Name: Die Generation der geschlossenen femoralen Frakturen bei Mäusen: ein Modell zur Knochenheilung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Lernen Sie die Erzeugung geschlossener Femurfrakturen bei Mäusen zur Untersuchung der Knochenheilung. Dieses minimalinvasive Verfahren ermöglicht standardisierte Frakturen für die Entwicklung neuer Therapiestrategien.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Department of Defense (DoD) uns Army Medical Research und Materiel Command (USAMRMC) vom Kongress gerichtet Medical Research Programme (CDMRP) (PR121604) und das National Institute of Arthritis und Muskel-Skelett und Hautkrankheiten (NIAMS), NIH R01 AR068332, Uma Sankar.

Die folgende Prozedur wurde mit Genehmigung der Indiana Universität Schule von Medizin institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) durchgeführt. Alle überleben Operationen wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt, wie von den NIH-Richtlinien beschrieben. Schmerzen und Infektionsrisiko verwaltet wurden mit richtigen Schmerzmittel und Antibiotika, um ein erfolgreiches Ergebnis zu gewährleisten.
1. Anästhesie und Vorbereitung
<ol><li>Wiegen Sie die Maus und Betäuben sie mit einer Mischung von Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) verabreicht über die intraperitoneal (i.p.)-Route. Platzieren Sie den Mauszeiger in einem leeren Käfig und zu überwachen Sie, bis es vollständig sediert ist.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Maus mit einer Zehe Prise Reflex sediert ist. Gelten Sie ophthalmologische Salbe für die Augen, sie zu schützen vor dem Austrocknen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Fell aus der rechten Extremität. Wischen Sie die Operationsstelle mit ein jodhaltiges Gestrüpp und 70 % Ethanol. Scheuern der Operationsstelle beginnend in der Mitte des Knies und eine kreisförmige Schwung nach außen zu machen. Wiederholen Sie diese 3 X mit frischen Peelings, endend mit 70 % igem Ethanol.</li>
	<li>Verwalten Sie eine präoperative Dosis von Buprenorphin-Hydrochlorid Analgesie (0,03 mg/kg) subkutan für die unmittelbare postoperative Schmerztherapie.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger auf ein Heizkissen, bedeckt von einem sterilen op Pad.</li>
</ol>2. chirurgische Vorgehen
Hinweis: Vor dem Bruch, sollte das Gewicht und der Fallhöhe empirisch für die spezifische Belastung, Alter und Geschlecht der Mäuse vor der Operation bestimmt werden. Dieses Operationsverfahren ist optimiert für C57BJ6 männliche Mäuse im Alter von 10 Wochen.
<ol><li>Platzieren Sie den Mauszeiger auf den Rücken und die Knie des operativen Beines flex. Mit einem Skalpellklinge, machen Sie einen 1,5 cm Schnitt mittig über dem Kniegelenk.</li>
	<li>Seitlich zu verdrängen die Patella mit Pinzette, um das distale Ende des Oberschenkelknochens verfügbar zu machen. Einfügen einer 1,5 - In langen 25-Gauge Edelstahl Injektionsnadel in der Mitte der trochlear Nut über die gesamte Länge des medullären Kanals in gewissem Sinne retrograde und durch das proximale Ende des Oberschenkelknochens. Nehmen Sie eine Röntgenaufnahme, die richtige Platzierung des Stiftes zu gewährleisten. Hinweis: Die Nadel sollte die dorsale Seite der Maus zum Erstellen eines Pfads für den Führungsdraht verlassen.</li>
	<li>Übergeben Sie ein 4 - In-lange 36-Gauge Wolfram Führungsdraht durch die Welle der Nadel, durch das Drehkreuz am distalen Femur betreten und verlassen der Abschrägung an der dorsalen Seite der Maus.</li>
	<li>Entfernen Sie nach der erfolgreichen Platzierung der Führungsdraht vorsichtig die 25-Gauge-Nadel durch leichtes Ziehen an der Nabe während der Extremität und der Führungsdraht in Position zu halten. Bestätigen Sie die Platzierung der Führungsdraht durch Röntgen.</li>
	<li>Halten Sie ein 391 g Gewicht aus einer Höhe von 34,6 cm über die Auswirkungen Disc (Abbildung 1A). Unterstützt die Position der Femur horizontal über die beiden Punkte, so dass die intertrochanteric und Supracondylar Regionen des Oberschenkelknochens auf Unterstützung Ambosse (Abbildung 1 b) und die laterale Seite des Gliedes die Ladestelle (Abbildung 1 steht ). Fallen Sie das Gewicht, und entfernen Sie vorsichtig die Maus aus dem Gerät sofort nach der Fraktur.</li>
	<li>Bestätigen Sie den Bruch Speicherort durch Röntgen.</li>
	<li>Fügen Sie subkutane 24-Gauge edelstahlleitungen über den Führungsdraht den gebrochenen Oberschenkelknochen zu stabilisieren. Hinweis: Diese Anwendung kann einige Kraftaufwand erfordern, wie der Einstieg mit Hilfe einer Nadel mit einem kleineren Durchmesser generiert wurde. Dieser Unterschied im Durchmesser verhindert wirksam eine mögliche Migration der 24-Spur-Stange durch das proximale Ende des Oberschenkelknochens. Die Tiefe der Einfügung kann manuell während der stumpfe Schlauch die Kortikalis des Trochanter Major trifft spüren.</li>
	<li>Bestätigen Sie die Position der Stahl-Stab und die Stabilisierung des gebrochenen Femur von x-ray vor dem Entfernen der Führungsdraht.</li>
	<li>Schneiden Sie die überschüssige Schläuche am distalen Ende des Oberschenkelknochens mit Drahtschneider. Begrabe den freiliegenden Schläuche unter der Oberfläche der Kondylen mit Pinzette, eine sanftere Kraft nach unten, ohne dabei das Kniegelenk verrücken anzuwenden.</li>
	<li>Positionieren Sie die Patella mit Pinzette. Schließen Sie die Schnitt-Website mit einer 5-0 resorbierbaren Naht.</li>
</ol>3. die Nachbehandlung
<ol><li>Nach der Operation können die Mäuse mit bis zu 500 µL steriler Kochsalzlösung über die i.p.-Route, um sie in ihre postoperative Genesung unterstützen injiziert werden.</li>
	<li>Überwachen Sie die Tiere auf einem beheizten Erholung Bett, bis sie von der Operation zu wecken. Wenn ambulante, kehren sie an ihren Käfig.</li>
	<li>Weiterhin aufmerksam verfolgen die Mäuse für mehrere Tage nach der Operation, damit sie richtig heilen und Mobilität wiederzuerlangen. Verwalten Sie Buprenorphin-Hydrochlorid Analgesie (0,03 mg/kg) subkutan alle 6 h für 3 Tage nach der Operation und nach Bedarf danach. Vermeiden Sie die Verwendung von nicht-steroidalen Antirheumatika (NSAR), da sie nachweislich beeinträchtigt Knochenheilung nach der Operation.</li>
</ol>

