Bewertung der synaptischen Schnittstelle der primären menschlichen T-Zellen aus peripherem Blut und Lymphgewebe
July 30th, 2018
Das Protokoll beschreibt eine Technik, um die Fähigkeit der primären polyklonale menschlichen T-Zellen synaptische Schnittstellen mit planaren Lipid Bilayer bilden zu studieren. Wir verwenden diese Technik, um die differenzielle Synapse Bildung Fähigkeit der menschlichen primäre T Zellen aus Lymphknoten und peripheren Blut zu zeigen.
Der Ansatz, über den wir heute sprechen werden, wurde abgeleitet, um die Eigenschaften und funktionellen Aktivitäten von T-Zellen aus dem Gewebe und peripherem Blut zu vergleichen. Die Bedeutung des Themas wird durch die Tatsache verdeutlicht, dass periphere Blut-T-Zellen nur 20 % der gesamten T-Zellen in einem Körper ausmachen. Die Möglichkeit, eine kleine Anzahl von T-Zellen aus dem Gewebe zu untersuchen, ist sehr wichtig, und genau das haben wir erreicht.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine geringere Anzahl von Zellen und ein kleineres Volumen an Reagenzien erfordert als herkömmliche Techniken. Beginnen Sie damit, die Glasdeckgläser mit einer Scherenzange aus Polypropylen 25 bis 30 Minuten lang in frisch zubereitete saure Piranha-Lösung zu tauchen. Spülen Sie die Deckgläser am Ende der Wäsche bei jeder Wäsche siebenmal in einem frischen Volumen ultrareinen Wassers aus.
Legen Sie dann die nassen Deckgläser beiseite, um das restliche Wasser vom sauberen Glas abperlen zu lassen. Wenn die Deckgläser trocken sind, aliquotieren Sie zwei Mikroliter des endgültigen Liposomengemisches genau in der Mitte eines selbstklebenden Gleitkanals innerhalb einer sterilen Strömungshaube. Und richten Sie sofort, aber vorsichtig ein sauberes und trockenes Deckglas auf den Objektträger aus, damit das Deckglas vorsichtig auf die klebrige Seite des Objektträgers abgesenkt werden kann.
Üben Sie mit dem Außenring der Polypropylen-Scherenzange einen sanften Druck auf den peripheren Kontakt des Deckglases mit dem Objektträger aus und achten Sie darauf, dass der Gleiter fest mit dem Objektträger verbunden ist, um ein Auslaufen zu verhindern. Drehen Sie dann die Folie um und zeichnen Sie mit einem Permanentmarker vier Punkte um die Doppelschicht an der Außenseite der Folienbaugruppe. Vor der ersten Injektion wird eine Öffnung des Kanals als Eintrittsöffnung und die andere als Ausgangsöffnung festgelegt, wobei diese Bezeichnung während des gesamten Experiments beibehalten wird.
Um Blasenbildung zu vermeiden, führen Sie das Ende der Pipettenspitze direkt in die Eintrittsöffnung ein, bis Sie spüren, dass die Gummidichtung des Schieberkanals mit der Spitze durchdrungen wird. Füllen Sie den Kanal langsam mit 50 Mikrolitern warmem Assay-Puffer. Injizieren Sie 200 Mikroliter Nickel(II)chlorid in Kasein-Blockierungslösung in die Eintrittsöffnung.
Und entfernen Sie 50 Mikroliter des Puffers aus dem Ausgangsanschluss. Entfernen Sie nach einer 45-minütigen Inkubation die überschüssige Kaseinlösung aus der Austrittsöffnung. Injizieren Sie 100 Mikroliter eines ICAM-1 in Streptavidinlösung in die Eintrittsöffnung für eine 45-minütige Inkubation bei Raumtemperatur.
Entfernen Sie am Ende der Inkubation die überschüssige Proteinlösung aus der Austrittsöffnung. Und waschen Sie die Doppelschicht zweimal mit 100 Mikrolitern Assay-Puffer pro Waschgang. Anschließend markieren Sie die Doppelschichten mit 100 Mikrolitern Fluor-4-konjugiertem Anti-CD3-Antikörper für 45 Minuten bei Raumtemperatur.
Gefolgt von zwei Waschgängen in 100 Mikrolitern Assay-Puffer pro Waschgang, wie gezeigt. Um die Wechselwirkungen von T-Zell-Doppelschichten abzubilden, legen Sie den Objektträger auf den bei 37 Grad Celsius beheizten Tisch eines Totalreflexionsfluoreszenzmikroskops oder TIRF-Mikroskops. Und passen Sie den Tisch mit den Tintenmarkierungen an, um die Doppelschicht auf dem 100-fach-Objektiv zu zentrieren.
Für die Bildgebung mit granulierter Freisetzung fügen Sie der CD4-T-Zellsuspension fluoreszenzkonjugierte Anti-CD107A-Antikörper-FAB-Fragmente hinzu. Und resuspendieren Sie die markierten Zellen in 50 Mikrolitern Assay-Puffer zur Injektion in die Eintrittsöffnung des Objektträgerkanals. Wählen Sie dann die entsprechende Anzahl von Versuchsfeldern aus und zeichnen Sie Bilder jedes Feldes einmal pro Minute für 30 Minuten nach der Injektion auf.
