Platte-basierte Large-Scale Anbau von Caenorhabditis Elegans: Probenvorbereitung für die Studie von Stoffwechselveränderungen bei Diabetes
24. August 2018
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für den großflächigen Anbau von Caenorhabditis Elegans auf festen Medien. Als Alternative zu flüssigen Kultur ermöglicht dieses Protokoll Parameter der verschiedenen Maßstäben Platte-basierte Anbaufläche zu erhalten. Dies erhöht die Vergleichbarkeit der Ergebnisse durch den Verzicht auf die morphologischen und metabolische Unterschiede zwischen flüssigen und festen Medienkultur.
Im Bereich C.elegans kann diese Methode helfen, Schlüsselfragen zu beantworten, die die Herstellung großer Nematodenpopulationen und Proben mittels Plattenkultur erfordern. Die Hauptvorteile dieses Protokolls sind seine einfache Einrichtung und seine einfache Beschreibung, einschließlich Fallstricke und Anwendungen. Nachdem Sie eine synchronisierte Population von Nematoden erhalten haben, fügen Sie den Platten etwa einen Milliliter M neun Puffer hinzu und verteilen Sie den Puffer vorsichtig durch Schwingen der Platten.
Sammeln Sie danach die Nematoden in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Drehen Sie nun das Röhrchen um und verwenden Sie ein Mikroskop, um die Dichte der Nematoden zu bestimmen. Passen Sie die Dichte der Suspension nach Bedarf an und setzen Sie die Bewertung unter dem Mikroskop fort.
Tragen Sie 150 Mikroliter der Suspension direkt auf die Platten mit modifizierten Pipettenspitzen auf. Um eine gleichmäßige Verteilung der Nematoden zwischen den Platten zu gewährleisten, drehen Sie das Suspensionsröhrchen in regelmäßigen Abständen um. Zuerst waschen Sie die Nematoden mit einer modifizierten Pipettenspitze mit etwa 500 Mikrolitern M neun Puffer.
Mit demselben Puffer die Nematoden so lange ablösen, bis die meisten Tiere in Suspension eingesammelt sind. Nehmen Sie dann die Nematoden mit einer modifizierten Pipettenspitze auf und übertragen Sie sie auf eine Platte mit OP50. Die modifizierten Pipettenspitzen verringern die Scherspannung und die Schädigung der Nematoden durch einen größeren Durchmesser.
Lassen Sie die Platte dann trocknen. Bereiten Sie vor der Probenentnahme flüssigen Stickstoff vor, um die gesammelten Nematoden einzufrieren. Legen Sie dann M neun Puffer auf Eis.
Tragen Sie einen Milliliter M neun Puffer auf jede Platte auf und schwenken Sie sie vorsichtig, um jede Platte zu waschen. Nehmen Sie dann das Volumen von M neun Puffer auf und übertragen Sie es in neue 15-Milliliter-Röhrchen. Das Röhrchen wird kurz bei 800 μg zentrifugiert, bevor der größte Teil des M nine-Puffers entfernt wird.
Waschen Sie die Proben anschließend dreimal mit 10 Millilitern M neun Puffer, um eventuelle Bakterien zu entfernen. Füllen Sie jedes Pellet mit einer Glaspipette in ein leeres 1,5-Milliliter-Röhrchen. Nehmen Sie mit der Glaspipette einen Milliliter M neun Puffer aus dem zweiten 1,5-Milliliter-Röhrchen auf, um die Nematoden von der Pipettenwand zu spülen.
Waschen Sie dann die restlichen Nematoden aus den 15-Milliliter-Röhrchen und geben Sie sie in die Probenröhrchen. Anschließend werden die Probenröhrchen eine Minute lang bei 19.000 g zentrifugiert und so viel Überstand wie möglich entfernt. Verschließen Sie dann jedes Röhrchen mit Paraffinfolie und frieren Sie es sofort in flüssigem Stickstoff ein.
