Name: Hyaluronsäure basierte Hydrogele für 3-dimensionale Kultur des Patienten abgeleitet Glioblastom-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Lernen Sie die 3D-Kultur patientenabgeleiteter Glioblastom-Zellen in hyaluronsäurebasierten Hydrogelen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Behandlungsresistenzmechanismen in einer nativen Gehirnumgebung.

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Diese Arbeit wurde mit Mitteln aus dem NIH (R21NS093199) und der UCLA ARC 3R Award unterstützt. Unsere herzlichsten Dank gehen an das Labor von Dr. Harley Kornblum zur Bestimmung der HK301 und HK157-Zell-Linien. Wir danken auch UCLA Gewebe Pathologie Kern Labor (TPCL) für Kryoschneiden, Advanced Light Microscopy/Spektroskopie zentrale Einrichtung (ALMS) in California Nanosystems Institute (CNSI) an der UCLA für den Einsatz in der konfokalen Mikroskopie, UCLA Crump Institut für Molekulare Bildgebung für die Verwendung von IVIS-imaging-System, UCLA Molekulare Instrumentierung Center (MIC) für die Magnet-Resonanz-Spektroskopie und Flow Cytometry Kern in Jonsson umfassenden Cancer Center (Zusammenkunft) an der UCLA für die Bereitstellung von Messtechnik für Durchfluss zytometrie.

