Name: Methoden zur Bewertung der Rolle von c-Fos und Dusp1 in Abhängigkeit der Onkogen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Erfahren Sie genetische Validierungsmethoden für c-Fos und Dusp1 als therapeutische Ziele bei Leukämie. Diese Technik nutzt Onkogen-Abhängigkeit und ist auf verschiedene Tumortypen anwendbar.

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Die Autoren sind dankbar für G. Q. Daley für die Bereitstellung der BaF3 und WEHI-Zellen und T. Reya für MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP konstruiert. Die Autoren sind dankbar, M. Carroll für die Bereitstellung der Patientenproben aus der CML-Explosion-Krise. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse zu M.A von NCI (1RO1CA155091), die Leukämie Research Foundation und V-Stiftung und von der NHLBI (R21HL114074-01).

<ol><li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr%2Fabl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science. 247, 824-830 (1990).</li>
<li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).</li>
<li>Mahon, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discontinuation+of+imatinib+in+patients+with+chronic+myeloid+leukaemia+who+have+maintained+complete+molecular+remission+for+at+least+2+years%3A+the+prospective%2C+multicentre+Stop+Imatinib+%28STIM%29+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial.</a> Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).</li>
<li>O'Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pushing+the+limits+of+targeted+therapy+in+chronic+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia.</a> Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).</li>
<li>Rousselot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imatinib+mesylate+discontinuation+in+patients+with+chronic+myelogenous+leukemia+in+complete+molecular+remission+for+more+than+2+years%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years.</a> Blood. 109, 58-60 (2007).</li>
<li>Krause, D. S., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+kinases+as+targets+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tyrosine kinases as targets for cancer therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).</li>
<li>Sharma, S. V., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+balance+between+life+and+death%3A+targeted+cancer+therapy+and+%22oncogenic+shock%22%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and "oncogenic shock".</a> Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).</li>
<li>Sharma, S. V., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene+addiction%3A+setting+the+stage+for+molecularly+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy.</a> Genes & Development. 21, 3214-3231 (2007).</li>
<li>Weinstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer.+Addiction+to+oncogenes--the+Achilles+heal+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer. Addiction to oncogenes--the Achilles heal of cancer.</a> Science. 297, 63-64 (2002).</li>
<li>Corbin, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chronic+myeloid+leukemia+stem+cells+are+insensitive+to+imatinib+despite+inhibition+of+BCR-ABL+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).</li>
<li>Straussman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+micro-environment+elicits+innate+resistance+to+RAF+inhibitors+through+HGF+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion.</a> Nature. 487, 500-504 (2012).</li>
<li>Wilson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+potential+for+growth-factor-driven+resistance+to+anticancer+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors.</a> Nature. 487, 505-509 (2012).</li>
<li>Kesarwani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+c-FOS+and+DUSP1+abrogates+intrinsic+resistance+to+tyrosine-kinase+inhibitor+therapy+in+BCR-ABL-induced+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia.</a> Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-fos+regulates+neuronal+excitability+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">c-fos regulates neuronal excitability and survival.</a> Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).</li>
<li>Dorfman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+erp%2Fmkp-1+gene+does+not+affect+mouse+development%3A+normal+MAP+kinase+activity+in+ERP%2FMKP-1-deficient+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts.</a> Oncogene. 13, 925-931 (1996).</li>
<li>Padhye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorocurcumins+as+cyclooxygenase-2+inhibitor%3A+molecular+docking%2C+pharmacokinetics+and+tissue+distribution+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice.</a> Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).</li>
<li>Molina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeting+of+quiescent+chronic+myelogenous+leukemia+stem+cells+by+histone+deacetylase+inhibitors+in+combination+with+imatinib+mesylate%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate.</a> Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).</li>
<li>Koschmieder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+chronic+phase+of+myeloid+leukemia+with+expansion+of+hematopoietic+stem+cells+in+a+transgenic+model+of+BCR-ABL+leukemogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis.</a> Blood. 105, 324-334 (2005).</li>
<li>Abraham, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+targeting+of+p53+and+c-MYC+selectively+eliminates+leukaemic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells.</a> Nature. 534, 341-346 (2016).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+p53+by+SIRT1+inhibition+enhances+elimination+of+CML+leukemia+stem+cells+in+combination+with+imatinib%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib.</a> Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).</li>
<li>Qiagen-miRNAeasy kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources">https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources</a> (2018).</li>
<li>DNA-free DNA removal kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s</a> (2018).</li>
<li>SuperScript™ III First-Strand Synthesis System. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051</a> (2018).</li>
<li>Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html">https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html</a> (2018).</li>
<li>Abarrategi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+human+bone+marrow+niche+in+mice%3A+From+host+bone+marrow+engraftment+to+bioengineering+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modeling the human bone marrow niche in mice: From host bone marrow engraftment to bioengineering approaches.</a> Journal of Experimental Medicine. 215, 729-743 (2018).</li>
<li>Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+screening+and+validation+of+resistant+mutations+against+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Für den Großteil der Krebszellen ist die therapeutische Reaktion zu TKI durch eine Blockade der Tyrosin-Kinase-Oncoprotein Signale vermittelt, bei denen der Tumor süchtig ist. Jedoch ist relativ wenig bekannt über wie eine Minderheit von Krebszellen, die einen Beitrag zur MRD escape das Onkogen Abhängigkeit und Therapie4. Neuere Studien gezeigt, dass Wachstumsfaktor Signalisierung Resistenzen in Leukämie und solide Orgel Tumoren vermittelt. Dies deutet darauf hin, dass verschiedene molekulare Mech...

