrige überleben. Linderung dieser verwirrende Faktor, ergibt das vorliegende Verfahren Kulturen der singulären EG Zellen entweder kleiner oder großer Darm, die für mehrere Tage überleben können.
Wir fanden, dass die folgenden kritischen zur Verbesserung der Qualität de...

Das gastro-intestinale (GI) Epithel ist eine vielfältige Gemeinschaft, bestehend aus mehreren Zelltypen. Enteroendocrine Zellen umfassen etwa 1 % aller epithelialen Zellen, und enterochromaffinen (EG) Zellen sind die größten Enteroendocrine Cell Bevölkerung1. Neuere Studien zeigen, dass Enteroendocrine2 und EG3,4 Zellen elektrisch erregbar sind. Wir interessieren uns für das Verständnis der primären EG Zelle Elektrophysiologie. Somit war der Zweck dieser Studie primären EG Zellkulturen für ganze Zelle Elektrophysiologie optimiert.
Bestehende EG-Zelle, die Linien, die produzieren und sezernieren 5-HT (z. B. QGP-15, BON6, KRJ-1-7) und wurden verwendet, um die Elektrophysiologie5,8 prüfen in der Regel aus generiert werden verewigt neoplastischen Gewebe. Zwar die Informationen von diesen Zelllinien wertvolle5,8, sind Studien der Primärzelle Elektrophysiologie notwendig, um richtig zu verstehen, EG Zellphysiologie. Die Elektrophysiologie des primären EG-Zellen erfordert die Isolierung und Kultur einzelner epithelialen Zellen, die durch geringe Tragfähigkeit des epithelialen Kulturen begrenzt wurde.
In dieser Studie vorgestellten Kultur-Methode stützt sich auf Transgene Mäuse mit Gewebekulturen beschrifteten EG-Zellen, wie Tph1-GFP9, in dieser Studie verwendet. Die Methode optimiert gemischte primäre epitheliale Kulturen entwickelte bereits2,10 für einzelne Zelle Elektrophysiologie3. Bisherige Methoden verwendet Kombinationen von Trypsin/EDTA plus Collagenase A oder EDTA und DVB-t für die enzymatische Verdauung und Dichtegradienten speziell isolieren und Kultur Meerschweinchen11 und Ratte EG Zellen12. Vor kurzem wurden Darm Organellen generiert und mechanisch für elektrophysiologische Aufnahmen4gestört. Kulturen, die mit diesen Methoden eignen sich gut für Serotonin lassen Sie Experimente, RT-qPCR Analyse und, während sie für Elektrophysiologie, verwendet werden können sind angewiesen auf den Erfolg der Zeit raubende organoide Generation, Dichtegradienten, EG-Zellen zu identifizieren und die zelluläre störende Wirkung von Trypsin und EDTA. Im Gegensatz dazu das hier beschriebene Protokoll verbessert die enzymatische und mechanische Behandlungen Kultivierung Bedingungen optimiert und rationalisiert Verfahren um Einzel- und gesunde EG-Zellen für die hohen zellulären Standards für Elektrophysiologie benötigt zu produzieren.
Diese Methode ist nützlich für Wissenschaftler, die primären EG-Zellen in Mischkulturen statt verewigt Kulturen arbeiten möchten und die Elektrophysiologie einzelner Zellen untersuchen möchten. Es könnte jedoch weniger geeignet für das Studium Zell-Populationen, die Sortier- oder langfristige Kulturen benötigen, die letzten 72 h Überleben benötigen.

<table><tbody><tr><td>100 mm x 15 mm Kulturschale</td><td>Corning (Falcon)</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipette</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>10 mL serologische Pipette</td><td>Corning (Falcon)</td><td></td><td></td>357551</tr><tr><td>50 mL konisches</td><td>Corning (Falke)</td><td></td><td></td>352098</tr><tr><td>15 mL konisches</td><td>Corning (Falke) &nbsp;</td><td></td><td></td>352097</tr><tr><td>1.000 mL Barriere-Pipettenspitzen</td><td>Thermo Scientific (Art)</td><td>2079E</td><td>Steril halten</td></tr><tr><td>MatTek Glasbodenschalen</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Steril halten</td></tr><tr><td>Mikrodissektionszangen - sehr feine, extra lange Spitzen</td><td>Feine wissenschaftliche Werkzeuge</td><td>SB12630M</td><td></td></tr><tr><td>chirurgische Scheren scharf</td><td>Nasco</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodissektionsschere</td><td>Nasco</td><td>SB46568M</td><td></td></tr><tr><td>Monoject Hypo Nadel, 21 G x 1" A, 100/BX</td><td>Covidien</td><td>8881250172</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mäuse</td><td>Jackson</td><td>Lager # 028366</td><td>Verwenden Sie männliche oder weibliche Mäuse im Alter von 4-7 Wochen</td></tr><tr><td>Microfil nichtmetallische Spritzennadeln (34 Gauge, 67 mm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm "M" Laborfolie</td><td>Pechiney Kunststoffverpackung</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R6101</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 mL Spritze mit regulärer Luer-Spitze</td><td>Monoject</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 mL Spritze mit normaler Luer-Spitze</td><td>Monoject</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektrophysiologie Geräte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Datenerfassungssystem (daq)</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Signalkonditionierer</td><td>Molecular Devices</td><td>CyberAmp 320</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10.6</td><td></td></tr></tbody></table>

ganze zelle elektrophysiologie des primären kultivierten murinen enterochromaffinen zellen