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<li>Histing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+internal+locking+plate+to+study+intramembranous+bone+healing+in+a+mouse+femur+fracture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">An internal locking plate to study intramembranous bone healing in a mouse femur fracture model.</a> Journal of Orthopaedic Research. 28 (3), 397-402 (2010).</li>
<li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+internal+fixation+of+femoral+fractures+in+mice%3A+impact+of+stability+on+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechistry%22%5BJournal%5D)">A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing.</a> Journal of Biomechistry. 41 (8), 1689-1696 (2008).</li>
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<li>McBride-Gagyi, S. H., McKenzie, J. A., Buettmann, E. G., Gardner, M. J., Silva, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp2+conditional+knockout+in+osteoblasts+and+endothelial+cells+does+not+impair+bone+formation+after+injury+or+mechanical+loading+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Bmp2 conditional knockout in osteoblasts and endothelial cells does not impair bone formation after injury or mechanical loading in adult mice.</a> Bone. 81, 533-543 (2015).</li>
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</ol>

Die Autoren dieser Handschrift haben nichts preisgeben. Die weiteren Autoren, die es keine Beschränkungen für den vollen Zugriff auf alle Materialien, die in der Studie berichtet in diesem Manuskript verwendet gibt.

Dieses chirurgische Verfahren soll standardisierten geschlossenen femorale Frakturen bei Mäusen zu generieren. Ein wichtiger Vorteil dieses Modells ist, dass die interne Fixation nach der Generierung der Fraktur, wodurch eine Winkelung der intramedullären Stange stattfindet. Vielleicht ist der wichtigste Aspekt dieses Protokolls die Generation einer standardisierten quer Fraktur an der femoralen Midshaft, da die Fraktur-Geometrie ist abhängig von der angewandten Biegekraft und die Positionierung der hinteren Extremität. ...