Konstitutive Tyrosin-Kinase-Aktivität von BCR-ABL1 Fusion Onkogen verursacht CML, sorgt für eine Begründung um die Kinase-Aktivität von niedermolekularer Hemmer ansprechen. Der Erfolg von TKIs bei der Behandlung von CML-Patienten revolutioniert das Konzept der gezielten Therapie1,2. Anschließend entwickelte Anti-Kinase-Therapie als Präzisionsmedizin für mehrere andere Malignome, einschließlich der solide Tumoren. Bisher sind mehr als dreißig Kinase-Inhibitoren von der United State FDA für die Behandlung von verschiedenen malignen Erkrankungen zugelassen. TKI-Behandlung ist, zwar sehr effektiv bei der Bekämpfung der Krankheitsbildes ist es nicht heilende. Außerdem besteht eine kleine Population von Krebszellen während der Behandlung: die MRD3,4,5. Selbst Patienten, die eine kompletten Remission zeigte bleiben MRD, die schließlich Ergebnisse in Rückfall, wenn nicht ständig unterdrückt. Daher ist die Beseitigung der MRD-Zellen benötigt, um eine dauerhafte oder heilende Reaktion zu erreichen. CML ist eine wertvolle Paradigma für das Konzept der Präzisionsmedizin, Mechanismen der Onkogenese, rationale Ziel gerichtete Therapie, Krankheitsverlauf und Resistenzen zu definieren. Aber auch heute noch die TKI-induzierte Zelltod bei Krebszellen zu fahren ist nicht vollständig geklärt, noch warum MRD Zellen (bestehend aus leukämischen Stammzellen [LSCs]) sind intrinsisch resistent gegen TKIs4,6. Dennoch ist das Phänomen der "Onkogen Abhängigkeit von" mutierten Kinase Oncoprotein TKI Wirksamkeit beteiligt wo die akuten Hemmung der gezielten Onkogen von TKIs einen onkogenen Schock verursacht, der zu einer massiven Proapoptotic Antwort oder Ruhe in Zelle führt Kontext-abhängigen Weise6,7,8,9. Es fehlen jedoch die mechanistische Onkogen Abhängigkeit zu untermauern. Jüngste Studien haben verwickelt, dass Onkogen Abhängigkeit hebt Wachstumsfaktor Signal- und folglich Resistenz zu TKI-Therapie10,11,12 verleiht. Daher durchgeführt, um einen Einblick in den Mechanismus der Onkogen Abhängigkeit, wir Vollständiggenom Expression profiling von BCR-ABL1 süchtig und nonaddicted Zellen (gewachsen mit Wachstumsfaktoren), die ergab, dass c-Fos und Dusp1 wichtige Mediatoren der sind Onkogen sucht13. Die genetische Löschung von c-Fos und Dusp1 ist synthetischen tödlich für BCR-ABL1 mit dem Ausdruck Zellen und die Mäuse im Experiment nicht Leukämie entwickeln. Darüber hinaus geheilt die Hemmung der c-Fos und DUSP1 von niedermolekularer Hemmer BCR-ABL1-induzierte CML bei Mäusen. Die Ergebnisse zeigen, dass Ausdruck Niveaus von c-Fos und Dusp1 in Krebszellen, die Apoptotic Schwellenwert definieren, so dass niedrigere Medikament Empfindlichkeit verleihen, während höhere Resistenz gegen Therapie13führen.