Alle menschlichen Gewebe Sammlung Schritte wurden unter institutionell zugelassenen Protokolle durchgeführt.
1. Thiolation von Hyaluronsäure
Hinweis: Molare Verhältnis sind in Bezug auf die Gesamtzahl der carboxylat-Gruppen angegeben, sofern nicht anders angegeben.
<ol><li>Lösen Sie 500 mg Natrium Hyaloronsäure (HA, 500-750 kDa auf) bei 10 mg/mL destilliertem, entionisiertem Wasser (DiH2O) im Autoklav sterilisiert, 250-mL-Erlenmeyerkolben. Rühren Sie die Lösung (~ 200 u/min) bei Raumtemperatur für 2 Stunden, um vollständig HA zu lösen. Verwenden Sie Stir Bar und magnetische rühren Platte weiterhin Reaktion rühren während Thiolation Verfahren.</li>
	<li>Mit 0,1 M Salzsäure (HCl), stellen Sie den pH-Wert der Lösung bis 5,5 HA. 69,6 mg (0,25 x Molverhältnis) 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Carbodiimide (EDC) abwiegen. Hinweis: Obwohl unaufgelöste EDC direkt an der HA-Lösung hinzugefügt werden kann, ist es in der Regel einfacher, EDC zunächst in 1 mL der DiH2O auflösen und dann schnell die EDC-Lösung zu den HA-Lösung hinzufügen. Pre-Auflösung in 1 mL DiH2O auch mit N-Hydroxysuccinimide (NHS) und Cystamine Dihydrocholoride erfolgt vor dem Hinzufügen der Reaktion in Schritten 1.3 und 1.4.</li>
	<li>Hinzu kommt die Reaktion 17,9 mg (0,125 x Molverhältnis) des NHS. Stellen Sie den pH-Wert der Reaktionslösung auf 5.5 mit 0,1 M HCl und inkubieren Sie die Reaktion für 45 Minuten bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Fügen Sie 70,0 mg (0,25 x Molverhältnis) Cystamine Dihydrochloride in der Reaktionslösung. Verwenden Sie 0, 1 M Natronlauge (NaOH) um pH bis 6,25 anzupassen. Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur über Nacht unter Rühren.</li>
	<li>Am nächsten Tag verwenden Sie 1 M NaOH zur Einstellung des pH-Wertes der Reaktionslösung auf rund 8. Hinzu kommt die Reaktion 192 mg (4 x Molverhältnis) Dithiothreitol (DTT). Passen Sie den pH-Wert wieder auf 8 nach Zugabe von DVB-t und verlassen Sie rühren für ca. 1-2 Stunden bei Raumtemperatur zu.</li>
	<li>Verwenden Sie 1 M HCl pH bis 4 einstellen. Das gesamte Reaktionsgemisch in eingeweichter Dialysemembran (Molekulargewicht Cut-off um 13 kDa) und Dialyse gegen DiH2O voreingestellt auf pH 4. Hinweis: Das Laufwerk DiH2O für Dialyse sollte mindestens 40-Mal das Volumen der reagierte HA-Lösung (z. B. 50 mL Probe in 2 L des DiH2O, pH 4).</li>
	<li>Ersetzen Sie die Dialyselösung (DiH2O, pH 4) zweimal täglich für 3 Tage bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Filtern Sie die dialysierten Lösung durch eine Membran 0,22 µm, Vakuum-gesteuerte Filter. Flash Einfrieren in flüssigem Stickstoff Lösung von Thiolated HA. Verwenden Sie ein Gefriertrockner, um trockene Proben über 2 Tage einfrieren. Thiolated HA in trockenform können in einer vakuumdichten Exsikkator bei-20 ° C für mindestens 6 Monate gespeichert werden.</li>
	<li>Um den Grad der Thiolation zu ermitteln, verwenden Sie Ellman Test bzw. Proton NMR Spektroskopie30,31.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Vernetzungsgrad Materialien
<ol><li>Lösen Sie Thiolated HA auf die gewünschte Konzentration (in diesem Beispiel 13,3 mg/mL) in HEPES-gepufferte Kochsalzlösung (20 mM HEPES Hank es ausgewogene Salz Saline (HBSS) Puffer, so angepasst, dass in einem pH-Wert von 8 bis 9 fallen auf) in eine bernsteinfarbene Durchstechflasche zu minimieren Umgebungslicht. Halten Sie die Lösung unter ständigem Rühren. Hinweis: Bildung von Disulfid-Bindungen zwischen Thiole konjugiert, HA kann auftreten, wenn der pH-Wert über 8, Lösungskonzentration zu hoch ist oder die Lösung bleibt auch lange vorher Gelierung rühren. Um dieses Problem zu vermeiden, verwenden Sie unterhalb von 15 mg/mL von Thiolated HA und Auflösen von Thiolated HA innerhalb von 2 Stunden Hydrogele zu bilden.</li>
	<li>Lösen sich 4-Arm-PEG-Maleimide (PEG-Mal, 20 kDa) und 4-Arm-PEG-Thiol (PEG-Thiol, 20 kDa) in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, 50 mg/mL PEG-Mal und PEG-Thiol Stammlösungen vorzubereiten. Hinweis: Es dauert mindestens 1 Stunde, PEG Reagenzien vollständig aufzulösen.</li>
	<li>Wenn ECM-abgeleitete Peptide hinzufügen, lösen Sie Cystein-haltiger Peptide in PBS eine Stammlösung vorbereiten auf. Hinweis: Verwenden Sie eine Lager Konzentration von 2-4 mM.</li>
	<li>Silikon-Kautschuk-Einweichen formt in Ethanol für mindestens 20 min, reinigen Sie und dann Autoklav für die Sterilisation.</li>
</ol>3. Hydrogel Vernetzung und Zelle Kapselung
Hinweis: als Beispiel hier ist die Kapselung der vier einzelnen, 80 µL Hydrogele mit 0,5 % (w/V) HA und Druckfestigkeit Elastizitätsmodul von 1 kPa beschrieben3. Siehe Tabelle 1 für Beispiel Rezepte, die Hydrogele mit unterschiedlichen Eigenschaften ergeben: zwei Hydrogele unter Einbeziehung der Integrin-Bindung-Peptid RGD und zwei Hydrogele mit Cystein Kappen als Negativkontrolle für Peptid-Aktivität. Seeding Konzentration des Patienten abgeleitet GBM-Zellen wird 500.000 Zellen/mL.
<ol><li>Verdünnen Sie PEG-Mal-Stammlösung (50 mg/mL, ab Schritt 2.2) bis 12,5 mg/mL durch Zugabe von 40 µL der Stammlösung 120 µL PBS. Die verdünnte Lösung in zwei 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen aufgeteilt, so dass jedes Rohr 80 µL hat.</li>
	<li>Fügen Sie 16 µL Lager RGD Lösung (2,8 mM, ab Schritt 2.3) für eine Röhre und 16 µL Lager Cystein-Lösung (ab Schritt 2,3 2,8 mM) mit dem zweiten Rohr. Vortex mischen. Legen Sie die PEG-Mal-RGD oder PEG-Mal-CYS Lösungen auf Eis bis zur Verwendung in Schritt 3,9. Hinweis: Das Verfahren wie hier beschrieben Erträge Hydrogele mit ca. 140 µM Peptid. Dies entspricht ungefähr 1 aus jeden 8 verfügbaren PEG Armen besetzt mit einem Peptid. Dies kann durch die Änderung des molaren Verhältnis von Cystein-terminierte Peptide zur Verfügung Maleimide Gruppen variiert werden. Im Allgemeinen kann eine maximale Konzentration von 280 µM Peptid erreicht werden, während immer noch ausreichende Zahl von Maleimide Gruppen für Hydrogel Vernetzung zur Verfügung.</li>
	<li>Verdünnen Sie die PEG-Thiol-Stammlösung (50 mg/mL, ab Schritt 2.2) bis 5 mg/mL durch Mischen von 50 mg/mL 4 µL Stammlösung mit 36 µL PBS. Die Mischung 120 µL des gelösten, Thiolated HA aus Schritt 2.1 hinzufügen. Hinweis: Lösungen von HMW HA sind sehr dickflüssig. Daher empfehlen wir, mit weiten Öffnung Mikropipette Tipp um Lösungen zu übertragen. Pipette langsam Lösung festhalten an den Wänden der Mikropipette Tipp zu vermeiden und Messgenauigkeit zu verbessern.</li>
	<li>Legen Sie die sauberen, trockenen Formen (vorbereitet in Schritt 2.4) in jede Vertiefung eine Gewebe-Kultur behandelte 12-Well-Platte. Mit sauberen, stumpfen Ende einer PIPETTENSPITZE drücken Sie die Gel-Form und überprüfen Abdichtung zwischen Formen und unten der well-Platte. Hinweis: Überprüfen Sie die Dichtung wieder vorm Kapselung auslaufen zu verhindern.</li>
	<li>Durchgang kultivierte GBM-Zellen, distanzieren, Einzelzellen und bestimmen Zellkonzentration3wie oben beschrieben. Hinweis: Einige GBM-Linien können nicht auf einzelne Zellen getrennt werden. In diesem Fall können ganze Gliomaspheres gekapselt werden. Jedoch bereiten Sie dissoziierte Einzelzellen nach präzisen Zellzählung zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit. Das Protokoll für Gliomasphere passagierung variiert zwischen den verschiedenen Labors und viele von Ihnen sind wahrscheinlich kompatibel mit Hydrogel Kapselung.<ol>
<li>(Empfohlen) Zentrifuge Gliomaspheres 500 X g für 5 min. entfernen den überstand und 1 mL der Zelle Dissoziation Enzym in der Zelle Pellet. Dann 5 min, leichtes Klopfen die Röhre zu agitieren inkubieren.</li>
		<li>Die Zellen 4 mL komplette Kulturmedium (50 ng/mL EGF, 20 ng/mL FGF-2, 25 µg/mL Heparin, G21 Ergänzung und 1 % Penicillin/Streptomycin in DMEM/F12) hinzufügen.</li>
		<li>Wieder bei 500 X g für 5 min zentrifugieren und den überstand zu entfernen. Zu guter Letzt Aufschwemmen der Zelle Pellet in 1 mL des Mediums abgeschlossen und ein 70 µm Zelle Sieb suspendierte Zellen durchlaufen. (Empfohlene) waschen erholte sich das Sieb mit einer zusätzlichen 4 mL das komplette Medium, die Anzahl der Zellen zu maximieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Konzentration der Zellen in der Suspension mit Hilfe eines Hemocytometer zu schätzen. Die Zellsuspension in 2 Zentrifuge Röhren, wo jedes Röhrchen ~ 80.000 Zellen enthält aufgeteilt. 500 X g für 5 min zentrifugieren; im Allgemeinen werden 80.000 Zellen 2 80 µL Hydrogele ausmachen.</li>
	<li>Den Überstand entfernen und erneut ein Pellet in 80 µL PEG-MAL-RGD-Lösung und eine zweite Pellet in 80 µL PEG-MAL-CYS-Lösung (vorbereitet in Schritt 3.1).</li>