Frakturen gehören zu den häufigsten Verletzungen am Bewegungsapparat auftreten und sind verbunden mit einer enormen sozio-ökonomischen Belastung, einschließlich der Behandlungskosten, die projiziert werden, um die $ 25 Milliarden jährlich in den Vereinigten Staaten1übertreffen, 2. Obwohl die Mehrheit der Frakturen ohne Zwischenfälle heilen, ist die Heilung mit erheblichen Ausfallzeiten und Produktivitätsverluste verbunden. Etwa 5-10 % aller Frakturen führen eine verzögerte Heilung oder Pseudarthrose, aufgrund des Alters oder andere zugrunde liegende chronische Krankheiten wie Osteoporose und Diabetes Mellitus3,4,5. Keine FDA-zugelassene pharmakologischen Behandlungen gibt es derzeit zu fördern, effiziente Knochenheilung und Recovery-Zeit zu verkürzen.
Frakturheilung ist ein komplexer und sehr dynamischen Prozess unter Einbeziehung der Koordination mehrerer Zelltypen. Daher ist ein umfassendes Verständnis der zellulären und molekularen Ereignisse im Zusammenhang mit Knochenregeneration entscheidend zur Identifizierung der therapeutischen Ziele, die diesen Prozess beschleunigen. Als mit anderen menschlichen Krankheiten ist die Einrichtung sehr zugänglich und reproduzierbare Tiermodell entscheidend in der Studie der Knochenheilung. Größere Tiere wie Schafe und Schweine haben Knochen umgestaltet Eigenschaften und Biomechanik ähnlich wie beim Menschen, aber sind teuer, erfordern erhebliche heilende Zeit und sind nicht ohne weiteres zugänglich Genmanipulation6. Auf der anderen Seite bieten kleiner Tiermodelle, wie Ratten und Mäuse, viele Vorteile, unter anderem eine einfache Handhabung, geringe Kosten für Wartung, kurze Zuchtzyklen und eine kürzere heilende Zeit7. Darüber hinaus ist die Maus Genom vollständig sequenziert und ermöglicht die schnelle Manipulation und Erzeugung der genetischen Varianten. Somit ist die Maus ein leistungsfähiges Modellsystem menschlichen Erkrankungen, Verletzungen, zu studieren und8reparieren. Beim Menschen erhöhen Begleiterkrankungen wie Osteoporose und Diabetes Mellitus die Wahrscheinlichkeit für eine verzögerte Heilung. Eine Reihe von vorhandenen Maus-Modelle sind zur Untersuchung der Auswirkungen von Folgeerkrankungen wie Osteoporose und Diabetes Mellitus auf Knochen Verletzung und Heilung. Patienten mit Osteoporose haben eine deutlich verminderte Knochenbildung während der neueren Stadien der eine Frakturheilung9. Ovariectomized (OVX) Mäusen weisen raschem Knochenverlust und verzögerte Knochenheilung ähnlich wie bei postmenopausalen Osteoporose10,11beobachtet. Darüber hinaus imitieren viele Mausmodelle vom Typ I und Typ II-Diabetes, die niedrigen Knochen Masse Phänotypen und beeinträchtigt Frakturheilung in Menschen11gesehen. Darüber hinaus murinen Fraktur Modelle dienen als eine vielseitige Plattform, die komplexe biologische Prozesse, die in die Hornhaut zu studieren und erforschen neue therapeutische Strategien, die Knochen Geweberegeneration beschleunigen.
Trotz der Unterschiede in der Knochenstruktur und des Stoffwechsels, den Gesamtprozess der Knochenbruch Heilung bleibt sehr ähnlich bei Mäusen und Menschen, bei denen eine Kombination aus Endochondral und intramembranous Verknöcherung gefolgt von Knochenaufbau. Endochondral Verknöcherung umfasst die Rekrutierung von Vorläuferzellen zu weniger mechanisch stabilen Regionen rund um den frakturspalt, wo sie in Chondrozyten, die Hypertrophie und mineralisieren die Knorpel differenzieren um einen weichen Kallus zu produzieren. Die zweite Welle der Vorläuferzellen der Kallus zu infiltrieren und differenzieren in Reife Osteoblasten, die neuen Knochen Matrix12,13,14,15absondern. Während intramembranous Verknöcherung Vorfahren auf der periostalen und endosteal Oberflächen direkt in Matrix sezernierenden Osteoblasten differenzieren und erleichtern die Überbrückung der Fraktur Lücke9,11,12 ,13. Zusammen, führen die Endochondral und intramembranous Verhärtungen zu die Entwicklung der eine harte Schwiele, die im Laufe der Zeit einen starke sekundäre Knochen in der Lage, mechanische Belastungen13,14 bilden weitere umgebaut ist ,15. Bei gesunden Menschen dauert der Heilungsprozess ca. 3 Monate, verglichen mit nur 35 Tage in Mäusen16.