Um die Fahrt der Onkogen Abhängigkeit Gene zu identifizieren, haben wir mehrere Vollständiggenom Expressions-profiling Experimente im Beisein von Wachstumsfaktor und einem TKI (Imatinib) mit Maus und CML Patienten gewonnenen Zellen (K562) durchgeführt. Diese Daten wurden analysiert, parallel mit CML Patienten Datensätze CD34 gewonnenen+ Blutstammzellen vor und nach der Behandlung mit Imatinib. Diese Analyse ergab drei Gene (ein Transkriptionsfaktor [c-Fos], duale Spezifität Phosphatase 1 [Dusp1], und ein RNA-bindende Protein [Zfp36]) sind häufig in TKI-resistenten Zellen hochreguliert. Um die Bedeutung dieser Gene in Übertragung Resistenzen zu validieren, werden Schritt für Schritt in Vitro und in Vivo -Analyse durchgeführt. Der Ausdruck Niveaus dieser Gene wurden durch Echtzeit-qPCR (RT-qPCR) und westliche Beflecken in resistenten Zellen bestätigt. Weitere, cDNA-Überexpression und Zuschlag von ShRNA Haarnadeln von c-Fos, Dusp1, und Zfp36 ergab, dass erhöhte c-Fos und Dusp1 Ausdrücke sind ausreichende und notwendige zu TKI-Resistenz verleihen. Daher führten wir eine in-vivo Validierung mithilfe von Mausmodellen mit c-Fos und Dusp1 nur. Für die genetische Validierung von c-Fos und Dusp1 wir ROSACreERT-induzierbaren c-Fosfl/fl Mäuse (conditional Knockout)14 geschaffen und kreuzten sie mit Dusp1- / - (gerade Knockout)15 zu ROSACreERT2-c-Fosfl/fl Dusp1- / - Doppel-transgener Mäuse. Knochenmark stammenden c-Kit+ Zellen (von c-Fosfl/fl-, Dusp1- / -- und c-Fosfl/flDusp1- / -) auszudrücken BCR-ABL1 analysierten in Vitro in einer Kolonie-bildende Einheit (KBE) Assay und in waren Vivo durch Knochenmark-Transplantation bei letal bestrahlten Mäusen, die Anforderung von c-Fos und Dusp1 allein oder zu zweit in Leukämie Entwicklung zu testen. Ebenso die chemische Hemmungen von c-Fos von DFC (Difluorinated Curcumin)16 und Dusp1 von BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 getestet wurden in vitro und in vivo mit BCR-ABL1-mit dem Ausdruck, Knochen Knochenmark stammenden c-Kit+ Zellen von der Wildtyp (WT) Maus. Um die Anforderung des c-Fos und Dusp1 in leukämischen Stammzellen zu bestätigen, haben wir eine CML-Maus-Modell wo BCR-ABL1 speziell in seiner Stammzellen durch Doxycyclin (Tet-Transaktivator drückt unter murinen Stammzellen Leukämie (SCL) Gen 3' Enhancer induziert wurde verwendet Verordnung)18,19. Wir verwendeten Knochenmark Lin–Sca+c-Kit+ (LSK) Zellen aus diesen Mäusen in einer in-vivo-Transplantation-Assay. Darüber hinaus wir Phopsho-p38 Ebenen und den Ausdruck von IL-6 als Pharmako-Dynamik Biomarker für Dusp1 und c-Fos Hemmung bzw. geschaffen, in Vivo. Zu guter Letzt, die Studie zur Relevanz für den Menschen, Patienten abgeleitet CD34 auszudehnen+ Zellen (entspricht der c-Kit+ -Zellen von Mäusen) wurden langfristige unterzogen in-vitro-Kultur-Einleitung Zelle Assays (LTCIC) und eine in-vivo humanisierten Mausmodell der CML20,21. Die immungeschwächte Mäuse wurden mit CML CD34 + Zellen, gefolgt von medikamentöse Behandlung und Analyse der menschlichen leukämischen Zellen überleben transplantiert.
In diesem Projekt entwickeln wir Methoden für Zielkennzeichnung und Validierungen mit genetischen und chemischen Werkzeugen mit verschiedenen präklinischen Modellen. Diese Methoden können erfolgreich angewendet werden, um andere Ziele entwickeln chemische Modalitäten für die therapeutische Entwicklung zu überprüfen.