	<li>Mit einem 200 µL, weite Öffnung Mikropipette Tipp, 40 µL HA-Lösung (aus Schritt 3.3 oben) verzichten Sie in jeder Kautschukform Silikon (wie in Schritt 3.4 vorbereitet).</li>
	<li>Mit einem 200 µL, weite Öffnung Mikropipette Tipp, mischen Sie die 40 µL PEG-MAL-CYS oder PEG-MAL-RGD Zelle Lösung mit der HA-Lösung in der Form. Pipette rauf und runter schnell nicht mehr als 10 mal. Wiederholen Sie für jede Gel-Kultur vorbereitet. Hinweis: Dieser Schritt braucht Übung, da die anfängliche Gelierung erfolgt schnell (innerhalb von 30 s). Pipette auf und ab während der Bewegung der Spitze an verschiedenen Orten in Formen zu gewährleisten, selbst das Mischen. Halten Sie die Spitze unter Flüssigkeitsspiegel, Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Tun Sie nicht Mischung der Lösung Tipp zu oft als Gel innerhalb der Mikropipette gebildet werden kann. PEG-MAL-CYS und PEG-MAL-RGD kombinierbar in unterschiedlichen Verhältnissen, die gewünschte RGD-Peptid-Konzentration zu erreichen.</li>
	<li>Legen Sie die Well-Platte mit Gel-gekapselte Zellen in einem 37 ° C Zelle Kultur Inkubator für 5-10 Minuten zum Abschluss der Reaktion zu gewährleisten.</li>
	<li>2-2,5 mL Kulturmedium in jede Vertiefung mit gebildeten Gele hinzugeben. Verwenden Sie eine sterile, 2 µL PIPETTENSPITZE oder Mikro-Spatel, Schimmel und Gel sanft zu trennen. Verwenden Sie vorsterilisierten Zange, um die Form von well-Platte entfernen. Legen Sie die well-Platte zurück zur Zelle Inkubator (37 ° C und 5 % CO2) für Kultur und zukünftige Experimente. Hinweis: Ziehen Sie das Werkzeug senkrecht nach oben um zu vermeiden, die Gel-Kulturen zu schädigen. Medium in Gel Kulturen sollten in der Regel alle 3-4 Tage ersetzt werden. Achten Sie darauf, nicht Hydrogele Aspirieren beim Medium zu entfernen. Wenn dies ein Thema ist, empfiehlt es sich, mit einer Pipette aus Kunststoff übertragen. Wenn Biolumineszenz imaging zu Zellennummer verfolgen geplant ist, müssen GBM-Zellen mit Lentivirus Codierung konstitutiv Luciferase Ausdruck vor Kapselung, wie zuvor beschrieben3ausgestrahlt. Fügen Sie für die Biolumineszenz Bildgebung 1 mM D-Luciferin Kulturmedium 1 h vor der Lumineszenz Bildgebung hinzu.</li>
</ol>4. lysate Vorbereitung für das westliche Beflecken
<ol><li>Chill-1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis (1 pro Gel Proben). Cool Zentrifuge bis 4 ° C.</li>
	<li>Well-Platten entfernen Sie Medium. Übertragen Sie Gele in prechilled Mikrozentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Fügen Sie 100 µL RIPA Puffer mit 1 X Protease/Phosphatase-Inhibitoren.</li>
	<li>Verwenden eine 1 mL Spritze mit einer Nadel 20 G, brechen Sie das Gel durch drücken die ganze Mischung durch Nadel mindestens 20 Mal.</li>
	<li>Flash-Drehung der Probe mittels Bank Top Microcentrifuge und Ort die Probe wieder auf Eis.</li>
	<li>Vortex Proben kurz alle 5 min für eine Gesamtmenge von 20 Minuten.</li>
	<li>Zentrifuge Proben bei 14000 X g für 15 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Überstand auf neue, vorgekühlt Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und speichern bei-20 ° C (kurzfristig) oder und-80 ° C (langfristig). Durchführen Sie Gelelektrophorese mit Standardverfahren, wie zuvor beschrieben3.</li>
</ol>5. Extrahieren einzelne Zellen aus Hydrogel Kulturen für Durchflusszytometrie
<ol><li>Entfernen Sie Medium und Transfer Gel-Kultur (ab Schritt 3.11) zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Inkubieren Sie Gel mit 500 µL Zelle Dissoziation Enzym (z. B. TrypLE Express) bei 37 ° C für 5 min, gelegentlich flicking die Röhre zu agitieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Mischung in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen mit 5 mL der kompletten Medium. Platzieren Sie das Rohr auf dem Eis.</li>
	<li>Legen Sie eine 20G Nadel auf eine 10 mL Spritze. Ziehen Sie vorsichtig die Zellsuspension rauf und runter durch die Nadel 8 Mal.</li>
	<li>Fließen Sie die Mischung in eine neue 50 mL Zentrifugenröhrchen durch 70 µm Zelle Sieb. Wenden Sie eine zusätzliche 5 mL des kompletten Medium durch das Sieb alle verbleibenden Zellen zu sammeln.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Probe bei 400 X g, für 5 min. Überstands entfernen und Aufschwemmen das Pellet in gewünschten Puffer für Durchflusszytometrie (mit standard-Protokollen3).</li>
</ol>6. die Kryokonservierung von Hydrogele für Schneiden
<ol><li>Entfernen Sie Mittel aus Gel Kulturen (aus Schritt 3.11).</li>
	<li>Inkubieren Sie Gel Kulturen mit 2 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) bei 4 ° C über Nacht. Achtung: PFA ist giftig und muss sorgfältig behandelt werden.</li>
	<li>Am nächsten Tag entfernen Sie PFA. Fügen Sie 2 mL 5 % Saccharose in PBS, Gele und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>5 % Saccharose-Lösung mit 2 mL 20 % Saccharose in PBS zu ersetzen und 30 min inkubieren.</li>
	<li>Saccharoselösung mit 2 mL frische 20 % Saccharose in PBS zu ersetzen und eine zusätzliche 30 min inkubieren.</li>
	<li>Ein drittes Mal ersetzen Sie die Saccharoselösung mit 2 mL frische 20 % Saccharose in PBS. Über Nacht bei 4 ° C inkubieren.</li>
	<li>20 % Saccharose in optimale Arbeitstemperatur (OCT) Verbindung vorzubereiten. Hinweis: Aufgrund der Viskosität des OCT, Auflösung von Saccharose kann dauern einige Zeit (bis über Nacht). Wir empfehlen die Mischung auf einem Boston-Shaker während der Auflösung weiterhin Unruhe.</li>
	<li>Am nächsten Tag entfernen Sie die 20 % Saccharose-Lösung und vorsichtig Gießen Sie die 20 % Saccharose in OCT Lösung über das Gel. Achten Sie darauf, das gesamte Gel abdecken. Bei 4 ° C für 3 h inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie das Gel in der Mitte von einer Einbettung Schimmel mit einem großen, flachen Spatel; Dies muss sorgfältig durchgeführt werden, um Beschädigungen des Gels zu vermeiden.</li>
	<li>Coole 2-Methylbutane in eine Kammer mit einem Überschuss von Trockeneis herausnehmen.</li>
	<li>Füllen Sie den Einbettungs Schimmel mit reiner OCT (keine Saccharose). Knapp unterhalb der oberen Kante der Form zu füllen.</li>
	<li>Frieren Sie die Hydrogel-Probe durch Untertauchen in gekühlten 2-Methylbutane ein und dann gehen Sie zu schneiden.</li>
	<li>Abschnitt der Probe mit einem Kryostat; Schnittdicke von 10-18 µm und strukturierendes Temperatur von etwa-26 ° C werden empfohlen.</li>
	<li>Führen Sie standard Immunostaining Verfahren auf geschnittenen Gel Kultur, wie zuvor beschrieben3. Hinweis: PFA ist reizend und Karzinogen bekannt. Bitte behandeln und PFA gemäß den örtlich geltenden Normen und Vorschriften zu entsorgen.</li>
</ol>7. total RNA-Extraktion aus Proben in Hydrogel
Hinweis: Hier beschreiben wir ein Protokoll mit einem kommerziellen kit (siehe die Tabelle der Materialien), um Gesamt-RNS von Hydrogel kultivierten Zellen zu extrahieren. Die Puffer und alles Material stehen innerhalb des Kits verwendet.
<ol><li>Kulturmedium zu entfernen. Verwenden Sie ein P1000 transferpipette mit Wide-Bohrung Tipp um die Hydrogel-Kultur in 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch übertragen.</li>
	<li>Die Hydrogel-Kultur 350 µL Puffer RLT hinzufügen.</li>
	<li>Zerkleinern Sie mit Hilfe einer 20 G Nadel befestigt eine 1 mL Spritze, das Gel durch drücken die ganze Mischung durch Nadel mindestens 20 Mal.</li>
	<li>Übertragen Sie die ganze Mischung in einem Homogenisator Spalte platziert in einer 2 mL-Kollektion-Röhre. Bei 13.000 x g für 2 min zentrifugieren.</li>
	<li>Übertragen Sie den überstand in ein sauberes 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Achten Sie darauf, nicht zu stören den Gel-Niederschlag an der Unterseite.</li>
	<li>Mischen Sie die lysate Probe mit 350 µL 100 % Ethanol. Übertragen Sie die Probe auf einen Spin Spalte (aus dem Kit) Platz in einer 2 mL-Sammelrohr. Zentrifuge für 1 min bei 13.000 x g.</li>
	<li>Folgen Sie für die nachfolgenden Schritte für die RNA-Reinigung für PCR die allgemeinen Protokolls seitens der Hersteller. Hinweis: Sobald RNA gewonnen wird, können standard-Protokolle für die PCR verwendet werden.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Generierung von reproduzierbaren Daten mit diesem 3D Culture-System erfordert: 1) einheitliche Charge zu Charge Thiolation ha, (2) Praxis zu erreichen, effiziente Vermischung von Hydrogel-Vorstufen und Handhabung von Hydrogel Kulturen um Schäden zu vermeiden und (3) optimiert Aussaat Dichte für jede Zelllinie verwendet.
Wenn eine bestimmte Gewichtsanteil von HA in das Hydrogel gewünscht wird, bestimmt den Grad der Thiolation der HA die Crosslink-Dichte. Wir empfehlen eine konsistente Datenmeng...

