Name: Live Cell Imaging-Assays Studie Glioblastom Gehirn Tumor Stammzellen Migration und Invasion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Erfahren Sie quantitative Live-Cell-Imaging-Methoden zur Analyse von Migration und Invasion von Glioblastom-Hirntumor-Stammzellen. Diese Techniken ermöglichen die Echtzeitbeobachtung zellulärer Verhaltensweisen unter verschiedenen Behandlungsbedingungen.

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Die Autoren danken Rozina Hassam und Orsolya Cseh für ihre technische Unterstützung. Dieses Forschungsprojekt wurde zum Teil durch Zuschüsse von der Kanada-Stiftung für Innovation (zu H. Artee Luchman und Samuel Weiss) und die Stem Cell Networks of Canada (auch H. Artee Luchman und Samuel Weiss) unterstützt.

1. Kultivierung Gehirn Tumor-Stammzellen aus menschlichen Glioblastom Proben zuvor abgeleitet
Hinweis: BTSC Kulturen wurden zuvor von menschlichen GBM Patientenproben6,7,8,9,10gegründet.
<ol><li>Tauen Sie ein Fläschchen mit tiefkalt erhaltene BTSCs in einen Becher mit 70 % Ethanol, platziert in einem Wasserbad bei 37 ° C, bis die letzte der das Eis aufgetaut ist. Verdünnen Sie die aufgetauten Zellen in 10 mL von Medien in einem 15 mL konische Röhrchen und Zentrifugieren Sie die Zellen am 150 relative Zentrifugalkraft (RCF) für 7 min. Hinweis: In diesen Protokollen bezieht sich komplette Medien auf Standardmedien verwendet, um Kultur BTSCs (zuvor beschrieben von Kelly Et Al.) 6, in der Regel mit Wachstumsfaktoren vorhanden. Medien ohne Wachstumsfaktoren bezieht sich auf die Basis Medien mit allen Komponenten, aber ohne jede Wachstumsfaktoren ergänzt.</li>
	<li>Aspirieren Sie die Medien, Aufschwemmen der Zellen in 8 mL komplette Medien und die Zellen und Medien auf einen T25 Kolben übertragen.</li>
	<li>Überwachen Sie nach 1 Woche der Kultivierung unter nicht-adhärenten Bedingungen die Kolben täglich und ergänzen Sie den Inhalt mit 1-2 mL komplette Medien Bedarf, wenn die Medien beginnt, zum Abbau oder sauren angedeutet durch eine Orange-gelbe Farbe Änderung zu werden beginnt. Durchgang-Zellen bei die neurosphären einen Durchmesser von etwa 250 µm, in der Regel zwischen 10-14 d (Abbildung 1 erreichen). Hinweis: Die Verdopplungszeit der BTSC Kulturen sehr unterschiedlich. Neurosphäre Größe kann mit einem Okular Mikrometer gemessen werden.</li>
	<li>Um BTSCs passage, sammeln Sie die Medien und neurosphären durch die Medien auf der Oberfläche der Küvette um alle neurosphären zu sammeln und übertragen Sie sie auf eine 15 mL konische Rohr und Zentrifugieren Sie das Rohr für 7 min bei 150 RCF pipettieren. Hinweis: Fläschchen können überprüft werden, unter dem Mikroskop um sicherzustellen, dass alle neurosphären gesammelt wurden. Eine zusätzliche Wäsche mit 5 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder Medien können durchgeführt werden, um alle verbleibenden neurosphären wie nötig zu sammeln.</li>
	<li>Um den BTSC-neurosphären in Einzelzellen zu distanzieren, Aspirieren Sie die Medien und fügen Sie 1 mL vorgewärmten Zelle Ablösung Lösung und inkubieren Sie, dass bei 37 ° C für mind. 7 BTSC Federung 40 X mit einer P1, 000 Mikropipette 800 μl festgesetzt genannte. Hinweis: Zellen können mehr bei 37 ° C inkubiert werden, wenn die neurosphären nicht distanzieren.</li>
	<li>Die dissoziierte BTSCs 5 mL PBS (mit den Antibiotika Penicillin und Streptomycin) hinzu und Zentrifugieren Sie die Zellen am 150 RCF für 7 min.</li>
	<li>Den überstand abgesaugt und Aufschwemmen der BTSCs in 1-4 mL komplette Medien, abhängig von der Größe des Pellet-Zelle. Hinweis: Die Zellsuspension muss weiter verdünnt werden, wenn die Konzentration über die genaue Nachweisgrenze für genaue Zellzählung.</li>
	<li>Mit einem Farbstoff, der abgestorbenen Zellen ausschließt, wie Trypan blau, die Anzahl der lebensfähigen Zellen und Samen der BTSCs in die Küvette oder Platte von Interesse – in der Regel 200.000-300.000 Zellen in 8 mL komplette Medien in einem T25-Kolben.</li>
</ol>2. Gehirn Tumor Stammzellen Migration Assay
<ol><li>200.000 Samenzellen in einem T25 Kolben in 8 mL komplette Medien 1 bis 2 Wochen vor der Planung eine Migration-Test durchführen. Hinweis: Die Zeit zwischen Beschichtung und die Durchführung des Tests variiert je nach der Wachstumsrate der BTSC-Kultur verwendet.<ol>
<li>Um den Effekt einer medikamentösen Behandlung auf Migration zu testen, Vorbehandeln der Zellen mit dem entsprechenden Fahrzeug wie DMSO und Droge des Interesses durch Zugabe von geltenden Mengen an Fahrzeug oder Medikament Lager direkt in separaten Vertiefungen der Medien, die die Zellen enthalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die Chemotaxis-Migration-Platte (Abbildung 2A) durch Beschichtung mit einer dünnen Schicht von Kollagen.<ol>
<li>Berechnen Sie die Anzahl der Vertiefungen einer 96-Well-Chemotaxis-Platte, die mit Kollagen beschichtet werden müssen. Gehören Sie mindestens drei replizieren Brunnen für jede Bedingung.</li>
		<li>Verdünnte 5 mg/mL des Bestandes an Typ I Kollagen bis 0,2 mg/mL in reine Essigsäure auf 0,14 % Kultur Grade Wasser verdünnt.</li>
		<li>Pipette 0,2 mg/mL von Kollagen Membran einfügen Brunnen und die unteren Reservoir-Brunnen, die verwendet werden. Hinweis: Die unteren Behälter der Platte erfordern 225 µL und die Membran einfügen Brunnen erfordern 75 µL von Kollagen für eine richtige Beschichtung.</li>
		<li>Ort der Migration-Platte in einem Inkubator bei 37 ° C für 1 h Aspirieren Sie die Kollagen-Lösung aus den Brunnen ohne kratzen die Kollagen-Beschichtung.</li>
		<li>Waschen Sie die Brunnen 2 X mit sterilen 1 X PBS. Wenn die Platte nicht sofort verwendet wird, Aspirieren der PBS und bewahren Sie es bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen. Vor dem Gebrauch warm die Chemotaxis-Migration-Platte auf Raumtemperatur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die unteren Reservoir an die Chemotaxis-Migration-Platte.<ol>
<li>Pipette 225 µL Medien (ohne Wachstumsfaktoren), ergänzt mit 10 % FBS als ein lockstoffgradient, in der unteren Reservoir Vertiefungen die Chemotaxis-Migration-Platte.</li>
		<li>Legen Sie vorsichtig die Membran einfügen in den unteren Behälter schräg zur Vermeidung von Luftblasen zu schaffen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Platte der Zellen in die Membran der Chemotaxis Migration Platte einfügen.<ol>