<table><tbody><tr><td>Biological Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Cellgro (Corning)</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro (Corning)</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Cellgro (Corning)</td><td>15-016-CVR</td><td></td></tr><tr><td>RetroNectin Rekombinantes humanes Fibronektin-Fragment</td><td>Takara</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434 (Methylcellulose für CFU der Maus)</td><td>Stammzelle</td><td>3434</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose für menschliche KBE)</td><td>Stammzelle</td><td>4434</td><td></td></tr><tr><td>4-Hydroxytamoxifen</td><td>Sigma</td><td>H6278</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante Maus SCF</td><td>Prospec</td><td>CYT-275</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante Maus Flt3-Ligand</td><td>Prospec</td><td>CYT-340</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Maus IL-6</td><td>Prospec</td><td>CYT-350</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinante Maus IL-7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>DFC</td><td>LKT Laboratories Inc.</td><td>D3420</td><td></td></tr><tr><td>BCI</td><td>Chemzon Scientific</td><td>NZ-06-195</td><td></td></tr><tr><td>Imatinib</td><td>LC Labor</td><td>I-5508</td><td></td></tr><tr><td>Curcumin</td><td>Sigma</td><td>458-37-7</td><td></td></tr><tr><td>NDGA</td><td>Sigma</td><td>500-38-9</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Cellgro (Corning)</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta biologisch</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 1x</td><td>Cellgro (Corning)</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Cellgro (Corning)</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Cellgro (Corning)</td><td>25-005-CL</td><td>5 mg/ml Vorrat in Wasser</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco (Lebenstechnologien)</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Protaminsulfat</td><td>Sigma</td><td>P3369</td><td>5 mg/ml Stamm in Wasser</td></tr><tr><td>Trypanblau-Lösung (0,4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Cellgro (Corning)</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>WST-1</td><td>Roche</td><td>11644807001</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; M Acro Scheibenfilter</td><td>PALL</td><td>2016-10</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Nylon cell stariner</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>FICOL (Histopaque 1083) (Polysaccharose)</td><td>Simga</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>LS Säulen</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Proteaseinhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>CO-RO</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase Inhibitor Cocktail 2</td><td>Sigma</td><td>P5762</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocullulose-Membran</td><td>Bio-Rad</td><td>1620115</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrat (Chemiluminiscence-Substrat)</td><td>Thermo Scientific</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>CD5</td><td>eBioscience</td><td>13-0051-82</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>eBioscience</td><td>13-0112-75</td><td></td></tr><tr><td>CD45R (B220)</td><td>BD biosciences</td><td>553092</td><td></td></tr><tr><td>CD45.1-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0453-85</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0454-83</td><td></td></tr><tr><td>hCD45-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555482</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Biotin-FITC</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-857&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-7-4</td><td>eBioscience</td><td>MA5-16539</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)</td><td>eBioscience</td><td>13-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ter-119</td><td>eBioscience</td><td>13-5921-75</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>558612</tr><tr><td>CD117 Schützenpanzer</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>553356</tr><tr><td>BD Pharm Lyse</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555899</tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm (Fixier- und Permeabilisierungslösung)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>554714</tr><tr><td>BD Dauerwelle/Waschen&nbsp; (Permeabilisierungs- und Waschlösung für Phospho-Flow)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>554723</tr><tr><td>phospho p38</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4511S</td><td></td></tr><tr><td>gesamt p38</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>9212</td><td></td></tr><tr><td>Maus IgG-Steuerung</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>554121</tr><tr><td>Alexa Mehl 488 konjugiert&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Invitrogen</td><td>K278001</td><td></td></tr><tr><td>2x