Dreidimensionale (3D) Kultur-Systeme rekapitulieren Wechselwirkungen zwischen Zellen und ihrer umgebenden extrazellulären Matrix (ECM) in nativen Gewebe besser als ihre zweidimensionale (2D) Pendants1,2. Fortschritte in der Gewebetechnik haben anspruchsvolle, 3D Kultur-Plattformen, die kontrollierte Untersuchungen (1) wie chemische und physikalische Komponenten der Matrix Mikroumgebung beeinflussen Zelle Verhaltensweisen und (2) die Wirksamkeit der neue ermöglichen ergab therapeutische Strategien für eine Reihe von Krankheiten, einschließlich Krebs2. Während in-vitro- Modelle können nicht systemische Faktoren, wie z. B. Hormon- und Immunsystem Signale entfallen und können somit in Vivo Modellen nicht vollständig ersetzen, bieten sie einige Vorteile einschließlich der Reproduzierbarkeit, experimentelle Kontrolle, Erschwinglichkeit und Geschwindigkeit. Hier beschreiben wir die Verwendung von Gehirn-mimetischen Hydrogele in welchen, die 3D Kulturen des Patienten abgeleitet Gehirn Tumorzellen viele Aspekte der Tumor Physiologie, insbesondere die Dynamik des Erwerbs von Behandlung Resistance3erfassen. Im Vergleich zu anderen in-vitro- Methoden, repräsentieren diese Kulturen besser in Vivo Tumormodellen und klinischen Beobachtungen3.
Glioblastom (GBM) ist der häufigste und tödlichen Krebs mit Ursprung im Gehirn, mit eine mediane Überlebenszeit von nur 1-2 Jahre-4,-5. In den letzten Jahren haben viele Studien über den Einfluss der Tumor Matrix Umwelt im GBM6,7,8konzentriert. Das einmalige Gehirn ECM wurde berichtet, dass GBM Zellwanderung, Verbreitung und therapeutischen Widerstand6,7,8,9,10,11 beeinflussen , 12. Hyaluronsäure (HA) ist ein reichlich Glykosaminoglykan (GAG) im Gehirn, wo es interagiert mit anderen GAGs und Proteoglykane eine Hydrogel-wie zu bilden mesh-13. Viele Studien haben berichtet, HA-Überexpression in GBM Tumoren und seine Folgewirkungen auf Krebs Fortschreiten8,9,13,14,15,16 ,17. Anderen ECM-Komponenten wirken sich auch GBM Tumor Wachstum und Invasion6,7,15,18. Z. B. Fibronektin und Vitronectin, die in der Regel bei Glioblastom überexprimiert sind, Heterodimerization der Zell-Oberfläche Integrin-Rezeptoren durch Bindung an die "RGD" Sequenz zu induzieren und initiieren komplexe signaltechnische Kaskaden, die Förderung der Tumor überleben19 ,20,21. Neben biochemischen Einflüssen physikalische Eigenschaften der Gewebe Matrix wirken sich auch GBM Fortschreiten22,23.
Kontinuierliche Übernahme des Widerstands zu Therapien ist einer der Haupttreiber der GBM Letalität4. Medikamente mit vielversprechenden Ergebnissen in 2D- oder Gliomasphere Modelle haben versagt, in nachfolgenden tierexperimentellen Studien und klinische Fälle3, darauf hinweist, dass die Auswirkungen von microenvironmental Faktoren wesentlich zur GBM Tumor Antwort1beigetragen. Während Tiermodelle eine 3D bereitstellen können, physiologisch angemessen Sie Mikroumgebung, xenografted patientenzellen und generieren klinisch relevante Ergebnisse24,25, die Komplexität des Gehirns Mikroumgebung in Vivo zu macht es schwierig um zu bestimmen, welche Features, einschließlich der Zelle-Matrix Interaktionen, Schlüssel zu bestimmten biologischen Ergebnisse sind. Identifizierung von neuen therapeutischen Ziele profitieren von der Verwendung von vereinfachten Kultur Plattformen in der biochemische und biophysikalische Eigenschaften definiert sind.
Im Gegensatz zu bereits gemeldeten Biomaterial-Modellen der GBM Tumor Mikroumgebung26,27 die wahre orthogonal Kontrolle über individuellen biochemischen und physikalischen Eigenschaften der ECM, die Biomaterial-Plattform noch nicht erreicht haben berichtet hier ermöglicht die Entkopplung der Beiträge von mehreren unabhängigen Funktionen, GBM Zelle Phänotyp. Hier präsentieren wir Ihnen ein HA-basierten, Orthogonal abstimmbaren Hydrogel-System für 3D Culture von GBM-Zellen Patienten abgeleitet. Hydrogele sind aus zwei Polymerkomponenten gebildet: 1) biologisch aktive HA und 2) biologisch inert Polyethylenglykol (PEG). PEG ist ein weit verbreitetes biokompatibel und hydrophilen Material mit niedrigem Eiweißgehalt Adsorption und minimalen Immunogenität28. Hier sind etwa 5 % der glucuron-Säure Moieties auf HA-Ketten mit Thiol-Gruppen ermöglichen Vernetzung zu einer handelsüblichen 4-Arm-Koppelung mit Maleimides über Michael-Type-Zusatz beendet funktionalisiert. In seiner häufigsten Form im Körper existiert HA in hohem Molekulargewicht (HMW) Ketten. Hier hilft ein geringer Grad der Modifizierung der HMW HA (500-750 kDa), um native Interaktionen von HA und die Zell-Rezeptoren, einschließlich CD4429zu bewahren. Mit der Substitution von PEG-Thiol für HA-Thiol unter Beibehaltung einer Konstanten Molverhältnis von insgesamt Thiole, Maleimides, kann HA-Konzentration von mechanischen Eigenschaften des resultierenden Hydrogele entkoppelt werden. Darüber hinaus können stöchiometrischen Steuerelemente zu Cystein-terminierte Peptide auf eine definierte durchschnittliche Maleimide-terminierte Arme auf jeder 4-Arm-PEG-Konjugat verwendet werden. Einbeziehung der ECM-abgeleitet, selbstklebende Peptide kann Interaktionen mit Integrine auf kultivierten Zellen, durch die biochemische und chemische Signale ausgestrahlt1sind. Maleimide-Thiol-Zusatz erfolgt sehr schnell unter physiologischen Bedingungen, minimieren den Zeitaufwand für Zelle Kapselung und Maximierung Überleben der Patienten gewonnenen Zellen. Darüber hinaus Hydrogel Kulturen wie typische Gewebeprobe behandelt werden können und sind kompatibel mit standard Charakterisierung Techniken einschließlich Western blotting, Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz-Färbung. Das folgende Protokoll beschreibt die Verfahren zur Herstellung von Hydrogele, 3D Kulturen von GBM-Zellen Patienten abgeleitet und Techniken für die biochemische Analyse zu etablieren.