<li>Aufschwemmen getrennt BTSCs in Medien (ohne Wachstumsfaktoren) in einer Zelle Dichte von 50.000 Zellen/mL. Die Medien fügen Sie Drogen wenn Migration während verschiedene medikamentöse Behandlungen zu bewerten hinzu. Abwechselnd, Samen Sie paritätisch von vorbehandelten Zellen und Kontrolle, unter Beibehaltung der endgültigen Wirkstoffkonzentration als Überzug.</li>
		<li>Platte 50 µL der BTSCs vom Schritt 2.4.1 in jede Vertiefung der Migration Platte unter die gewünschte Behandlungsbedingungen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bild der Chemotaxis-Migration.<ol>
<li>Die Chemotaxis Migration Platte in der live-Cell-imaging-System und setzen der automatisierte Software zur Abbilderstellung, mikroskopische Aufnahmen der Platte zu erwerben alle 1-2 h für bis zu 72 h mit kommerzieller Software (siehe Tabelle der Materialien), mit der rechten Maustaste auf die Timeline und setzen die Scan-Intervall alle 2 h für 24 h. Hinweis: Das Zeitintervall und abgelaufene Gesamtzeit variiert zwischen den BTSC Kulturen verwendet; mit 2 h-Takt 72 h erst Erfahrungen mit einzelnen BTSC Kulturen. Wenn ein automatisiertes imaging System nicht verfügbar ist, dann Bilder von der gleichen Sichtfeld erworben werden können manuell mit einem Mikroskop und eine Kamera mit der imaging-Software verbunden.</li>
		<li>Sobald die Bildaufnahme abgeschlossen ist, erhalten Sie die Bilder für das gesamte Experiment und erstellen Sie eine Verarbeitung Definition mit Hilfe der Analysesoftware, die Zellen aus dem Hintergrund der Membran und die Migration Poren (Abb. 2 b, rote Maske) unterscheidet . Kommerziellen Software verwenden (siehe Tabelle der Materialien), wählen Sie eine Neue Verarbeitung Definition und Einstellen der Verarbeitung Definition für BTSCs zu einem Samen Schwelle von 52, eine Schwelle zu wachsen , der 85, Anpassung der Größe (Pixel) von-1 und eine Mindestfläche von 200 μm2. Gelten Sie diese Verarbeitung Definition an der Unterseite der Membran. Ändern Sie diese Analyse, wenn es nicht genau Zellen aus dem Hintergrund Membran unterscheidet.</li>
		<li>Sammeln Sie Daten wie die Zelle Oberfläche auf der Unterseite der Membran für jede der drei replizieren Vertiefungen, die zählt nur die Zellen, die durch die Poren migriert haben. Graph die Migration der Zellen in μm2 (Bereich von Zellen migriert) im Laufe der Zeit (Abbildung 2 C, Abbildung 3). Hinweis: Sicherstellen, dass die relative Anzahl der Zellen überzogen und zählte auf der oberen Fläche der Membran zum ersten Zeitpunkt ähnlich sind (weniger als 20 % Abweichung in alle Wells) zwischen allen Behandlungsbedingungen um eventuelle Auswirkungen der ungleichmäßige Beschichtung zu vermeiden. Daten Auflistung verwenden, die die kommerzielle Software (siehe Tabelle der Materialien) ausgeführt werden kann durch die Einführung der Verarbeitung-Definition erstellt in Schritt 2.5.2, Metriken, anklicken, dann auf Grafik/exportierenund dann auf Daten exportieren .</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Brain Tumor Stammzellen Neurosphäre Invasion Assay
<ol><li>200.000 Samenzellen in 8 mL komplette Medien in einem T25 Kolben 1-2 Wochen vor der Planung einen Invasion-Test durchführen. Hinweis: Das Timing von Beschichtung zur Durchführung des Tests hängt von der proliferationsrate der BTSC-Kultur verwendet.<ol>
<li>Fügen Sie die Verbindung von Interesse vorbehandelten Zellen hinzu den Kolben auf die gewünschte Konzentration für den vorgegebenen zeitlichen Verlauf bis die neurosphären für Invasion überzogen sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Warten Sie, bis die durchschnittliche neurosphäre ca. 150-200 μm beträgt; Dies dauert normalerweise 7-14 d, abhängig von der BTSC-Kultur verwendet wird. Hinweis: Es ist typisch für eine Verteilung der Kugel Größen in die Flasche zu beobachten.</li>
	<li>Tipp und sanft mischen Sie den Kolben mit einer Pipette und ein 1,5 mL konische Rohr für jede Behandlung Bedingung 500 μL des BTSC neurosphären ans; Hiermit werden drei replizieren Brunnen Platte. Hinweis: Schritte 3.3.1 - sind 3.3.2 optional aber empfohlen für das erste Invasion Experiment auf eine neue Kultur des BTSC.<ol>
<li>Bereiten Sie die Dichte der neurosphären bestimmen, die am Ende in den Brunnen, eine 1,5 mL-Tube wie in Schritt 3.3. Vorsichtig mischen Sie die neurosphären und verschieben Sie 100 μL in einer separaten 96-Well-Platte und ermöglichen Sie die neurosphären durch die Schwerkraft für 5 min zu begleichen.</li>
		<li>Prüfen Sie sind die Anzahl der neurosphären unter dem Mikroskop um mehrere neurosphären zu gewährleisten in der Region des Brunnens, die abgebildet wird, ohne es Überbelegung. Hinweis: Eindringende neurosphären benötigen genügend Platz im Durchmesser verdreifachen, ohne Interaktion mit dem benachbarten neurosphären. Die Anzahl der neurosphären pro Bohrloch durch zählen der Anzahl von Neurospheres pro Bohrloch und Hinzufügen der 1,5 mL konische Rohr im Schritt 3.3 mehr oder weniger neurosphären aus der Flasche T25 einstellbar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie die 1,5 mL konische Rohr mit den Zellen aus Schritt 3.3 auf Eis und führen Sie Schritte 3.5-3.7 auf Eis.</li>
	<li>Lassen Sie die neurosphären durch die Schwerkraft nach unten von der 1,5 mL konische Rohr für 5 min absetzen und prechill eine beschriftete 96-Well-Platte auf dem Eis.</li>
	<li>Die neurosphären in die extrazelluläre Matrix Protein aufzuwirbeln.<ol>
<li>Bereiten Sie 500 μL von 0,4 mg/mL Typ I Kollagen-Lösung für jede Behandlung Bedingung auf Eis: Fügen 459 μL Medien (ohne Wachstumsfaktoren), 40 μL der Vorratslösung 5 mg/mL Kollagen und 0,92 μL der sterilen 1N NaOH (Tabelle 1). Hinweis: 500 μL der Kollagen-Lösung ist erforderlich pro Behandlung Zustand: 100 μL für jede der drei replizieren Brunnen und 200 μL des Überschusses. Medikamentöse Behandlungen hier auf die gewünschte Endkonzentration, subtrahiert die Media-Komponente der Lösung hinzugefügt werden müssen. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Typ I-Kollagen als extrazelluläre Matrix Protein; jedoch kann jedes extrazelluläre Matrix Protein getestet werden. Darüber hinaus können für BTSC Kulturen, die langsameren Rate der Invasion, Wachstumsfaktoren oder FBS haben in den Medien zu einer erhöhten Rate von Invasion ergänzt werden.</li>