Frakturheilung ist häufig mit entweder offen oder geschlossen chirurgische Modelle17untersucht worden. Offen chirurgische Ansätze, wie die Erzeugung von einer kritischen Größe defekt oder vollständige Osteotomie, standardisieren die Verletzung Lage und Geometrie, Abweichungen von zerkleinertem Frakturen verursacht zu reduzieren. Osteotomien dienen als ein hervorragendes Modell den zugrunde liegende Mechanismus hinter einer Pseudarthrose zu studieren, weil Heilung oft verzögert, ist im Vergleich zu geschlossenen Frakturen. Darüber hinaus ist eine starre Fixateur externe erforderlich zur Stabilisierung der osteotomized Knochens, was bedeutet, dass die Regeneration in erster Linie von der intramembranous Verknöcherung abhängen. Offen chirurgische Ansätze Nutzung Geräte wie Verriegelung Nägel, stiftklemmen und Verriegelung Platten zur axialen und Rotations Stabilität der gebrochenen Gliedmaßen; aber solche Geräte sind teuer und erfordern deutlich mehr Zeit in der Chirurgie18,19,20,21. Auf der anderen Seite sind geschlossene Modelle mit einem einfachen intramedulläre Fixierung Gerät, damit genügend Instabilität Endochondral Heilung stimulieren stabilisiert. Infolgedessen geschlossene Fraktur Modelle nicht leicht die Bedingungen für eine Pseudarthrose imitieren. Osteosynthese-Techniken, wie intramedulläre Pins, Nägel und Kompression Schrauben sind vorteilhaft, da sie billig, einfach zu bedienen sind, und minimieren Sie die Zeit im OP21,22,23. In einigen Fällen intramedulläre Pins sind vor dem Bruch eingefügt, aber die Biegung der intramedullären Pin Winkelungen oder Verschiebung der gebrochenen Oberschenkelknochen, einen Beitrag zu einer Variable Kallus Größe und Heilung führen kann. Die Fraktur Lage und Geometrie sind schwieriger zu standardisieren in geschlossene Modelle, wie sie erzeugt werden, mit einem Dreipunkt-Biege Gerät, wobei eine Gewicht auf die Diaphyse fallen gelassen wird. Aber mit der richtigen Technik bietet dieser chirurgischen Ansatz schnelle und konsistente Ergebnisse. Darüber hinaus dient das geschlossene Fraktur-Modell als klinisch relevante Werkzeug, Frakturen, die durch hohe Kraft Auswirkungen oder mechanische Beanspruchung22zu studieren.
Dieses chirurgische Protokoll wurde von den zuvor beschriebenen Methoden mit einem intramedullären Pin zur Stabilisierung des gebrochener Oberschenkelknochen bei Ratten und Mäusen22,24,25angepasst. Erstens eine intramedulläre Nadel mit einem kleinen Durchmesser wird durch die Intracondylar Kerbe, eine Anlaufstelle zu etablieren und ein Führungsdraht wird vor dem Generieren einer queren Fraktur der femoralen Midshaft mit einen Schwerkraft-abhängige Dreipunkt-eingeführt Biegevorrichtung. Im Anschluss an die erfolgreiche Generierung einer geschlossenen femoralen Fraktur ist eine intramedulläre Rute mit einem größeren Durchmesser über den Führungsdraht zur Stabilisierung des gebrochenen Oberschenkelknochens eingearbeitet. Diese Methode vermeidet die Gefahr der verzögerten Heilung durch die Winkelung der intramedullären Pin während die Fraktur verursacht, wie die Platzierung der Rute Post-Fraktur zur Neupositionierung und optimierter Stabilisierung des verletzten Femur erlaubt.