HBS</td><td>Invitrogen</td><td>K278002</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Ambion</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Blutkapillarröhrchen</td><td>Fisher</td><td>22-260-950</td><td></td></tr><tr><td>Blutentnahmeröhrchen</td><td>Giene Bio-One</td><td>450480</td><td></td></tr><tr><td>Neugeborenen-Kälberserum</td><td>Atlanta biologisch</td><td>S11295</td><td></td></tr><tr><td>Erythropoiein</td><td>Amgen</td><td>5513-267-10</td><td></td></tr><tr><td>Mensch SCF</td><td>Prospec</td><td>CYT-255</td><td></td></tr><tr><td>Mensch IL-3</td><td>Prospec</td><td>CYT-210</td><td></td></tr><tr><td>G-SCF</td><td>Prospec</td><td>CYT-220</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Prospec</td><td>CYT-221</td><td></td></tr><tr><td>MyeloCult (Medium für LTCIC-Assay)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5100</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison Natrium-Hemisuccinat</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7904</td><td></td></tr><tr><td>MEM alpha</td><td>Gibco</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>1/2 cc Lo-Dose u-100 Insulinspritze 28 G1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Mortor Stößel</td><td>Coor tek&nbsp;</td><td>60316 und 60317</td><td></td></tr><tr><td>Isoflorane (Isothesia TM)</td><td>Butler Schien</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>SOC</td><td>New England Biolabs</td><td>B90920s</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>100 mg/mL Stamm in Wasser</td></tr><tr><td>Bacto Agar (Agar)</td><td>Difco</td><td>214050</td><td></td></tr><tr><td>Hervorragende Brühe</td><td>Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Genemate</td><td>E-3119-500</td><td></td></tr><tr><td>Doxycyclin Chow</td><td>TestDiet.com</td><td>52662</td><td>modifiziert RMH1500, autoklavierbar 5LK8&nbsp; mit 0,0625% Doxycyclin&nbsp;</td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>Iodnitrotetrazoliumchlorid&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I10406</td><td></td></tr><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Blut- und Gewebekit</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green (Taq-Polymerase mit grünem Loadign-Farbstoff)</td><td>Promega</td><td>M1722</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit&nbsp; (RNA-Isolationskit)</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td></td></tr><tr><td>DNA Free Dnase Kit (DNAse-Behandlung für RT-PCR)</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM1906</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Erststrangsynthese (reverse Transkriptase für die cDNA-Synthese)</td><td>Invitrogen</td><td>18080051</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green (Taq-Polymerase-Mix mit grünem interchalierendem Farbstoff für qPCR)</td><td>Bio-Rad</td><td>1725270</td><td></td></tr><tr><td>CD117 MicroBead Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-224</td><td></td></tr><tr><td>Langzeitkultur-Initiierungs-Zellassay für Menschen</td><td>Stemp Cell Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NAPCO series 8000 WJ CO2 Inkubator</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ausschwingrotor cetrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-10 automatisierter Zellzähler</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C-1000 Thermocycler</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Real Plex 2</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Imaging System (Bildgebungssystem für Gele und Western Blots)</td><td>Bio-RAD</td><td>17001401</td><td></td></tr><tr><td>Hemavet (Boold-Zähler)</td><td>Drew-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II (FACS-Analysator)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fortessa I (FACS-Analysator)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaII (FACS-Sortierer)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetständer</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bestrahlung</td>&<td>nbsp;J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA</td><td>Mark I Modell 68A</td><td>Quelle Cs 137</td></tr><tr><td>Mäuse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ROSACreERT2</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scl-tTA&nbsp;</td><td>Dr. Claudia Hüttner" s Labor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BoyJ&nbsp;</td><td>Mauskernanlage am CCHMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6&nbsp;</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NSGS</td><td>Mauskernanlage am CCHMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1/-&nbsp;</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ROSACreERT2/c-Fosfl/fl</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BaF3</td><td>Geschenk von George Daley, Harvard Medical School, Boston</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WEHI</td><td>Geschenk von George Daley, Harvard Medical School, Boston</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CML-CD34+ und normale CD34+ Zellen</td><td>Universitätskrankenhaus, Universität von Cincinnati</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