<table><tbody><tr><td>pH-Messgerät</td><td>Thermo Fisher</td><td>N/A</td><td>Jedes pH-Messgerät mit einer Empfindlichkeit von pH 2-10</td></tr><tr><td>Rührplatte</td><td>Thermo Fisher</td><td>N/A</td><td>Allgemeine Laborausrüstung</td></tr><tr><td>Erlenmeyerkolben (125 ml)</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB-501-125</td><td></td></tr><tr><td>Dialysekanülen</td><td>Thermo Fisher</td><td>21-152-14</td><td></td></tr><tr><td>2L Polypropylen-Becherglas</td><td>Thermo Fisher</td><td>S01916</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhyaluronan</td><td>Lifecore</td><td>HA700k-5</td><td>500-750 kDa Bereich</td></tr><tr><td>1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC)</td><td>Thermo Fisher</td><td>PI-22980</td><td></td></tr><tr><td>N-Hydroxysuccinimid (NHS)</td><td>sigma aldrich</td><td>130672-5G</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure (HCl)</td><td>Thermo Fisher</td><td>SA48-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)</td><td>Thermo Fisher</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>Cytamindihydrochlorid</td><td>Thermo Fisher</td><td>AC111770250</td><td></td></tr><tr><td>Dithiolthreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP172-25</td><td></td></tr><tr><td>Ellman's Testreagenz (5-(3-Carboxy-4-nitrophenyl)disulfanyl-2-nitrobenzoesäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D218200-1G</td><td></td></tr><tr><td>Deuteriertes Wasser (Deuteriumoxid)</td><td>Thermo Fisher</td><td>AC166301000</td><td></td></tr><tr><td>0.22&Mikro; m vakuumbetriebener Filter</td><td>CellTreat</td><td>229706</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>P32080-100T</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' ausgewogene Salzsalzlösung (HBSS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>MT-21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>4-armiges PEG-Maleimid</td><td>JenKem Technology</td><td>A7029-1</td><td>Molekulargewicht ca. 20kDa</td></tr><tr><td>4-armiges PEG-Thiol</td><td>JenKem Technology</td><td>A7039-1</td><td>Molekulargewicht ca. 20kDa</td></tr><tr><td>L-Cystein&nbsp;</td><td>sigma aldrich</td><td>C7880-100G</td><td></td></tr><tr><td>RGD ECM mimetisches Peptid</td><td>Genscript Biotech</td><td>N/A</td><td>Kundenspezifisches Peptid mit der Sequenz "GCGYGRGDSPG", N-terminal sollte acetyliert</td></tr><tr><td>werden Silikonformen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>GBL664201-25EA</td><td>Verwenden Sie die Rasierklinge, um das komplette Kulturmedium in einzelne Stücke zu schneiden</td></tr><tr><td></td><td>Verschiedenes Verschiedenes</td><td></td><td>DMEM/F12 (Thermofisher) mit Nicht-Serum-Supplement (G21 von GeminiBio), epidermalem Wachstumsfaktor 50 ng/ml (Peprotech), Fibroblasten-Wachstumsfaktor 20 ng/ml (Pepro Tech) und Heprain 25&micro; g/mL (Sigma Aldrich), Kulturmedium variiert je nach Labor Patient</td></tr><tr><td>Derived GBM</td><td>cell N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>20G Nadel</td><td>BD medical</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>1mL Spritze</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>10mL Spritze</td><td>BD medical</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>PI-89901</td><td></td></tr><tr><td>Protease/ Phosphatase-Hemmer Mini-Tablette</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5892970001</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Schüttler</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-814-5Q</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Thermo</td><td>Fisher 12604013</td><td></td></tr><tr><td>70&micro; m Zellsieb</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Thermo Fisher</td><td>AC416785000</td><td>4% (w/v) in PBS auflösen, pH 7,4</td></tr><tr><td>halten D-Saccharose</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur (O.C.T.)</td><td>Thermo Fisher</td><td>NC9373881</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur-Inkubator</td><td>Thermo Fisher</td><td>N/A</td><td>Beliebig allgemein mit 5 % CO2 und 37 °C</td></tr><tr><td>Kühl-/Gefrierschrank</td><td>Thermo Fisher</td><td>N/A</td><td>Alle allgemeinen Laborgeräte mit einer Kapazität von -20 °C und -80 °C</td></tr><tr><td>Einweg-Einbettformen</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-20</td><td></td></tr><tr><td>Lyapholizer</td><td>Labconco</td><td>N/A</td><td>Alle -105 °C Gefriertrockner</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Braunes Fläschchen</td><td>Kimble Chase</td><td>60912D-2</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen mit breiter Öffnung</td><td>Thermo Fisher</td><td>9405120</td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutan</td><td>Thermo Fisher</td><td>03551-4</td><td></td></tr><tr><td>Trockeneis</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