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Enterochromaffinen (EG) Zellen in der gastro-intestinale (GI) Epithel bilden die größte Subpopulation von Enteroendocrine Zellen. Als spezialisierte Sinneszellen EC-Zellen spüren luminalen Reize und wandeln sie in Serotonin (5-Hyroxytryptamine, 5-HT) Release Events. Allerdings ist die Elektrophysiologie dieser Zellen schlecht verstanden, weil sie schwer zu Kultur und zu identifizieren sind. In diesem Papier Umrisse primären EG Zellkulturen vorgestellte Methode optimiert für einzelne Zelle Elektrophysiologie. Dieses Protokoll nutzt einen transgene Cyan fluoreszierenden Proteins (GFP) Reporter um EG Mauszellen in primären Mischkulturen, Förderung des Ansatzes auf die Erlangung von qualitativ hochwertigen Aufnahmen der ganzen Zelle Elektrophysiologie in Spannung und Strom-Klemme Modi zu identifizieren.

Kulturen: Primären murine Epithelzellen gebildet aus einem transgenen Tph1-GFP-Modell beimessen Gerichte nach 4 Stunden und sind bereit für physiologische Experimente zwischen 24 bis 72 h. Wenn Kulturbedingungen nicht optimiert wurde, bestand die Epithelzelle Kultur große Horste, schwebenden zelltrümmer, beschädigte Membranen und GFP-schwach in den EG-Zellen (Abb. 1A). Kulturen, die für Elektrophysiologie optimiert wurden ...

Enterochromaffinen (EG) Zellen umfassen eine kleine Teilmenge der Magen-Darm-Epithelzellen. EG-Zellen elektrisch erregbar sind und Serotonin, noch Schwierigkeiten bei der Kultivierung und Identifizierung von EG-Zellen physiologische Studien beschränkt haben. Die hier vorgestellte Methode stellt eine Primärkultur Modell zur Untersuchung von Einzelzellen EG zugänglich durch Elektrophysiologie.

Ganze Zelle Elektrophysiologie des primären kultivierten murinen Enterochromaffinen Zellen

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der enterischen Neurowissenschaft und Magen-Darm-Physiologie zu beantworten, wie, was sind die Mechanismen der Enterochromaffin-Zellerregbarkeit und Reaktion auf luminale Reize, und was sind die Mechanismen der Magen-Darm-Hormon-Freisetzung? Der Hauptvorteil dieser Technik ist es uns, enterochromaffin-Zellen mit einzelligen Techniken wie der Elektrophysiologie im Detail zu untersuchen. Demonstriert wird das Verfahren von den Co-Erstautoren Kaitlyn Knutson und Peter Strege, den herausragenden Technologen, die diese Techniken entwickelt haben.Um dieses Verfahren zu beginnen, legen Sie eine sechs Milliliter Spritzennadel gefüllt mit eiskaltem PBS in das Lumen des extrahierten Darmsegments. Verwenden Sie die Mikrodissektionszangen, klemmen und versiegeln Sie den Darm um die Spritzennadel und spülen Sie vorsichtig sechs Milliliter PBS durch das Lumen, um fäkalien Stoffe wegzuspülen. Als nächstes invertieren Sie das Darmgewebe, indem Sie die Mikrodissektion sanft durch das Lumen weben, eine Darmwand kneifen und das Gewebe proximal an die Spitze der Zange zurückziehen.Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das Segment von innen nach außen mit dem

whole-cell-electrophysiology-primary-cultured-murine-enterochromaffin

Research

Forschung

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Biology

Biologie

Kv-Kanal Dysfunktion ist mit Herzrhythmusstörungen verbunden. Um zu untersuchen, die molekularen Mechanismen, die zu solchen Arrhythmien nutzen wir eine systematische Protokoll zur Isolierung von atrialen und ventrikulären Kardiomyozyten aus Kv Kanal Nebenleistungen Untereinheit Knockout-Mäusen führen. Isolierte Herzmuskelzellen kann dann sofort für zellulare elektrophysiologische Studien, biochemischen oder Immunfluoreszenz (IF)-Assays verwendet werden.

Isolierung und Kv Kanal Recordings in Murine atriale und ventrikuläre Kardiomyozyten

Arginin-Vasopressin (AVP) steuert Feinabstimmung der Körper Wasser Homöostase durch die Erleichterung Wasserreabsorption durch renale Hauptzellen. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Kultivierung von primären Ratten inneren medullären Sammelkanal Zellen geeignet für die Aufklärung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen AVP-vermittelten Wasserreabsorption.