		<li>Nach die neurosphären aus Schritt 3.5 beglichen sind, Aspirieren Sie so viel von den Medien wie möglich ohne das neurosphäre Pellet, das auf den Boden gelegt hat. Sanft Aufschwemmen der neurosphären in 500 μL der Kollagen-Lösung im Schritt 3.6.1 vorbereitet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Drei replizieren Brunnen von 96-Well-Platte auf dem Eis 100 μL der Kollagen und neurosphäre Mischung hinzufügen. Lassen Sie die neurosphären auf Eis für 5 min zu begleichen.</li>
	<li>Übertragen Sie die 96-Well-Platte in einen Inkubator 37 ° C für 5 min, um Kollagen Polymerisation zu ermöglichen.</li>
	<li>Sofort darauf bereiten Sie vor, die 96-Well-Platte Bild.<ol>
<li>Legen Sie die 96-Well-Platte in das Fach von einem live-Cell-imaging-System oder auf der Bühne eines Mikroskops, erwerben ein Bild als Referenz für die neurosphäre Größe zum Zeitpunkt der Beschichtung, bevor die Invasion beginnt.</li>
		<li>Abrufen von Bildern jede Stunde, bis die Rate der Invasion Plateau hat; in der Regel geschieht dies innerhalb von 24 h. Hinweis: Die bildgebende Intervall kann abhängig von der verwendeten Ausrüstung geändert werden. Die imaging-Intervall und insgesamt verstrichene Zeit kann auch für BTSC-Kulturen, die unterschiedliche der Invasion Preise geändert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die zunehmende Fläche des BTSCs zu bestimmen, wie sie im Laufe der Zeit in die Matrix eindringen. Hinweis: Die Oberfläche der Zellen zum Zeitpunkt der Beschichtung, berechnet als Mittelwert von drei replizieren Brunnen muss ähnlich sein (weniger als 20 % Abweichung in alle Wells) zwischen den verschiedenen Behandlungsbedingungen um sicherzustellen, dass die Unterschiede in der BTSC-Invasion nicht stark beeinflusst durch die Anzahl oder Größe von den neurosphären überzogen.<ol>
<li>Verwenden Sie für das Leben-Zellanalyse-System ein 10 X-Objektiv für die Bildaufnahme und erwerben Sie vier Bilder pro Bohrloch zu, für die drei Brunnen replizieren. Um festzustellen, die relative Zelle Oberfläche, dargestellt als Prozent Zusammenfluss des Brunnens, richten Sie eine Verarbeitung-Definition, die speziell die Zellen über dem Hintergrund des Brunnens hervorhebt. Kommerziellen Software verwenden (siehe Tabelle der Materialien), wählen Sie eine neue Definition der Verarbeitung und die Segmentierung Anpassung auf 0,8, Bereich mindestens 300 μm2und die Exzentrizität maximal bis zu 0,99. Ändern Sie diese Analyse, wenn es nicht genau Zellen aus dem Hintergrund unterscheidet. Hinweis: Wenn Sie andere Methoden zum Bild neurosphäre Invasion im Laufe der Zeit zu verwenden, empfiehlt es sich mehrere Gesichtsfelder zu erhalten, denn die drei Brunnen im Laufe der Zeit zu replizieren. Imaging nicht die exaktere gleiche Sichtfeld bei jedem Intervall erhöht jedoch den Standardfehler der erhobenen Daten. Computer-Software kann verwendet werden, zu helfen, die Fläche der eindringenden Zellen in jedem Bild zu messen.</li>
		<li>Sammeln Sie Daten wie die Ergebniszelle Fläche (relative oder absolute) für jeden gut zu jedem Zeitpunkt und der Mittelwert der drei replizieren Brunnen. Grafische Darstellung der Invasion der BTSCs durch Plotten den zunehmenden Zellbereich im Laufe der Zeit. Hinweis: Die Datenerfassung mit Hilfe kommerziellen Software (siehe Tabelle der Materialien) durch die Einführung der Verarbeitung-Definition erstellt in Schritt 3.10.1, klicken auf Metrikenund dann auf Grafik/Export, ausgeführt werden kann und dann auf Daten exportieren .</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Angesichts der Tatsache, dass Krebszellen aktiv vermehren werden, stellt dies eine mögliche technische Herausforderung für das Studium der Zellmigration. Für die hier beschriebenen Migration-Assay BTSCs sind beschichtet ohne Wachstumsfaktoren, welche Grenzen die Verbreitung und der lockstoffgradient Verlauf der Chemotaxis-Platte ist nicht voll equilibrate über 72 Stunden. Darüber hinaus wie die Zellen mit live Cell Imaging im Laufe der Zeit überwacht werden, können Zellen optisch überwacht werden, um sicherzustellen, dass weit verbreitete Zellteilung nicht stattfindet. Für den Erfolg der Migration Test ist es wichtig, die neurosphären vollständig auf einzelne Zellen zu trennen und genau zählen die Zellzahlen vor der Beschichtung. Plattieren Sphären oder Plattieren zu viele Zellen, die Ergebnisse in die Verklumpung, können verhindern, dass Zellen migrieren durch kleine Poren (Abb. 4A und 4 b). Es ist auch wichtig, Luftblasen vermeiden, wenn die Zellen in der Chemotaxis Migration Platte Beschichtung oder Membran einfügen auf den unteren Behälter platzieren. Bläschen können die Fokusebene zu ändern und verhindern genaue Quantifizierung (Abbildung 4). Die gesamte Platte muss mit einer dünnen Schicht von Kollagen beschichtet werden, weil dadurch Zellen eine Oberfläche navigieren auf die Poren in der Platte, wie dieser Test erfordert Zellen zur Einhaltung und migrieren Sie anschließend über eine biologisch relevante Fläche in Richtung der lockstoffgradient.
Hier beschriebene BTSC-Migration-Protokoll ermöglicht die kinetische Beurteilung der einzelnen Zellwanderung, erfordern weniger Zellen zum Testen von verschiedenen Behandlungsbedingungen im Vergleich zu bestehenden Protokolle. Dies ist wichtig für Kulturen, die sehr langsam wachsen, wie es schwierig ist, eine große Anzahl von Zellen für Experimente zu sammeln. Die niedrige Pore Dichte der Chemotaxis Migration Platte ermöglicht eine langsamere Gleichgewichtherstellung des lockstoffgradient Gradienten, größer als 72 h und effektiver imitiert den biologischen Prozess der chemotaktische Migration über einen längeren Zeitraum hinweg. Das Protokoll wurde optimiert, um eine sehr dünne Schicht von Kollagen-Beschichtung auf der Chemotaxis-Migration-Platte um sicherzustellen, dass die Assays Maßnahmen Migration und nicht Invasion haben. Es erleichtert auch Bildgebung und die Quantifizierung der einzelnen Zellen, wie sie die Kollagen-Matrix, die Beschichtung des Membran Einsatzes entsprechen. Eine Einschränkung der Technik ist jedoch, dass die Quantifizierung der Migration über mehrere Brunnen im Laufe der Zeit stark vereinfachten und beschleunigten mit kommerzieller Software ist (siehe Tabelle der Materialien). Ein bemerkenswerter Vorteil den Migration-Assay ist wie hier beschrieben die Breite Anpassungsfähigkeit des Protokolls zu anderen Zelltypen. Es werden besonders nützlich für die Quantifizierung der chemotaktische Migration von Zelllinien, die entweder langsam wachsend, schwer zu halten, oder langsam zu migrieren.