hyaluronsäure basierte hydrogele für 3-dimensionale kultur des patienten abgeleitet glioblastom-zellen

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastom (GBM) ist die häufigste, aber tödlichsten, Zentralnervensystem Krebs. In den letzten Jahren haben viele Studien fokussiert wie die extrazelluläre Matrix (ECM) der einzigartigen Gehirn Umwelt, wie Hyaluronsäure (HA), GBM fortschreiten und Invasion erleichtert. Jedoch enthalten die meisten in-vitro- Kultur Modelle GBM-Zellen außerhalb des Kontexts von ECM. Murine Xenotransplantate von GBM-Zellen werden häufig auch verwendet. In Vivo Modellen erschweren jedoch die Beiträge der einzelnen Merkmale des komplexen Tumor Mikroumgebung Tumor Verhalten zu isolieren. Hier beschreiben wir eine HA Hydrogel-basierte, dreidimensionale (3D) Kultur-Plattform, die Forscher zu HA-Konzentration und Steifigkeit unabhängig voneinander verändern können. Hohes Molekulargewicht HA und Polyethylenglykol (PEG) umfassen Hydrogele, die vernetzt über Michael-Type-Zusatz im Beisein von lebenden Zellen sind. 3D Hydrogel Kulturen des Patienten abgeleitet GBM Zellen Ausstellung Lebensfähigkeit und Verbreitung Preise so gut wie oder besser als, wenn kultiviert als standard Gliomaspheres. Die Hydrogel-System ermöglicht auch eine Einbindung von ECM-mimetischen Peptiden, Auswirkungen von bestimmten Zelle-ECM-Interaktionen zu isolieren. Hydrogele sind optisch transparent, so dass lebende Zellen in 3D Culture abgebildet werden können. Zu guter Letzt sind HA Hydrogel Kulturen kompatibel mit Standardtechniken für Molekulare und zelluläre Analysen, einschließlich PCR, Western blotting und Kryoschneiden gefolgt von Immunfluoreszenz-Färbung.