In diesem repräsentativen Experiment wurden keine Unterschiede zwischen CD8-T-Zellen beobachtet, die klassische immunologische Synapsen auf den Lipiddoppelschichten bildeten, die entweder in der Flusszelle oder im Mehrkanal-Strömungsträger eingebaut waren. Bei der Wechselwirkung der Lipiddoppelschicht etablierten CD4-T-Zellen reife Immunsynapsen, setzen aber entweder Granulate frei oder nicht, setzen Granulate ohne Bildung reifer Synapsen frei oder bilden weder Synapsen noch setzen sie Granulate frei. Bemerkenswert ist, dass mononukleäre CD4-T-Zellen aus dem peripheren Blut in der Lage sind, Granulate fast doppelt so schnell freizusetzen wie CD4-Zellen aus Lymphknoten.
Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Temperatur konstant zu halten und langsam zu pipettieren, damit sich keine Blasen bilden. Zusätzlich zu unseren Möglichkeiten, eine T-Zell-Doppelschicht-Grenzfläche zu untersuchen, würde uns dieser Ansatz auch eine interzelluläre Färbung der T-Zellen ermöglichen, die die Doppelschicht berührt haben. Dies würde eine Menge an Informationen erheblich erleichtern, die zur Beschreibung bestimmter T-Zellen verwendet werden können, die entweder aus lymphatischem Gewebe oder anderen Geweben stammen.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Piranha-Lösung äußerst gefährlich ist, und es ist wichtig, dass Sie bei diesem Verfahren die richtige PSA tragen.
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Überblick
Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Untersuchung der synaptischen Schnittstellenbildungsfähigkeiten primärer polyklonaler menschlicher T-Zellen unter Verwendung planarer Lipiddoppelschichten. Die Studie hebt die Unterschiede in der Synapsenbildung zwischen aus Lymphknoten stammenden T-Zellen und solchen aus dem peripheren Blut hervor.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Immunologie
- Zellbiologie
Hintergrund
- Periphere Blut-T-Zellen machen nur 20% der Gesamtzahl der T-Zellen im Körper aus.
- Die Untersuchung von gewebeabgeleiteten T-Zellen ist entscheidend für das Verständnis von Immunreaktionen.
- Die Technik ermöglicht eine Analyse mit weniger Zellen und Reagenzien im Vergleich zu herkömmlichen Methoden.
- Planare Lipiddoppelschichten bieten ein Modell zur Untersuchung von Zellinteraktionen.
Zweck der Studie
- Vergleich der Synapsenbildungsfähigkeiten von gewebeabgeleiteten und peripheren Blut-T-Zellen.
- Entwicklung einer Methode, die weniger Zellen für die Analyse erfordert.
- Verbesserung des Verständnisses der T-Zell-Funktionalität in verschiedenen Umgebungen.
Verwendete Methoden
- Präparation von Glasobjektträgern mit saurer Piranha-Lösung.
- Spülen der Objektträger in ultrareinem Wasser.
- Nutzung planarer Lipiddoppelschichten für T-Zell-Interaktionsstudien.
- Bewertung der synaptischen Schnittstellenbildung zwischen T-Zellen und Lipiddoppelschichten.
Hauptergebnisse
- Demonstrierte unterschiedliche Synapsenbildungsfähigkeiten von T-Zellen aus verschiedenen Quellen.
- Bestätigte die Effektivität der Technik beim Studium kleiner Zellpopulationen.
- Lieferte Einblicke in die funktionellen Aktivitäten von T-Zellen in verschiedenen Geweben.
- Hevorgehoben die Vorteile der Verwendung von weniger Reagenzien in experimentellen Setups.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll ermöglicht erfolgreich die Untersuchung der T-Zell-Synapsenbildung.
- Es bietet ein wertvolles Werkzeug für Forscher, die die Funktionalität von T-Zellen untersuchen.
- Die Ergebnisse könnten Auswirkungen auf das Verständnis von Immunreaktionen bei Gesundheit und Krankheit haben.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Direct assessment of synaptic interfaces in primary human T cells from both peripheral blood and lymphoid tissue addresses a critical gap in translational immunology and cell therapy R&D. This technique enables mechanistic de-risking and predictive confidence by allowing functional interrogation of rare tissue-derived T cell populations using minimal sample input. The approach supports portfolio decisions by providing quantitative, reproducible data on T cell activation and granule release kinetics relevant to immune modulation strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct functional comparison of tissue- and blood-derived T cells for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by revealing differences in synapse formation and granule release kinetics.
- Facilitates hypothesis testing on immune cell activation pathways using primary human samples.
- Provides quantitative outputs for portfolio triage and early-stage decision making.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible, low-input assay platform for evaluating T cell activation and effector function.
- Supports assay standardization and scalability by minimizing cell and reagent requirements.
- Enables screening of functional responses in rare or limited primary cell populations.
- Delivers quantitative, time-resolved readouts suitable for compound or biologic evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant tissue T cell phenotypes for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement by comparing functional outputs across health and disease contexts.
- Supports biomarker discovery by correlating synaptic interface dynamics with functional granule release.
- Provides mechanistic insights to inform preclinical model selection and validation.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and translational research by enabling direct, quantitative analysis of primary T cell function from both blood and tissue sources.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of T cell activation and synapse formation mechanisms.
- Screening: Provides a standardized, scalable assay for functional screening of T cell responses.
- Analytics: Delivers quantitative, time-resolved measurements of granule release and synaptic interface formation.
- Translational Research: Facilitates alignment of in vitro findings with disease-relevant tissue phenotypes.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse immune cell functional studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in T cell functional studies.
- Operational Value: Minimizes sample and reagent requirements, enabling studies with rare or limited primary cells.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immune modulation programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation and advanced fluorescence microscopy.
- Demands access to TIRF microscopy and precise fluid handling instrumentation.
- Standardization of assay conditions is critical for reproducibility across teams.
- Adaptation may be needed for different tissue sources or T cell subsets.
- Careful handling of hazardous reagents and strict adherence to safety protocols are essential.