methoden zur bewertung der rolle von c-fos und dusp1 in abhängigkeit der onkogen

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

Die Demonstration der Tyrosin-Kinase-Inhibitoren (TKIs) bei der Behandlung von chronisch-myeloischer Leukämie (CML) hat eine neue Ära in der Krebstherapie eingeläutet. Jedoch reagiert eine kleine Population von Zellen nicht auf TKI Behandlung, was zu minimaler Resterkrankung (MRD); auch die potenten TKIs scheitern, diese Zellen zu beseitigen. Diese MRD-Zellen dienen als Reservoir Resistenz gegen Therapie entwickeln. Warum TKI Behandlung gegen MRD Zellen unwirksam ist, ist nicht bekannt. Growth Factor Signalisierung unterstützt das Überleben der MRD-Zellen während der TKI Behandlung verwickelt ist, aber ein mechanistisches Verständnis fehlt. Jüngste Studien gezeigt, dass erhöhte c-Fos und Dusp1 Ausdruck durch konvergente onkogenen und Wachstumsfaktor Signalisierung in MRD Zellen TKI-Resistenz zu vermitteln. Die genetische und chemische Hemmung der c-Fos und Dusp1 CML exquisit empfindlich auf TKIs macht und heilt CML in beide genetischen und humanisierte Mausmodelle. Wir identifizieren dieser Zielgene mit mehreren Microarrays von TKI-empfindlichen und -resistente Zellen. Hier bieten wir Methoden zur Target-Validierung mit in vitro und in vivo Mausmodellen. Diese Methoden können leicht auf jedes Ziel für genetische Validierung und therapeutische Entwicklung angewendet werden.

Onkogen sucht hat bei der therapeutischen Wirksamkeit von TKIs verwickelt. Allerdings sind die Mechanismen, die fahren der Onkogen Abhängigkeit nicht verstanden. Wir führten mehrere unvoreingenommene Genexpressionsanalysen um die genetische Komponente beteiligt orchestrieren die sucht zu identifizieren. Diese Analysen ergaben die Hochregulation von drei Genen, c-Fos, Dusp1 und Zfp36, in Krebszellen, die sind nicht abhängig von onkogenen Signalisierung für überleben und sind daher unempfin...

Hier beschreiben wir Protokolle für die genetischen und chemischen Validierung von c-Fos und Dusp1 als Medikament Ziel bei Leukämie mit in vitro und in vivo genetische und humanisierte Mausmodelle. Diese Methode kann auf jedes beliebige Ziel für genetische Validierung und therapeutische Entwicklung angewendet werden.

Methoden zur Bewertung der Rolle von c-Fos und Dusp1 in Abhängigkeit der Onkogen

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

Diese Methode kann helfen, schlüsselweisen Fragen in Krebstherapeutika-Bereichen zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung von Schlüsselgenen, die an der Onkogenabhängigkeit beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Onkogenabhängigkeit nutzt, die vielen Kinase-getriebenen Krebsarten gemeinsam ist, daher ist sie auf mehrere Tumortypen anwendbar. Obwohl diese Methode Einblick in Leukämie geben kann, Kann es auch auf andere Systeme angewendet werden, wie solide Tumoren wie Lungenkrebs, Hirntumoren, und Bauchspeicheldrüsentumoren.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund mangelnder Erfahrung in der Molekularbiologie und Zellphysiologie kämpfen. Zu Beginn ernten Sie die Beinknochen von einer eingeschläferten Maus. Reinigen Sie das Gewebe von den Knochen mit einem Skalpell.Dann legen Sie die Knochen in kalten PBS auf Eis und zerkleinern Sie die Knochen mit einem Stößel. Danach filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Schraubverschlussrohr mit einer 10-Milliliter-Pipette. Waschen Sie den Mörtel und Stößel mehrmals mit kalten PBS und fügen Sie die Zellsuspension auf die 50 Milliliter Rohr

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Research

Forschung

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Cancer Research

Krebsforschung

Dieses Video beschreibt das Protokoll für die genetische Validierung durch die Übertragung von Zielgenen mit Hilfe von Retroviren in Zelllinien mit chronischer myeloischer Leukämie. Die Retroviren fungieren als Vermittler, um genetisches Material durch den als Transduktion bezeichneten Prozess in die Leukämiezelle zu übertragen, der eine langfristige Expression des Zielgens ermöglicht. Diese Methode kann auf beliebige Zielzellen zur genetischen Validierung und therapeutischen Entwicklung...

Retrovirale vermittelte Transduktion: Eine Methode, um ein Zielgen in Krebszellen einzuführen

Dieses Protokoll zeigt , wie fluoreszierend markiert, genetisch definierten klonalen Tumoren im Auge von Drosophila melanogaster / antennal Imaginalscheiben (EAD) zu erzeugen. Es beschreibt, wie der EAD und Gehirn aus dem dritten Larvenstadium zu sezieren und wie sie zu verarbeiten, zu visualisieren und zu Veränderungen der Genexpression und Tumorinvasivität quantifizieren.

Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Die Identifizierung neuartiger Wirkstoffziele, die von präklinischen Tests zu Versuchen am Menschen übergehen, ist eine wissenschaftliche Priorität. Zu diesem Zweck beschreiben wir hier einen funktionellen genomischen Ansatz, um die Auswirkungen der Genverarmung auf Sphäroide von Krebszelllinien zu untersuchen, die menschliche Krebserkrankungen in vivo besser modellieren.

Functional Genomics Screening Verwendung zur Identifizierung möglicher neuer Wirkstoff-Targets in Cancer Cell Sphäroid-Kulturen

Eine CRISPR/SgRNA-Bibliothek wurde zur Vernehmung Protein-kodierenden Gene angewandt. Die Machbarkeit einer SgRNA Bibliothek um die Funktion einer CTCF Grenze in Genregulation zu entdecken bleibt jedoch unerforscht. Hier beschreiben wir eine HOX Loci spezifische SgRNA Bibliothek um die Funktion von CTCF Grenzen in HOX Loci zu erhellen.

HOX Loci Focused CRISPR/SgRNA Bibliothek Screening identifizieren kritische CTCF Grenzen

Intrinsisch ungeordnete Domänen sind wichtig für die Funktion des onkogenen Fusionstranskriptionsfaktors. Um diese Proteine therapeutisch anzugreifen, ist ein detaillierteres Verständnis der Regulationsmechanismen dieser Domänen erforderlich. Hier verwenden wir Transkriptomik, um wichtige strukturelle Merkmale der intrinsisch gestörten EWS-Domäne im Ewing-Sarkom abzubilden.

Kartierung der Struktur-Funktions-Beziehungen ungeordneter onkogener Transkriptionsfaktoren mittels Transkriptomanalyse

Diese Studie beschreibt ein Protokoll zur Untersuchung der Auswirkungen eines veränderten pH-Werts auf die Onkogenexpression mittels RNA-seq-Analyse einer duktalen Pankreaszelllinie.

Onkogen-Expressionsanalyse mit Veränderungen des pH-Werts in einer duktalen Pankreaszelllinie

Die Comet-Assay ist eine effiziente Methode um zu erkennen, dass DNA-Schäden einschließlich Einzel- und Doppelstrang-DNA bricht. Wir beschreiben basische und neutrale Comet Assays zur Messung der DNA-Schäden in den Krebszellen, die therapeutische Wirkung der Chemotherapie zu bewerten.

Bewertung von In-vitro- DNA-Schäden mit Comet-Assay

Hier präsentieren wir Ihnen eine zweidimensionale Gelelektrophorese (2DE) gekoppelt mit Massenspektrometrie (MS) zu trennen und menschlichen Hypophysen Adenom Gewebe Proteom, stellt eine gute und reproduzierbare 2DE Muster identifizieren. Viele Proteine werden in jedem 2DE Fleck beobachtet, bei der Analyse von komplexen Krebs Proteome mit dem Einsatz von hochempfindlichen MS.

Zweidimensionaler Gelelektrophorese gekoppelt mit Massenspektrometrie Methoden für eine Analyse der menschlichen Hypophyse Adenom Gewebe Proteom

Unser Ziel war es, eine praktische Protokoll zur Bewertung der mitochondrialen Dysfunktion mit Müdigkeit bei Krebspatienten zu entwickeln. Dieses innovative Protokoll ist für die klinische Anwendung mit nur standard Aderlass und grundlegende Laborverfahren optimiert.

Bewertung der Rolle der mitochondrialen Funktion in krebsbedingte Fatigue

Die Prozesse für die Blase Krebs Invasion darstellen Biomarker und therapeutische Entwicklungsmöglichkeiten. Hier präsentieren wir eine Blase Krebs Invasion Modell mit 3-d-Kultur der Tumor Sphäroide, Time-Lapse Bildgebung und konfokalen Mikroskopie. Diese Technik ist nützlich für die Definition der Merkmale des invasiven Verfahrens und für das screening von Therapeutika.

3-d-Zellkultursystem für die Invasion zu studieren und Bewertung Therapeutika bei Blasenkrebs

Erfahren Sie genetische Validierungsmethoden für c-Fos und Dusp1 als therapeutische Ziele bei Leukämie. Diese Technik nutzt Onkogen-Abhängigkeit und ist auf verschiedene Tumortypen anwendbar.

Methoden zur Bewertung der Rolle von c-Fos und Dusp1 in Abhängigkeit der Onkogen

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