<table><tbody><tr><td>Oster Minimax Trimmer</td><td>Animal World Network</td><td>78049-100</td><td></td></tr><tr><td>POVIDON-IOD</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>395516</td><td></td></tr><tr><td>OPHTHALMIC SALBE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC0490117</td><td></td></tr><tr><td>Styker T/Pump Warmwasser-Umwälzpumpe</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>1ml Sub-Q Spritze</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>309597</tr><tr><td>ENCORE Sensi-Touch PF</td><td>Moore Medical LLC</td><td>30347</td><td>Latex, puderfreier OP-Handschuh</td></tr><tr><td>PrecisionGlide 25G Injektionsnadeln</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-826-49</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Hochtemperatur-Wolframdraht,</td> <td>McMaster-Carr</td><td>3775K37</td><td>0,005" Durchmesser, 1/16 lb. Spule, 380' langer</td></tr><tr><td>304 Edelstahl, 24G dünnwandiger Schlauch</td><td>Microgroup Inc</td><td>304h24tw-5ft</td><td></td></tr><tr><td>#15 Skalpellklingen</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>#10 Skalpellklingen</td><td>Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Schmalmusterpinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-12</td><td>gezahnt/gerade/12cm</td></tr><tr><td>Iriszange</td><td>Fine Science Tools</td><td>11066-07</td><td>1x2 Zähne/gerade/7cm</td></tr><tr><td>Dissector Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14081-09</td><td>Slim Blades/Abgewinkelt/Scharf/10cm</td></tr><tr><td>Feine Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td>ToughCut/Straight/Sharp-Sharp/11,5cm</td></tr><tr><td>Olsen-Hegar Nadelhalter mit Nahtschneider</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td>Gerade/gezahnt/12cm/mit Lock</td></tr><tr><td>Crile Hämostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13004-14</td><td>Gezackt/gerade/14cm</td></tr><tr><td>Wolframdrahtschneider</td><td>ACE Surgical Supply Co., Inc.</td><td>08-051-90</td><td>ACE #150 Drahtschneider, Wolframkarbidspitzen</td></tr><tr><td>3-0 VICRYL Naht</td><td>Ethicon Naht</td><td>J423H</td><td>3-0 VICRYL UNGEFÄRBT 27" FS-2 CUTTING</td></tr><tr><td>piXarray 100 Digitales Probenradiographiesystem</td><td>Bioptics, Inc</td><td></td><td>Schrank Röntgensystem</td></tr><tr><td>Einhorn 3-Punkt-Biegegerät</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Sonderanfertigung</td></tr></tbody></table>

die generation der geschlossenen femoralen frakturen bei mäusen: ein modell zur knochenheilung

The Generation of Closed Femoral Fractures in Mice: A Model to Study Bone Healing

Knochenbrüchen verhängen eine enorme sozio-ökonomische Belastung für Patienten zusätzlich zu erheblichen Auswirkungen auf ihre Lebensqualität. Therapeutische Strategien, die effiziente Knochenheilung zu fördern sind nicht Existent und in der hohen Nachfrage. Effektive und reproduzierbare Tiermodellen der Heilung Frakturen sind erforderlich, zu verstehen, die komplexe biologische Prozesse Knochenregeneration zugeordnet. Im Laufe der Jahre wurden viele Tiermodellen der Frakturheilung generiert; murine Fraktur Modelle entstanden jedoch vor kurzem als leistungsfähige Werkzeuge zur Knochenheilung zu studieren. Eine Vielzahl von offenen und geschlossenen Modelle wurden entwickelt, aber das geschlossene femoralen Fraktur-Modell hebt sich als eine einfache Methode zur Erzeugung von schnelle und reproduzierbare Ergebnisse in einer physiologisch relevanten Weise. Das Ziel dieses chirurgischen Protokolls ist einseitige geschlossenen femorale Frakturen bei Mäusen zu generieren und erleichtern eine Stabilisierung nach dem Bruch des Oberschenkelknochens durch das Einfügen eines intramedullären Stahl-Stabes. Obwohl Geräte wie einen Nagel oder eine Schraube größeren Axial- und Rotations-Stabilität bieten, stellt die Verwendung von eine intramedulläre Rute eine ausreichende Stabilisierung für konsequente heilende Ergebnisse ohne produzieren neue Mängel im Knochengewebe oder Beschädigung in der Nähe soft Gewebe. Radiologische Bildgebung wird verwendet, um das Fortschreiten der Kallus-Bildung, knöchernen Union und anschließenden Umbau des knöchernen Kallus zu überwachen. Knochen Heilung Ergebnisse sind in der Regel verbunden mit der Kraft des geheilten Knochens und mit Torsions Tests gemessen. Dennoch, das Verständnis der frühen zellulären und molekularen Ereignisse im Zusammenhang mit Fraktur Reparatur ist von entscheidender Bedeutung bei der Untersuchung von Knochen Geweberegeneration. Die geschlossenen femoralen Fraktur-Modell bei Mäusen mit intramedulläre Fixierung dient als eine attraktive Plattform zu studieren, Knochen Frakturheilung und bewerten Sie therapeutische Strategien um die Heilung zu beschleunigen.