Um den Erfolg des BTSC Invasion Assays zu gewährleisten, ist es notwendig, neurosphären zu sammeln, bevor sie größer werden als 200 µm. größere Kugeln eine Fokusebene haben, die ist zu groß, um konsequent Bild und zu quantifizieren (Abbildung 5). Darüber hinaus können neurosphären beginnen, verklumpen und Aggregieren mit anderen neurosphären. Dies wirkt sich auf den Erwerb von präzise und konsistente Daten. Darüber hinaus ist es wichtig, dass die neurosphären auf der Unterseite des Brunnens zu begleichen dürfen, während das Kollagen noch auf Eis, um den neurosphären, in einer Ebene der Fokus (Abbildung 5) abgebildet werden können. Ebenso ist es wichtig, erlauben das Kollagen auf voll setzen, ohne die Platte zu verschieben, da dies die Bildung einer sogar Matrix stören kann, was sich negativ auf die Bildqualität (Abbildung 5) beeinträchtigt. Für den BTSC Invasion Assay hier beschrieben ist einer der großen Vorteile, dass BTSCs als neurosphären kultiviert für Invasion direkt, ohne die Notwendigkeit, adherently angebaut werden, beurteilt werden können. Darüber hinaus können BTSC neurosphären in eine extrazelluläre Matrix, entweder mit einzelnen Komponenten der extrazellulären Matrix von einem bestimmten Gewebe oder mit Hilfe einer handelsüblichen Basalmembran Mischung eingebettet werden. Angabe der extrazellulären Matrix kann helfen, zu identifizieren oder spezifische Mechanismen der Invasion zu testen. Mit diesem Protokoll ist es beispielsweise möglich, die Auswirkungen des Zielens Einzelmitglieder der Matrix Metallopeptidase Familie von Genen, die bekannt sind, bestimmte Matrixbestandteilen zu degradieren. Alternativ, obwohl dieses Protokoll für BTSC neurosphären spezifisch ist, können alle Zellen gewachsen als Kugeln in ähnlicher Weise verwendet werden. Beispiele sind die Brustkrebs-Zellen kultiviert als Mammospheres oder primäre colorectal Krebszellen als Tumorspheres kultiviert. Dies schränkt jedoch die Technik, um Zelltypen, die als Kugeln in einer Kultur wachsen können. Weitere Vorteile der Migration und Invasion Assays sind, dass sie sind einfach einzurichten, sie in einem 96-Well-Format arbeiten und die Daten im Laufe der Zeit messbar sind.
Alles in allem um Nachbehandlung GBM Wiederholung zu vermeiden, ist es wichtig, Methoden zu entwickeln, die die Untersuchung der BTSC Migration und Invasion zu erleichtern. Die hier beschriebene Migration-Protokoll bietet viele Vorteile gegenüber vorher festgelegten Migration Assays, vor allem für das Studium der GBM BTSCs. Dieses verbesserte Migration-Protokoll beinhaltet Wehre BTSCs unter neurosphäre Bedingungen kultiviert und Beschichtung einzelne Zellen in einer 96-Well Kollagen beschichtet Chemotaxis-Migration-Platte. Mit einer live-Cell-imaging-System, kann die Migration von BTSCs überwacht und quantifiziert im Laufe der Zeit. Die hier beschriebenen Invasion-Assay ermöglicht die Überwachung des BTSC Invasionen von Neurospheres in einer Matrix. Dieser Test beinhaltet Einbettung der neurosphären in eine Kollagen-Matrix oder einem anderen Protein-reiche extrazelluläre Matrix, in einer 96-Well-Platte. Bildgebung der Platte mit einer Leben-Zelle Zeitraffer-imaging-System ermöglicht die Analyse der BTSC Invasionen unter verschiedenen Behandlungsbedingungen im Laufe der Zeit. Diese Assays, bieten daher ein wertvolles Werkzeug für Wissenschaftler in der Hoffnung, besser zu verstehen, die Mechanismen BTSC Migration und Invasion.

Glioblastom (GBM) ist die am weitesten verbreitete und aggressive Form von Hirntumoren und, trotz der aktuellen Therapie chirurgische Resektion mit gefolgt von Bestrahlung und Chemotherapie, die mediane Überlebenszeit der Patienten ist eine bloße 15 Monate1. GBM ist invasiv, sehr resistente und letztlich eine unheilbare Krankheit, die erfordert forschte weiter in seiner inhärenten Biologie um neue therapeutische Wege zu identifizieren. Die hohe Sterblichkeit der GBM-Patienten entsteht vor allem durch die umfangreichen zellulären Invasion in angrenzende normalen Hirngewebe und die Migration auf Blutgefäße, führt zu einem erneuten Auftreten der Erkrankung nach der Behandlung2,3 . Eine Teilmenge von Zellen, Gehirn Tumorstammzellen (BTSCs), die langsam bezeichnet, Radsport und therapeutisch beständig, wurde vermutet, um zu Wiederauftreten der Krankheit führen. GBM BTSCs zeigen Sie Eigenschaften der klonogenen Selbsterneuerung, Multipotenz und Tumor-initiierenden potenzielle4,5,6. BTSCs behalten auch die genetische, Molekulare und phänotypische Heterogenität ihrer Eltern GBM Tumoren7,8,9,10. Diese Eigenschaften machen BTSCs ein äußerst nützliches Modellsystem für das Studium der GBM und neue therapeutische Strategien zu erkunden. In Vivo, diese Stamm-ähnliche Zellen sind in der Lage, Tumorbildung, Wachstum und Invasion in die Gehirne von Neugeborenen Ratten11 implantiert und nicht adipösen Diabetiker/schwere kombinierte Immundefizienz (NOD/SCID) Mäuse4. Die Fähigkeit der BTSCs, immer wieder bilden invasive Tumoren in Vivo , die die zellulären und histologischen Merkmale von ihrer ursprünglichen Tumoren stark rekapitulieren unterstützt ihre Rolle als Tumor-initiierenden Zellen12.
Neue therapeutische Ansätze zum Ziel BTSCs entstehen, und die Langzeitprognose für GBM-Patienten verbessern. Derzeit gibt es begrenzte Verständnis der zellulären Migration und Invasion, die therapeutischen Widerstand und Rezidiv zugeordnet sind. Migration und Invasion sind unterschiedliche Phänomene; Migration ist der Prozess zugrunde gerichtete Bewegung von Zellen und beinhaltet die Reorganisation des Zytoskeletts, Adhäsionsmoleküle und Montage/Demontage von fokalen Kontaktstellen, während Invasion auch die physische Vernichtung von Barrieren erfordert wie eine extrazelluläre Matrix13. Eine weithin anerkannte Methode des Studiums Zelle Migration und Invasion ist die Boyden Kammer Assay14,15. Für diese Technik ist eine Doppelkammer mit Medien, mit den Medien in die untere Kammer, ergänzt mit einer lockstoffgradient gefüllt. Chemotaxis ist mit spezifischen Wachstumsfaktoren oder Zytokine oder fötalen Rinderserum als eine unspezifische lockstoffgradient ausgelöst. Im Anschluss an die Steigung der lockstoffgradient Zellen durchwandern die poröse Membran. Am Endpunkt werden die migrierten Zellen visualisiert und auf der Unterseite der Membran durch Färbung mit zytologischen oder fluoreszierende Farbstoffe quantifiziert. Boyden Migration Assay, eine Invasion-Assay kann geändert werden, durch die poröse Beschichtung mit Komponenten der extrazellulären Matrix wie Typ filtern ich Kollagen oder einer Basalmembran-wie Matrix. Invasive Zellen beeinträchtigen die Matrix, an der Unterseite des porösen Filter durchlaufen und in einer ähnlichen Weise zu den Migration-Assay quantifiziert werden können. Andere häufig verwendete Migration Assays gehören die neu gewickelt und Zelle Sperrzone assays13. Der Scratch Wunde Test erfolgt durch eine Lücke in einer zellulären Monolage kratzen und die Wanderung von Zellen vom Rand der Wunde durch Bildgebung in regelmäßigen Abständen zu beobachten, bis die Kratzer geschlossen wird. In der Zelle-Ausschluss-Assay ist eine physikalische Barriere verwendet, um eine Zelle-freie Zone vor der Aussaat von Zellen zu erstellen. Die Barriere ist einmal entfernt die Zellen sind konfluierende und die Migration der Zellen in der Zelle-freie Zone ist abgebildet regelmäßig16.