Für jede Charge von Thiolated HA sollte der Grad der Thiolation mit1H -NMR oder eine Ellman Test überprüft werden. HA, Modifikation, die mit dem hier beschriebenen konsequent Verfahren erzeugt ~ 5 % Thiolation (definiert als das molare Verhältnis von Thiole, HA Disaccharide) (Abbildung 1).
Einrichtung dieser neuen Kultur-Plattform erfordert jedes Labor, strengen Tests um ...

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für dreidimensionale Kultur des Patienten abgeleitet Glioblastom-Zellen innerhalb orthogonal abstimmbaren Biomaterialien entwickelt, um das Gehirn-Matrix zu imitieren. Dieser Ansatz bietet eine in Vitro, experimentelle Plattform, die viele Eigenschaften von in Vivo Glioblastom-Zellen in der Regel in Kultur verloren beibehält.

Hyaluronsäure basierte Hydrogele für 3-dimensionale Kultur des Patienten abgeleitet Glioblastom-Zellen

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zu Glioblastom-Tumoren zu beantworten und zu klären, wie die extrazelluläre Matrix die Therapieresistenz erleichtern kann. Diese Technik ermöglicht den modularen Aufbau anpassungsfähiger 3D-Zellkulturplattformen, die zur Kultivierung von Glioblastomzellen von Patienten in einer Umgebung verwendet werden können, die dem nativen Gehirn besser entspricht. Setzen Sie zunächst saubere, trockene Silikonkautschukformen in jede Vertiefung einer nicht mit Gewebekultur behandelten 12-Well-Platte ein und kleben Sie die Formen mit dem sauberen, stumpfen Ende einer Pipettenspitze an den Boden der Platte.Nachdem Sie die Dichtung zwischen den Formen und den Vertiefungsböden überprüft haben, sammeln Sie die dissoziierten Gliomsphären aus einer Glioblastom-Zellkultur durch Zentrifugation und suspendieren Sie das Pellet wieder in einem Milliliter Zelldissoziationsenzym. Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur wird das Röhrchen durch sanftes Klopfen gerührt und die enzymatische Reaktion mit vier Millilitern des vollständigen Mediums gestoppt. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut und suspendieren Sie das Pellet erneut in einem Milliliter frischem Medium, bevor S

hyaluronic-acid-based-hydrogels-for-3-dimensional-culture-patient

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Etablierung einer dreidimensionalen Kultur von Gliazellen. Gliazellen aus dem Rattengehirn sind in einer photovernetzbaren Polymermatrix eingekapselt, die extrazelluläre Matrixkomponenten enthält. Nach der Inkubation in einem Wachstumsmedium vermehren sich die Gliazellen innerhalb der Stützmatrix, um eine dreidimensionale Kultur zu bilden.