Lagern Sie die Röhrchen bis zur Lysatherstellung bei minus 80 Grad Celsius. Geben Sie das gleiche Volumen an 0,5-Millimeter-Zirkoniumoxidkügelchen und das doppelte Volumen an Lysatpuffer mit Proteinase-Inhibitor-Cocktail zu jeder gefrorenen Probe. Legen Sie dann die Röhrchen für eine Minute auf Stufe neun in einen Homogenisator.
Zentrifugieren Sie die Proben 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius und 19.000 g Celsius. Zum Schluss wird der Überstand in ein neues Röhrchen auf Eis umgefüllt und bei minus 80 Grad Celsius für zukünftige Experimente gelagert. In diesem Protokoll wurden große Mengen von C.elegans für Anwendungen in der Diabetesforschung kultiviert.
Die Anzahl der gesammelten Nematoden korrelierte mit der Proteinausbeute des Lysats, was zeigt, dass mit diesem Protokoll eine reproduzierbare quantitative Proteinisolierung erreicht werden kann. Massenspektrometrische Analysen des reaktiven Metaboliten Methylglyoxal und fortgeschrittener Glykationsendprodukte, die durch Methylglyoxal-Exposition gebildet werden, sind hier dargestellt. Glukosebehandelte Nematoden und Kontrollen wurden verglichen.
Die Übertragung von Nematoden über eine Pipette kann zu Scherspannungen führen, die den Nematoden schaden können. Die oxidativen Stressniveaus bei pipettierten Nematoden und Nematoden, die mit einem Metalldraht übertragen wurden, unterschieden sich bei Verwendung dieses Protokolls nicht. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Western Blot durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen in der Proteomik zu beantworten.
Dieses Protokoll erleichtert auch Experimente, die mehrere Parameter mit derselben Population in Beziehung setzen.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur großflächigen Kultivierung von Caenorhabditis elegans auf festen Medien. Dieser Ansatz erleichtert die Erzeugung großer Nematodenpopulationen und -proben und verbessert dadurch die Vergleichbarkeit der Ergebnisse.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Entwicklungsbiologie
- Mikrobiologie
Hintergrund
- Caenorhabditis elegans ist ein weit verbreitetes Modellorganismus.
- Die kultivierung auf Platten bietet Vorteile gegenüber Flüssigkultur.
- Das Verständnis der Populationsdynamik von Nematoden ist entscheidend für verschiedene Forschungsanwendungen.
- Diese Methode befasst sich mit zentralen Fragen im Bereich C. elegans.
Zweck der Studie
- Etablierung eines zuverlässigen Protokolls zur Kultivierung von C.elegans auf festem Medium.
- Möglichmachung der Erzeugung synchronisierter Nematodenpopulationen.
- Erleichterung von Experimenten, die große Stichprobengrößen erfordern.
Verwendete Methoden
- Synchronisierung von Nematodenpopulationen.
- Anwendung von M-neun-Puffer auf Platten.
- Mikroskopische Auswertung der Nematodendichte.
- Anpassung der Suspensionsdichte nach Bedarf.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Einrichtung von großtechnischen Nematodenkulturen.
- Verbesserte Vergleichbarkeit von Ergebnissen aus plattenbasierten Kultivierungsverfahren.
- Identifizierung potenzieller Fallstricke im Protokoll.
- Anwendungen in verschiedenen Forschungskontexten.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll stellt eine robuste Methode für die Kultivierung von C.elegans bereit.
- Es verbessert die Möglichkeit, Experimente im großen Maßstab durchzuführen.
- Die Methode ist einfach und reproduzierbar.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Die großtechnische Kultivierung von C. elegans ermöglicht eine reproduzierbare, quantitative Proteinisolierung zur Entdeckung diabetesbezogener Biomarker und unterstützt die Zielvalidierung bei neurodegenerativen Komplikationen. Diese Methode stellt einen skalierbaren, scherbelastungsminimierten Arbeitsablauf für die proteomische Analyse von AGEs und ROS bereit, der direkt für die mechanistische Risikominimierung in der frühen Arzneimittelentwicklung anwendbar ist. Durch die Erleichterung einer synchronisierten Populationsvorbereitung unter kontrollierten Bedingungen wird das Vorhersagevertrauen in präklinischen Modellen diabetischer Pathologie erhöht.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, die eine Verbindung zwischen Glukoseexposition und der Bildung von AGEs und reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in neuronalen Modellen herstellen.