Diese zuvor etablierte Assays häufig verwendet werden, für das Studium der Migration oder der Invasion von anhaftenden und homogene Zellpopulationen aber stellen erhebliche Nachteile bei der GBM BTSCs oder andere heterogene Krebs-Zell-Populationen zu studieren. Die Boyden Kammer-Assay kann nur Endpunkt Messungen im Vergleich zu einer kinetischen Beurteilung der Zelle Bewegung erzeugen. Eine Beobachtung im Laufe der Zeit ist von hoher Relevanz für die Messung der BTSC Migration, angesichts der Tatsache, dass Zellen aus verschiedenen Kulturen mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten oft Wandern. So, die Bedingungen und der Zeitpunkt des Tests muss für jede Kultur optimiert werden und erfordert zeitintensive Arbeit für die angemessene Stichproben und Quantifizierung. Kratzer und Zelle unter Ausschluss Assays sind nicht gut geeignet für BTSC Kulturen, wie auch bei BTSCs unter den Bedingungen der Monolage auf Laminin-beschichteten Platten kultiviert werden, wir beobachtet haben, dass BTSCs scheinen zu widerstehen Bewegung in den offenen Raum und lieber in der Nähe die Nähe zu anderen Zellen. Darüber hinaus etabliert diese Migration Assays für die Visualisierung und Überwachung der einzelnen Zellen im ganzen ein Experiment nicht zulassen. Die Überwachung der einzelnen Zellen im Laufe der Zeit ist wertvoll für die Bewertung der Migration in heterogenen Zellpopulationen wie BTSCs. zusätzliche Nachteile von Boyden Kammer, Scratch und Zelle-Ausschluss-Zone Assays für BTSC-Kulturen, die sie erfordert relativ hohe Zellzahlen kann zeitaufwändig einzurichten, und entweder schnell equilibrate oder verfügen nicht über einen lockstoffgradient Verlauf. Als solche sind diese Tests nicht ideal für seltene oder langsam wachsende Zellpopulationen oder Drogen-Screening zu verwenden. Darüber hinaus eignen sich diese Tests nicht zur Messung einer Invasion in einem dreidimensionalen (3D)-Format, was besonders wichtig für BTSCs unter neurosphäre Bedingungen gewachsen ist.
Hier beschreiben wir Assays, die speziell für die Beobachtung und Quantifizierung der Migration für einzelne BTSCs und für die Invasion der GBM BTSCs kultiviert als neurosphären modifiziert. Der erste Test wird eine Anpassung des Boyden Kammer Assays mit Leben-Zelle Zeitraffer Bildgebung und eine Chemotaxis-Migration-Platte um zu messen, chemotaktische Zelle Migration13beschrieben. Live-Cell Imaging in einer Multi-well-Format ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung der Zellwanderung unter mehreren Behandlungsbedingungen. Der zweite Test hier beschriebene ist ein Sphäroid Invasion Assay13,17, welche Maßnahmen die invasiven Eigenschaften des BTSCs unter neurosphäre Bedingungen kultiviert und eingebettet in eine 3D extrazelluläre Matrix unter verschiedenen Behandlung Bedingungen. Insgesamt sind diese Tests viel besser verträglich als die zuvor beschriebenen Methoden zur Untersuchung der Zugvögel und invasiven Eigenschaften der heterogenen BTSC Kulturen. Sie bieten auch bessere Möglichkeiten für die Untersuchung der neue therapeutische Strategien, Zielen, Migration und Invasion, die erheblich zur Krankheit Wiederholung und Letalität beitragen.

<table><tbody><tr><td>Rattenkollagen I</td><td>Trevigen</td><td>3440-100-01</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel-Matrix</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>VWR</td><td>BDH3247-1</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Millipore Sigma</td><td>AX0073-6</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platten</td><td>Eppendorf</td><td>30730119</td><td></td></tr><tr><td>T25 Nunc EasYFlask</td><td>ThermoFisher</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15ml konisches Röhrchen</td><td>ThermoFisher</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Incucyte ClearView 96-Well Chemotaxis Platte</td><td>Essen Bioscience</td><td>4582</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis System</td><td>Essen Bioscience</td><td>4545</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte Zoom Live-Cell Analysis Software</td><td>Essen Bioscience</td><td>2016A Rev1</td><td></td></tr><tr><td>Accumax Lösung</td> <td>zur ZellablösungInnovative Zelltechnologien</td><td>AM105</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin, Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Wasser in Kulturqualität</td><td>Lonza BioWhittaker</td><td>17-724Q</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>12483-020</td><td></td></tr></tbody></table>

live cell imaging-assays studie glioblastom gehirn tumor stammzellen migration und invasion

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Glioblastom (GBM) ist einem aggressiven Hirntumor, die schlecht mit den derzeit verfügbaren Behandlungsmöglichkeiten gesteuert wird. Wichtige Merkmale der GBMs sind rasante Verbreitung und durchdringende Invasion in das normale Gehirn. Wiederholung wird gedacht, um aus dem Vorhandensein von Radio- und Chemotherapie-resistenten Gehirn Tumorstammzellen (BTSCs) führen, die vom Krebs Ausgangsmasse einzudringen und somit chirurgische Resektion zu entziehen. Therapien, die BTSCs und ihre invasiven Fähigkeiten abzielen können daher die sonst schlechte Prognose dieser Erkrankung verbessern. Unsere Gruppe und andere haben erfolgreich etabliert und BTSC Kulturen von GBM Patientenproben gekennzeichnet. Diese BTSC-Kulturen zeigen grundlegende Krebs Stammzell-Eigenschaften wie klonogenen Selbsterneuerung, Multi-Linie Differenzierung und Tumorentstehung in immundefiziente Mäuse. Um die aktuelle Therapieansätze für GBM zu verbessern, ist es notwendig, ein besseres Verständnis der Mechanismen der BTSC Migration und Invasion. Bei Glioblastom beschränkt sich die Untersuchung von Migration und Invasion, teilweise aufgrund der Einschränkungen der bestehenden Techniken, die nicht vollständig für die in-vitro- Wachstum-Eigenschaften des BTSCs als neurosphären ausmachen. Hier beschreiben wir schnelle und quantitative live-Cell imaging Assays um die Migration und Invasion Eigenschaften des BTSCs zu untersuchen. Die erste Methode beschrieben ist der BTSC Migration Probe, die die Migration in einem lockstoffgradient Verlauf Richtung misst. Die zweite Methode beschrieben ist der BTSC Invasion Assay welche Bilder und quantifiziert eine zelluläre Invasion vom neurosphären in einer Matrix. Die hier beschriebenen Assays werden für die Quantifizierung der BTSC Migration und Invasion im Laufe der Zeit und unter verschiedenen Behandlungsbedingungen verwendet.