Die erfolgreiche Durchführung des chirurgischen Eingriffs wurde mit radiologischen Bildgebung überwacht. Wichtige Schritte umfassen die Einfügung eines intramedullären Nadel, die Platzierung von einem Führungsdraht, die Induktion einer quer Fraktur an der femoralen Midshaft und die richtige Stabilisierung mit einem intramedullären Rute (Abbildung 2Aich - 2Aiv). Das heilende Fortschreiten der Fraktur Kallus wurde mit wöchentli...

Das murine geschlossenen femoralen Fraktur-Modell ist eine leistungsfähige Plattform, Frakturheilung zu studieren und neue therapeutische Strategien zur Knochenregeneration zu beschleunigen. Das Ziel dieses chirurgischen Protokolls soll einseitige geschlossenen femorale Frakturen bei Mäusen mit einem intramedullären Stahl-Stab Femur zu stabilisieren.

Die Generation der geschlossenen femoralen Frakturen bei Mäusen: ein Modell zur Knochenheilung

Bone fractures impose a tremendous socio-economic burden on patients, in addition to significantly affecting their quality of life. Therapeutic strategies ...

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Frakturheilungsforschung zu den biologischen Mechanismen der Reparatur und der Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien zur Förderung einer effizienten Knochenheilung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie als minimal-invasives Verfahren zur Erzeugung standardisierter Frakturen dient, um die Heilung von Knochenbrüchen bei Mäusen zu untersuchen. Der chirurgische Eingriff wird von Yong Li und Anuradha Valiya Kambrath, Technikern unseres Labors, vorgeführt.Nachdem Sie das entsprechende Maß an Sedierung durch Zehenkneifen bestätigt haben, tragen Sie Salbe auf die Augen einer 10 Wochen alten männlichen Maus auf und entfernen Sie das Fell von der rechten Hintergliedmaße. Beginnen Sie in der Mitte des Knies und machen Sie einen kreisförmigen Schwung nach außen, desinfizieren Sie die freiliegende Haut mit drei aufeinanderfolgenden Peelings auf Jodbasis und 70 % Ethanol und legen Sie die Maus in Rückenlage auf ein Heizkissen, das mit einem sterilen OP-Tuch bedeckt ist. Beugen Sie das Knie des operierenden Beins und machen Sie mit einer Skalpellklinge einen 1,5 Zentimeter langen Schnitt mittig über dem Kniegelenk.Verwenden Sie eine Pinzette, um die Patella seitlich zu verschieben, das distale Ende des Femurs freizulegen, und führen Sie eine 1,5 Zoll lange, 25 Gauge starke Injektionsnadel aus Edelstahl in der Mitte der Trochlea-Furche in retrograder Richtung über die Länge des Markkanals und durch das proximale Ende des Femurs ein. Machen Sie eine Röntgenaufnahme, um die richtige Platzierung des Stifts sicherzustellen. Führen Sie dann einen vier Zoll langen Wolfram-Führungsdraht mit 36 Gauge durch den Schaft der Nadel in die Nabe am distalen Oberschenkelknochen und verlassen Sie die Abschrägung auf der dorsalen Seite der Maus.Ziehen Sie nach erfolgreicher Platzierung des Führungsdrahts vorsichtig an der Nabe, um die Nadel vorsichtig zu entfernen, während Sie die Wurfarme und den Führungsdraht an Ort und Stelle halten, und bestätigen Sie die Platzierung des Führungsdrahts durch Röntgenaufnahmen. Platzieren Sie nun die Maus in der schwerkraftabhängigen Dreipunktbiegevorrichtung und positionieren Sie den Femur horizontal über die