Kultivierung primären Ratten Inner Medulläre Sammelkanal Cells

Wir demonstrieren ein Zellkulturprotokoll für die direkte Untersuchung von neuronalen und glialen Komponenten des enterischen Nervensystems. Eine Neuron/Glia-Mischkultur auf Deckgläsern wird aus dem myenterischen Plexus einer adulten Maus hergestellt und bietet die Möglichkeit, die Funktion einzelner Neuronen und Gliazellen elektrophysiologisch, immunhistochemisch usw. zu untersuchen.

Ein<em&gt; In-vitro</em&gt; Vorbereitung von isolierten Neuronen und Glia Enteric vom Plexus myentericus der erwachsenen Maus

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Durchführung elektrophysiologischer Einzelfaser-Aufzeichnungen an einem in vitro Maus-Darmnervenpräparat.

In-vitro-Funktionelle Charakterisierung von Maus Colorectal Afferente Endings

Sobald aus dem Körper entfernt wird neuronalem Gewebe stark durch Umweltbedingungen beeinflusst, den späteren Abbau des Gewebes führt nach 6 - 8 h. Unter Verwendung einer einzigartigen Inkubationsverfahren, die eng überwacht und reguliert die extrazelluläre Umgebung des Gewebes kann Gewebeviabilität deutlich&gt; 24 h ausgedehnt werden.

Längerer Inkubation von Akute neuronales Gewebe für Elektrophysiologie und Calcium-Bildgebung

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von gemischten murine kleinen Darmzellen. Diese primären intestinalen Kulturen ermöglichen die Untersuchung von Signalwegen zugrunde liegenden Darmpeptid die Sekretion einer Reihe von Techniken.

Gemischte Primärkulturen von Murine Duenndarm bestimmt zur Untersuchung von Gut Hormonausschüttung und Live Cell Imaging von enteroendokrinen Zellen

Wir präsentieren ein Protokoll, das Zellisolation und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung kombiniert, um die elektrischen Eigenschaften der primär dissoziierten Epithelzellen aus den Ratten-Cauda-Epididymiden zu messen. Dieses Protokoll erlaubt die Untersuchung der funktionellen Eigenschaften von primären epididymalen Epithelzellen, um die physiologische Rolle des Nebenhodens weiter zu erforschen.

Ganzzellige Patch-Clamp Aufnahmen von isolierten primären Epithelzellen aus dem Epididymis

Wir beschreiben eine Methode zur Herstellung der einzelnen frisch isolierten Detrusor glatten Muskelzellen aus menschlichen Harnblasenproben mit einem zweistufigen enzymatischen Verfahren. Die erhaltenen lebensfähigen DSM-Zellen können mit verschiedenen Einzelzelltechniken untersucht werden, einschließlich der beschriebenen Amphotericin-B-Patch-Clamp-Elektrophysiologie, um physiologische und pharmakologische Eigenschaften aufzudecken.

Vorbereitung und Nutzung von frisch isolierten menschlichen Detrusor glatte Muskelzellen für die Charakterisierung von 9-Phenanthrol-Sensitive KationStröme

Wir stellen die Methodik zur Isolierung von murinen Myozyten vor und wie Spannungs- oder Kalziumspuren gleichzeitig mit Sarcomere-Verkürzungsspuren mittels Fluoreszenzphotometrie mit gleichzeitigen Messungen der digitalen Zellgeometrie erhalten werden können.

Optische Bildgebung von isolierten ventrikulären Myozyten

Dieses Protokoll beschreibt ein konfokales Bildgebungsverfahren zum Nachweis von drei Fusionsmodi in rindischen Nebennierenchromaffinzellen. Diese Fusionsmodi umfassen 1) Close-Fusion (auch Kiss-and-Run genannt), bei der sich die Fusionspore öffnet und schließt, 2) Stay-Fusion, bei der die Fusionspore geöffnet und die geöffnete Pore erhalten bleibt, und 3) Shrink-Fusion, einschließlich der Schrumpfung der fusionierten Vesikel.

Konfokale Mikroskopie zur Messung von drei Modi der Fusionsporendynamik in Nebennierenchromaffinzellen

Diese Studie skizziert ein Protokoll zur Erzeugung von 2D-Monolayern von Schweineorganoiden, die aus dem Dünn- und Dickdarm stammen. Das Wachstum dieser Monoschichten ist durch steigende TEER-Werte gekennzeichnet, was auf eine robuste epitheliale Integrität hinweist. Darüber hinaus zeigten diese Monoschichten physiologische sekretorische Reaktionen in Ussing-Kammerexperimenten nach der Anwendung von Forskolin.

Zweidimensionale Organoide des Schweine-Darms, die die physiologischen Eigenschaften des nativen Darms widerspiegeln

Erfahren Sie die Elektrophysiologie einzelner Enterochromaffin-Zellen aus primären murinen Darmkulturen. Diese Methode ermöglicht detaillierte Studien zur Zellerregbarkeit und gastrointestinalen Physiologie.

Ganze Zelle Elektrophysiologie des primären kultivierten murinen Enterochromaffinen Zellen

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