Hier beschreiben wir Beispiele für Daten, die mit live Cell imaging Assays, um BTSC Migration und Invasion zu studieren gewonnen werden können. BTSCs sind als Einzelzellen beschichtet und kann als frei schwebenden neurosphären (Abbildung 1) angebaut werden. Wir zeigen, dass BTSCs getrennt werden können und plattiert in den Vertiefungen der Membran einfügen in eine Chemotaxis-Migration-Platte, die mit einer dünnen Schicht des Typs ich beschichtet ist Kollagen (Abbildung 2A). Individuelle BTSCs sind auf der Oberseite der Membran einfügen am Anfang des Tests gleichmäßig verteilt. Über einen Zeitraum von 24-72 h Zellen halten an der Membran, bewegen sich entlang der Kollagen-beschichtete Oberfläche und Wandern durch eines der 96 kleinen Poren an der Unterseite der Membran, in Richtung einer lockstoffgradient in das Reservoir gut. Nach dem Markieren der Zellen auf der Oberseite der Membrane in gelb, die Poren in blau, und die Zellen auf der Unterseite der Membran in rot, Zellen zu sehen in der Pore auf der Oberseite (gelbe Zelle nähert sich eine blaue Pore) betreten und verlassen der Pore auf der Unterseite (Erythrozyten Ausfahrt Ing der blauen Pore) (Abbildung 3). Wichtig ist, kann die Zellen Medikament behandelten und plattiert in der gleichen Chemotaxis-Migration-Platte als Fahrzeug-behandelte Kontrollzellen, die Wirkung von therapeutischen Interventionen auf BTSC Migration (Abb. 2 b) zu studieren. Die Chemotaxis-Migration-Platte ermöglicht die Darstellung von Zellen auf der Oberseite und an der Unterseite der Membran einfügen. Daher lässt sich Quantifizierung der Zellwanderung im Laufe der Zeit durch das zählen der Zellen, die an der Unterseite der Membran (Abbildung 2) migriert haben.
Wir haben festgestellt, dass BTSCs nicht vollständig dissoziiert sind, dann Zellen nicht durch die Poren zu migrieren und als kleine neurosphären (Abb. 4A bleiben). Es ist auch wichtig, keine Platte mehr als 2.500 BTSCs/gut als dieses Ergebnis in Zelle Verklumpung statt in Migration an der Unterseite der Membran (Abbildung 4 b). Zu guter Letzt gilt es zu verhindern, dass Luftblasen in der Membran Wells einfügen, wenn Zellen und wenn fügen Sie platzieren die Membran auf der unteren Stausee, Plattieren, wie dies verhindert, genaue Bildgebung und Quantifizierung (Abbildung 4 dass).
Als Nächstes zeigen wir, dass BTSC Invasion von Neurospheres in der umgebenden Matrix abgebildet und im Laufe der Zeit in eine 96-Well-Plattenformat (Abbildung 5A) quantifiziert werden kann. Invasion kann gemessen werden, indem die Oberfläche der Zellen zu quantifizieren, da sie im Laufe der Zeit in die Matrix eindringen. Bildanalyse-Software verwenden, wurde eine Definition der Verarbeitung angewendet, dass Überlagerungen eine Maske auf der Zelle Oberfläche, ermöglicht eine automatische Quantifizierung im Laufe der Zeit (Abbildung 5 b). Zeitraffer-Videos der BTSC Invasionen können auch erstellt werden, um den Gesamtprozess der BTSC Invasion (Abbildung 6) leicht zu beobachten. Darüber hinaus kann Fluoreszenz-Mikroskopie auf Bild BTSCs verwendet werden, die fluoreszierende Proteine, wie z. B. grün fluoreszierendes Protein (GFP) oder rot fluoreszierenden Proteins (RFP) Ausdrücken. Hier schufen wir einen Zeitraffer-Video von BTSCs mit dem Ausdruck einer cytosolischen Form der GLP zu helfen, individuelle BTSCs zu verfolgen, wie sie eine Basalmembran-wie Matrix (Abbildung 7) eindringen. Dieser BTSC neurosphäre Invasion Assay ermöglicht auch medikamentöse Behandlungen in replizieren Brunnen hinzugefügt werden um direkt die Bewertung ihrer Auswirkungen auf BTSC Invasion von Neurospheres in einer Matrix (Abbildung 8A). Die Quantifizierung von mehreren Neurospheres in replizieren Brunnen werden berechnet und im Laufe der Zeit zur Beurteilung der Wirkung von Drogen bei mehreren Konzentrationen (Abbildung 8 b) grafisch dargestellt.
Nichtbeachtung der oben beschriebenen Protokoll führt zu einer Unfähigkeit, zuverlässige und genaue Daten zu erhalten. Einbetten von BTSC-neurosphären, die zu groß sind, führt mit einem Durchmesser größer als 200 µm auf eine Ebene konzentrieren, die zu groß ist, alle Kugeln in ein Sichtfeld (Abbildung 8) genau zu quantifizieren. Ebenso kann die Matrix bei 4 ° C beibehalten und Einbettung der neurosphären auch zu Sphären führen, die nicht auf derselben Ebene der Fokus und eine extrazelluläre Matrix, die nicht gleichmäßig, erstarrt ist die Sammlung von Daten (Abbildung 8 verhindert ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58152/58152fig1.jpg"> Abbildung 1: Kultivierung BTSCs. Diese Platten sind ein repräsentatives Beispiel für BTSCs von Einzelzellen zu neurosphären über einen Zeitraum von 14-d in der Kultur gewachsen. Die hier gezeigten am 14. Tag neurosphären sind in angemessener Höhe für passagierung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58152/58152fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58152/58152fig2.jpg"> Abbildung 2: Live Cell Imaging der BTSC Migration. (A) Dies ist ein Beispiel einer 96-Well-Chemotaxis Migration Platte beschichtet mit einer dünnen Schicht des Typs Kollagen vor der Durchführung des Migration Tests mit BTSCs. Die Bilder zeigen (i) eine Platte mit allen drei Teilen (Deckel, Membran einfügen und Reservoir) zusammengerückt, (Ii) alle drei Teile getrennt, (Iii) eine Nahaufnahme der Draufsicht des Einsatzes Membran, (iv) eine Nahaufnahme der Untersicht der Membran einfügen und V) eine Nahaufnahme des unteren Behälters. (B) sind repräsentative Bilder einer BTSC-Migration zu Beginn des Experiments (0 h) und um 24 Uhr. Die Bildschärfe ist auf der Oberseite der Membran einfügen, wo die Zellen ursprünglich vergoldet wurden. Zellen, die an der Unterseite der Platte Chemotaxis Migration migriert haben werden in rot hervorgehoben. Um 0 Uhr haben ein paar Zellen an der Unterseite der Membran migriert. Die Anzahl der migrierten Zellen sind nach 24 h sprunghaft angestiegen. Der Vergleich der Bilder bei 24 h für Zellen behandelt mit einem Fahrzeug vs. Medikament X zeigt, dass die medikamentöse Behandlung BTSC Migration verringert. Die Skala Bars stellen 600 µm. (C) dieser Bereich zeigt die Quantifizierung einer BTSC-Migration nach Vorbehandlung mit einem Fahrzeug oder einem Medikament X. Die Grafik zeigt, dass die medikamentöse Behandlung eine starke Wirkung auf die Migration von BTSCs hat. Die Datenpunkte sind der Mittelwert der drei technischen replizieren Brunnen und der Fehlerbalken stellen Standardabweichung (SD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58152/58152fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58152/58152fig3.jpg"> Animierte Abbildung 3: BTSC Migration Zeitraffervideos. Dieses Video zeigt die Migration von BTSCs mit Hilfe einer Art ich Kollagen-beschichtete Chemotaxis Migration Platte. Zellen auf der Oberseite der Membran einfügen werden in gelb hervorgehoben, Zellen, die an der Unterseite der Membran Einlage migriert haben werden in rot hervorgehoben, und die Poren in der Membran sind blau hervorgehoben. Die Fokusebene ist Bildzellen auf der Unterseite der Membran festgelegt. Das Video wurde mit Zeitraffer Bilder stündlich für 51 h genommen und kompiliert mit 4 Bildern pro Sekunde erzeugt. Die Maßstabsleiste stellt 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58152/JOVE_Fig_3.