Etablierung einer dreidimensionalen Kultur von Gliazellen aus dem Rattengehirn

Dieses Video zeigt, wie Gliomsphären, die aus Hirntumoren stammen, in einzelne Zellen getrennt und in ein Hyaluronsäure-basiertes Hydrogel eingekapselt werden. Dieser Prozess fördert Zell-Zell-Interaktionen und bildet ein strukturiertes, dreidimensionales Glioblastom-Modell.

Ein Hydrogel auf Hyaluronsäurebasis für die 3-dimensionale Kultur von Glioblastomzellen

Von Patienten stammende Xenotransplantate von Glioblastoma multiforme können mit Hilfe eines humanen 3D-Biogel-Kultursystems in lebende Mikrotumoren miniaturisiert werden. Dieser in vivo-ähnliche 3D-Tumorassay eignet sich für Drug-Response-Tests und molekulares Profiling, einschließlich kinomischer Analysen.

Die Erzeugung von Microtumors Mit 3D Human Biogel Kultursystem und Patienten stammGlioblastomZellen für Kinomic Profilieren and Drug Response-Testing

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die 3D Kultur der Ratte Gehirn abgeleitet Glia-Zellen, einschließlich der Oligodendrozyten, Astrozyten und Mikroglia. Wir zeigen Primärzelle Kultur, methacrylated Hyaluronsäure (HAMA) Hydrogel Synthese, HAMAphoto-Polymerisation und Zelle Kapselung und Probe Verarbeitung für die konfokale und scanning Electron mikroskopische Bildgebung.

3D Hydrogel Kulturen von primären Gliazellen für In-vitro- Modellierung von Neuroinflammation verbessert

Hier beschreiben wir einen einfach zu bedienenden Invasionstest für Glioblastom. Dieser Test eignet sich für glioblastom-Stammzellen. Ein Fidschi-Makro zur einfachen Quantifizierung von Invasion, Migration und Proliferation wird ebenfalls beschrieben.

Ein 3D Spheroid Modell für Glioblastom

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine experimentelle Plattform zur Bewertung der Auswirkungen mechanischer und biochemischer Hinweise auf chemotherapeutische Reaktionen von patientenabgeleiteten Glioblastomzellen in 3D-matrixmimetischen Kulturen unter Verwendung eines maßgeschneiderten UV-Beleuchtungsgeräts, das die Hochdurchsatz-Photovernetzung von Hydrogelen mit abstimmbaren mechanischen Eigenschaften ermöglicht.

Hydrogel-Arrays ermöglichen erhöhten Durchsatz für Screening-Effekte von Matrixkomponenten und Therapeutika in 3D-Tumormodellen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das eine schnelle, robuste und kostengünstige Herstellung von Tumorsphäroiden mit anschließender Hydrogelverkapselung ermöglicht. Es ist weit verbreitet, da es keine spezielle Ausrüstung erfordert. Es wäre besonders nützlich für die Erforschung von Sphäroid-Matrix-Wechselwirkungen und die Erstellung von In-vitro-Gewebephysiologie - oder Pathologiemodellen.

Herstellung und Verkapselung von Tumorsphäroiden in Polyethylenglykol-Hydrogelen zur Untersuchung von Sphäroid-Matrix-Wechselwirkungen

Wir stellen eine Methode zur Replikation der Mikroumgebung des Gliomtumors an der invasiven Front vor, die den interstitiellen Flüssigkeitsfluss einbezieht. Bei diesem Modell handelt es sich um ein Hyaluronan-Kollagen-I-Hydrogel in einem Gewebekultureinsatz, auf den ein Flüssigkeitsdruckkopf aufgebracht werden kann. Die Invasion kann quantifiziert werden, und Zellen können isoliert oder lysiert werden.

Ein photopolymerisierbares Hyaluronsäure-Kollagen-Modell der invasiven Gliom-Mikroumgebung mit interstitieller Strömung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Verwendung von Hydrogel als dreidimensionales (3D) Zellkulturgerüst für die ADSC-Kultur (Adipose-Derived Stem Cells) demonstriert und Photobiomodulation (PBM) einführt, um die Proliferation von ADSCs innerhalb der 3D-Kulturumgebung zu verbessern.

Dreidimensionale Zellkultur von aus Fett gewonnenen Stammzellen in einem Hydrogel mit Photobiomodulationsaugmentation

Wir präsentieren ein 3D-Glioblastom-Migrationsmodell unter Verwendung von von Patienten abgeleiteten magnetischen Gliomsphären, die aus neu diagnostizierten und wiederkehrenden Tumoren erzeugt wurden. Diese Plattform ermöglicht die Visualisierung patientenspezifischer Migrationsdynamiken und die Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit. Der Test kann nach der Migration multiplexiert werden, um die Proteinlokalisierung und Expressionsmuster zu bewerten.

Reproduzierbarer 3D-Glioblastom-Migrationstest mit magnetischer Nanopartikel-vermittelter sphäroider Lokalisierung unter hypoxischen Bedingungen

Lernen Sie die 3D-Kultur patientenabgeleiteter Glioblastom-Zellen in hyaluronsäurebasierten Hydrogelen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Behandlungsresistenzmechanismen in einer nativen Gehirnumgebung.

Hyaluronsäure basierte Hydrogele für 3-dimensionale Kultur des Patienten abgeleitet Glioblastom-Zellen

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