beiden Stützpunkte, so dass die intertrochantäre und suprakondyläre Region des Femurs auf den Stützambossen aufliegen und die laterale Seite der Extremität dem Belastungspunkt zugewandt ist. Der kritischste Schritt dieses Protokolls ist die Platzierung des Femurs innerhalb des Dreipunktbiegeapparates, da die Frakturgeometrie von der aufgewendeten Biegekraft und der Positionierung der hinteren Extremität abhängt.Wenn der Oberschenkelknochen in Position ist, positionieren Sie ein 391 Gramm schweres Gewicht, 34,6 Zentimeter über der Aufprallscheibe des Geräts und lassen Sie das Gewicht fallen. Entfernen Sie die Maus sofort aus dem Gerät und bestätigen Sie die Frakturstelle durch Röntgenaufnahmen. Führen Sie ein Stück 24-Gauge-Injektionsschlauch aus Edelstahl über den Führungsdraht ein, um den gebrochenen Knochen zu stabilisieren, und bestätigen Sie die Position des Stahlstabs und die Stabilisierung des gebrochenen Oberschenkelknochens durch Röntgenaufnahmen.Entfernen Sie den Führungsdraht und verwenden Sie einen Drahtschneider, um überschüssige Schläuche am distalen Ende des Oberschenkelknochens zu entfernen. Üben Sie mit einer Pinzette eine sanfte Kraft nach unten aus, um den freiliegenden Schlauch unter der Oberfläche der Kondylen zu vergraben, wobei Sie darauf achten, dass das Kniegelenk nicht ausgerenkt wird, und positionieren Sie die Patella neu. Verschließen Sie dann die Inzisionsstelle mit einer resorbierbaren 5-0-Naht.Sobald die Operationen abgeschlossen sind, injizieren Sie jeder Maus intraperitoneal bis zu 500 Mikroliter sterile Kochsalzlösung, um ihre postoperative Genesung zu unterstützen, und überwachen Sie die Tiere, bis sie vollständig liegen. Die wöchentliche Überwachung des Heilungsfortschritts des Frakturkallus bis zu 28 Tage nach der Operation zeigt einen ausgeprägten weichen Kallus, der sich am 14. Tag nach der Fraktur aus mineralisiertem Knorpel gebildet hat und bis zum 21. Tag nach der Fraktur in einen harten Kallus umgewandelt wird. Die Toluidinblau-Färbung zeigt die Bildung einer Knorpelmatrix am Frakturspalt am siebten Tag, die am 14. Tag nach der Fraktur mit dem Frakturspalt ausgerichtet wird.Die Färbung der Kollagenexpression vom Typ 1 veranschaulicht die räumliche Organisation und die relativen Mengen der Knochenmatrix, die 14 Tage nach der Fraktur vorhanden ist. Die Mikro-Computertomographie-Analyse zeigt eine Abnahme des Kallusvolumens um etwa 50 % zwischen dem 14. und 28. Tag nach der Fraktur, was auf eine effektive Remodellierung des Kallus hinweist. Bevor Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, das Gewicht und die Fallhöhe zu bestimmen, da diese vom Alter, Geschlecht und Stamm der Mäuse abhängen.Röntgenbildgebung wird häufig verwendet, um den Heilungsfortschritt zu überwachen, während Techniken wie Immunhistochemie und Mikro-CT verwendet werden können, um Fragen zu den Mechanismen der Knochenregeneration zu beantworten und das Ausmaß der Heilung von Knochenbrüchen zu beurteilen. Die Entwicklung dieser Technik hat eine Plattform für die Untersuchung komplexer biologischer Mechanismen der Frakturheilung und für die Erforschung neuartiger therapeutischer Strategien zur Beschleunigung der Knochengeweberegeneration bei Mäusen geschaffen.

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