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58152/58152fig4.jpg"> Abbildung 4: Beispiele für Fehler bei der Migration Assay Einrichtung. (A) dieses Panel zeigt ein Beispiel für BTSCs, die vor der Beschichtung auf dem oberen Membran-Einsatz der Chemotaxis Migration Platte nicht vollständig getrennt waren. Aufgrund der Größe der Kugeln und die geringe Größe der Membranporen sind die Zellen nicht in der Lage, in den unteren Behälter zu migrieren. (B) dieses Panel zeigt ein Beispiel für eine Migration-Assay wo zu viele Zellen überzogen waren. Die Verklumpung der Zellen Zellwanderung stört und beeinträchtigt Quantifizierung. (C) dieses Panel zeigt ein Beispiel der Blasenbildung auf der Membran einfügen wo BTSCs überzogen wurden. Luftblasen führen zu schlechter Bildqualität und verhindern eine genaue Quantifizierung der Migration. Der Maßstabsbalken repräsentieren 600 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58152/58152fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58152/58152fig5.jpg"> Abbildung 5: BTSC neurosphäre Invasion Assay. Diese Tafeln zeigen ein Beispiel für BTSCs aus einem neurosphäre einmarschierten, in eine Art von 0,4 mg/mL ich Kollagen-Matrix über einen Zeitraum von 6 h. Hier werden (A) Phase kontrastreiche Bilder zu jedem Zeitpunkt (B) mit der repräsentativen quantitative Maske überlagert, gezeigt, wie ausführlich im Protokoll Schritt 3 beschrieben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58152/58152fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58152/58152fig6.jpg"> Abbildung 6: BTSC neurosphäre Invasion Zeitraffer-Video in Typ I Kollagen. Dieses video zeigt eine Invasion der BTSCs aus einem neurosphäre in einem 0,4 mg/mL Typ I Kollagen-Matrix (auch dargestellt als Standbilder in Abb. 5A). Die Bilder wurden mit einem 10 X-Objektiv stündlich für 12 h erworben und mit 4 Bildern pro Sekunde zusammengestellt. Die Maßstabsleiste vertritt 300 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58152/JOVE_Fig_6.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58152/58152fig7.jpg"> Abbildung 7: BTSC neurosphäre Invasion Zeitraffer-Video in einer Basalmembran-ähnliche Matrix. Dieses Video zeigt eine Invasion von BTSCs, dass ausdrückliche cytosolischen GFP aus einer neurosphäre in eine Basalmembran-wie Matrix. Die Bilder mit einem 4 X Objektiv alle 30 min. für 48 h erworben wurden und mit 8 Bildern pro Sekunde erstellt wurden. Die Maßstabsleiste stellt 800 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58152/JOVE_Fig_7.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie hier um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58152/58152fig8.jpg"> Abbildung 8: BTSC neurosphäre Invasion Assay mit Behandlung. (A) BTSC neurosphären waren eingebettet in einer Basalmembran-wie Matrix, zubereitet mit Fahrzeug oder die angegebenen Konzentrationen des Medikaments X. Bilder stündlich erworben wurden; hier gezeigten sind Bilder zum Zeitpunkt der Beschichtung und nach 16 Uhr aufgenommen. Die Maßstabsleiste stellt 200 µm. (B), die eine Invasion von BTSCs von Neurospheres in der umgebenden Matrix stündlich, quantifiziert wurde, wie im Protokoll Schritt 3 beschrieben. Die Datenpunkte sind der Mittelwert der drei technischen replizieren Brunnen und Fehlerindikatoren repräsentieren den Standardfehler des Mittelwertes (SEM). (C) dieses Panel zeigt BTSC neurosphären eingebettet in Typ ich Kollagen mit einer Kugel, die zu groß für die Quantifizierung. Die Maßstabsleiste vertritt 300 µm. (D), die dieses Panel zeigt BTSC neurosphären eingebettet in Art Kollagen, die nicht vollständig festgelegt haben. Die Maßstabsleiste vertritt 300 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58152/58152fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Vorbereitung der Kollagen-Lösung</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lager [Kollagen] (mg/ml)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Finale [Kollagen] (mg/ml)</td>
			<td>0,4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anzahl der benötigten Kavitäten:</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gesamtvolumen (μl)</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volumen der Lager Kollagen (μl)</td>
			<td>40</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volumen von 1N NaOH (μl)</td>
			<td>0,92</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volumen von Medien (μl)</td>
			<td>459</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Vorbereitung von 0,4 mg/mL Typ I Kollagen Lösung. Aufgeführt sind die bekannten starten und gewünschte Endkonzentrationen des Typs ich Kollagen-Lösung. Die Bände aufgeführt sind ausreichend, um Platte neurosphären in drei replizieren Brunnen, plus zwei für zuviel, und können eine Einzelbehandlung Bedingung enthalten, wie ausführlich im Protokoll Schritt 3 beschrieben.

Hier beschreiben wir Leben-Zelle bildgebende Verfahren um die Migration und Invasion von Glioblastom Gehirn Tumor-Stammzellen im Laufe der Zeit und unter mehreren Behandlungsbedingungen quantitativ zu messen.

Live Cell Imaging-Assays Studie Glioblastom Gehirn Tumor Stammzellen Migration und Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Biologie von Glioblastomen, Hirntumoren, Stammzellen oder BTSC zu beantworten, indem sie die Identifizierung neuer Ansätze zur Hemmung von Migration und Invasion erleichtert. Der Hauptvorteil dieser Techniken besteht darin, dass sie die Quantifizierung der BTSC-Migration und -Invasion im Laufe der Zeit unter mehreren Bedingungen ermöglichen. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Glioblastomtherapie, da die Migration und Invasion von Krebszellen in normales Hirngewebe zum Wiederauftreten der Krankheit beiträgt.Obwohl diese Methode Aufschluss darüber geben kann, wie BTSCs migrieren und eindringen, kann sie auch auf Krebsstammzellen angewendet werden, die aus anderen Tumorarten stammen. Beginnen Sie damit, ein Fläschchen mit kryogenisch konservierten BTSCs in einem Becherglas mit 70 % Ethanol aufzutauen, das in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad gestellt wird, bis das letzte Eis aufgetaut ist. Verdünnen Sie die aufgetauten Zellen und 10 Milliliter des Mediums in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen für die Zentrifugation und resuspendieren Sie das BTSC-Pellet in acht Millilitern des vollständigen Mediums.Die Zellen werden für 10 bis 14 Tage unter nicht adhärenten Bedingungen in einen T25-Kulturkolben überführt, den Kolben täglich überwacht und die Zellen bei Bedarf mit ein bis zwei Millilitern frischem vollständigem Medium ergänzt. Wenn die Neurosphären einen Durchmesser von etwa 250 Mikrometern erreicht haben, wird das Medium mit einer Pipette über den Boden des Kolbens gespült, um alle anhaftenden Zellen abzulösen, und der Überstand zur Zentrifugation in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt. Um die BTSC-Neurosphären in einzelne Zellen zu zerlegen, resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter vorgewärmter Zellablösungslösung und inkubieren Sie es sieben Minuten lang bei 37 Grad Celsius, gefolgt von 40 Verreibungen mit einer P1000-Mikropipette, die auf 800 Mikroliter eingestellt ist.Wenn die Zellen vollständig dissoziiert sind, geben