- Operationaler Wert: Unterstützt die funktionelle Zielstruktur-Validierung durch reproduzierbare Korrelation des Proteinertrags mit der Anzahl der Nematoden.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die Selektion von Projekten durch die Bereitstellung quantitativer proteomischer Daten zur Identifizierung aussichtsreicher Kandidaten in Signalwegen von Diabeteskomplikationen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Anwendungen wie Western Blot und Massenspektrometrie vor.
- Reproduzierbarkeit: Standardisiert die Probenvorbereitung, um den physiologischen Einfluss zu minimieren und konsistente proteomische Ergebnisse sicherzustellen.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Integration mehrerer Analysen unter identischen Kultivierungsbedingungen für die Kompatibilität mit Hochdurchsatz-Screenings.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Unterstützt die Untersuchung diabetischer Komplikationen mithilfe von C. elegans-Modellen, die die Anreicherung von AGE und ROS unabhängig von vaskulären Störfaktoren aufweisen.
- Übersetzungsrelevante Kontinuität: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Validierung, indem eine konsistente Probenvorbereitung über verschiedene experimentelle Bedingungen hinweg ermöglicht wird.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Stellt zuverlässige Lysate für die Biomarkeranalyse bereit und reduziert falsch-positive Ergebnisse bei der Zielstruktur-Priorisierung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode ist in der Entdeckungskette von der Hypothesenprüfung über die Identifizierung von Leitstrukturen bis hin zur präklinischen Validierung verankert und unterstützt speziell die Forschung zur diabetesbedingten Neurodegeneration.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung metabolischer Veränderungen bei Diabetes durch quantitative Analyse von Proteinen und Metaboliten.
- Screening: Liefert assaysbereite Proben mit standardisierter Dichte und minimaler Scherbelastung für eine zuverlässige Wirkstoffbewertung.
- Analytik: Ermöglicht die massenspektrometrische Messung von Methylglyoxal und AGEs und liefert quantitative Ergebnisse für den Vergleich von Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckung neuronaler Phänotypen mit der präklinischen Kontinuität durch konsistente proteomische Workflows.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für den großskaligen Anbau von Nematoden in mehreren diabetesbezogenen Studien.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem mechanistische Unschärfen in Modellen diabetischer Komplikationen reduziert werden.
- Operationaler Wert: Stellt Standardisierung und Reproduzierbarkeit über alle proteomischen Arbeitsabläufe hinweg sicher und minimiert Variabilität bei der Lysatzubereitung.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen durch verlässliche Biomarkerdaten und verringert biologische Risiken in fortgeschrittenen Stadien von Diabetesprogrammen.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Targets basierend auf reproduzierbaren Daten zur Modulation von AGE und ROS.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit C. elegans und in Synchronisationstechniken.
- Setzt Zugang zu Zentrifugen, Homogenisatoren und flüssigem Stickstoff für die Probenvorbereitung voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der Beurteilung der Suspensionsdichte und bei Waschprotokollen.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen beim Wechsel zwischen Platten mit unterschiedlichen experimentellen Bedingungen.
- Umfasst praktische Einschränkungen im Zusammenhang mit der Verringerung von Scherkräften während der Pipettierschritte, die durch modifizierte Pipettenspitzen adressiert werden.
Biopharma-Häufige Fragen
Chapters in this video
0:04
Title
0:27
Large Scale Culture on Plates
1:15
Transfer of Large Amounts of Caenorhabditis elegans
1:52
Harvest of a Large Caenorhabditis elegans Sample
3:20
Protein Isolation for Mass Spectrometry
3:56
Results: Reproducible Quantitative Protein Isolation and Further Applications of Large-scale C. elegans Culture
4:47
Conclusion