Sie fünf Milliliter PBS, ergänzt mit Antibiotika, für eine weitere Zentrifugation in das Röhrchen und resuspendieren Sie das Pellet in einem bis vier Millilitern vollständigem Medium, je nach Größe des Pellets. Dann säen Sie zwei- bis dreimal 10 bis fünfte Zellen in acht Milliliter vollständiges Medium pro T25-Kolben aus und überführen Sie die Kolben für ein bis zwei Wochen in den Zellkultur-Inkubator. Um die Auswirkungen einer medikamentösen Behandlung von Interesse auf die Migration zu beurteilen, werden die Zellen zunächst für einen geeigneten Versuchszeitraum mit der entsprechenden Konzentration des Medikaments vorbehandelt.Um die Chemotaxisplatte vorzubereiten, beschichten Sie drei Membraneinsatz-Wells und drei Bodenreservoir-Wells pro Bedingung einer 96-Well-Chemotaxisplatte mit 75 bzw. 225 Mikrolitern 0,2 Milligramm pro Milliliter Typ-I-Kollagen für eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation aspirieren Sie die Kollagenlösung aus jeder Vertiefung, ohne die Kollagenbeschichtung zu zerkratzen, und waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit sterilem PBS. Entfernen Sie nach dem letzten Waschen den Einsatz von der Platte und geben Sie 225 Mikroliter wachstumsfaktorfreies Medium, ergänzt mit 10 % FBS, in jede Vertiefung des unteren Reservoirs der Chemotaxisplatte.Setzen Sie dann den oberen Einsatz vorsichtig schräg in den unteren Behälter zurück, um Blasenbildung zu vermeiden, und geben Sie 2,5 mal 10 zu den dritten dissoziierten BTSCs in 50 Mikrolitern wachstumsfaktorfreiem Medium in jede Einsatzvertiefung. Es ist wichtig, die BTSCs vollständig in einzelne Zellen zu dissoziieren und sie vor dem Plattieren sorgfältig zu zählen, um Zellklumpen oder zu viele Zellen im oberen Einsatz zu vermeiden. Um die BTSC-Migration entlang des FBS-Gradienten abzubilden, platzieren Sie die Platte in einem Lebendzell-Bildgebungssystem und stellen Sie die automatisierte Bildgebungssoftware so ein, dass sie bis zu 72 Stunden lang alle ein bis zwei Stunden mikroskopische Bilder der Platte aufnimmt.Wenn die Bildaufnahme abgeschlossen ist, wählen Sie eine neue Verarbeitungsdefinition, um die BTSCs von ihren Einsatzporen auf der Unterseite der Membran zu unterscheiden, und ändern Sie die Analyse, wenn sie die Zellen nicht wie nötig genau von der Hintergrundmembran unterscheidet. Um die Zellen zu quantifizieren, die durch die Poren gewandert sind, sammeln Sie die Daten als Zelloberfläche auf der Unterseite der Membran für jedes der drei Replikationswells pro Bedingung und stellen Sie dann die Zellmigration als die Fläche der Zellen im Quadrat der Zeit in Mikrometerquadraten grafisch dar. Um die BTSC-Neurosphäreninvasion zu beurteilen, geben Sie zunächst die interessierende Verbindung in der gewünschten Konzentration für den vorgegebenen Zeitverlauf vor der Neurosphäreninvasion in den Kolben.Wenn die durchschnittliche Neurosphärengröße etwa 150 bis 200 Mikrometer erreicht, kippen und mischen Sie den Kolben vorsichtig mit einer Pipette und übertragen Sie 500 Mikroliter der resuspendierten BTSC-Neurosphären in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen pro Versuchsbedingung auf Eis. Aspirieren Sie so viel wie möglich des Mediums vom Boden jedes 1,5-Milliliter-Röhrchens, ohne das Neurosphären-Pellet zu verlieren, und resuspendieren Sie die Neurosphären vorsichtig in 500 Mikrolitern frisch zubereiteter 0,4 Milligramm pro Milliliter Typ-I-Kollagenlösung. Übertragen Sie 100 Mikroliter der kollagensuspendierten Neurosphären in drei Vertiefungen pro Bedingung auf eine neue 96-Well-Platte auf Eis und lassen Sie die Neurosphären fünf Minuten lang ruhen.Es ist wichtig, die Neurosphären fünf Minuten lang auf dem Eis ruhen zu lassen. Andernfalls befinden sich die Kugeln für die Bildgebung nicht auf derselben Fokusebene. Nach fünf Minuten Kollagenpolymerisation im Zellkultur-Inkubator übertragen Sie die Platte in das Tablett des Lebendzell-Bildgebungssystems, um ein Referenzbild der Neurosphärengröße zum Zeitpunkt der Plattierung zu erhalten, bevor die Invasion beginnt.Stellen Sie dann die Software so ein, dass sie alle ein bis zwei Stunden Bilder aufnimmt, bis die Invasionsrate ein Plateau erreicht hat, in der Regel um 24 Stunden. Um die zunehmende Oberfläche der BTSCs abzubilden, während sie im Laufe der Zeit in die Matrix eindringen, verwenden Sie das 10X-Objektiv, um vier Bilder pro Vertiefung für jeden Satz von drei Replikationsvertiefungen aufzunehmen. Um die relative Zelloberfläche zu bestimmen, die als prozentualer Zusammenfluss der Vertiefung dargestellt wird, richten Sie eine Verarbeitungsdefinition ein, die die Zellen speziell vor dem Hintergrund der Vertiefung hervorhebt, erfassen Sie dann die Daten als Gesamtzelloberfläche für jede Vertiefung zu jedem Zeitpunkt, bestimmen Sie den Mittelwert der drei replizierten Vertiefungen. und die Invasion der BTSCs grafisch darzustellen, indem die zunehmende Zellfläche im Laufe der Zeit dargestellt wird.BTSCs, die als einzelne Zellen plattiert sind, können als frei schwebende Neurosphären gezüchtet werden. Die Neurosphären können dann mit einem Medikament von Interesse behandelt und für eine Chemotaxis-Analyse der Auswirkungen therapeutischer Interventionen auf die BTSC-Migration plattiert werden. Sind die BTSCs nicht vollständig dissoziiert, wandern die Zellen nicht durch die Poren und bleiben als kleine Neurosphären zurück.Wenn mehr als 2,5 mal 10 bis zu einem Drittel BTSCs pro Vertiefung plattiert werden, verklumpen die Zellen eher, als dass sie zu den unteren Seiten der Membranen wandern. Darüber hinaus ist es wichtig, Blasen in den Membraneinsatz-Wells beim Plattieren von Zellen oder beim Einsetzen des Membraneinsatzes in das untere Reservoir zu vermeiden, da Blasen eine genaue Zellbildgebung und -quantifizierung verhindern. Die BTSC-Invasion aus Neurosphären in die umgebende Matrix kann in einem 96-Well-Plattenformat abgebildet und über die Zeit gemessen werden.Die Wirkung therapeutischer Eingriffe auf die BTSC-Invasion kann durch Quantifizierung der Oberfläche der Zellen beurteilt werden, wenn sie im Laufe der Zeit in die Matrix eindringen. Die Einbettung von BTSC-Neurosphären mit einem Durchmesser von mehr als 200 Mikrometern führt zu einer Fokusebene, die zu groß ist, um alle Kugeln im Sichtfeld genau zu quantifizieren. In ähnlicher Weise kann ein Versäumnis, die Matrix bei vier Grad Celsius zu halten, während die Neurosphären für den Invasionsassay in Kollagen eingebettet werden, auch zu Kugeln führen, die sich nicht auf der gleichen Fokusebene mit einer extrazellulären Matrix befinden, die sich nicht gleichmäßig verfestigt, was eine genaue Datenerfassung verhindert.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Bedingungen für die medikamentöse Behandlung und die Bildaufnahmezeiten für jede untersuchte BTSC-Kultur zu optimieren. Dieses Verfahren kann auch modifiziert werden, um zusätzliche Fragen darüber zu beantworten, wie Krebsstammzellen aus anderen Tumorarten migrieren und in vitro eindringen. Diese Technik kann Forschern auf dem Gebiet der Krebsbiologie den Weg ebnen, um die In-vitro-Migration und -Invasion bei Glioblastom-BTSCs zu erforschen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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