Digitalen Polymerase-Kettenreaktion-Assay für die genetische Variation bei einem sporadischen familiäre adenomatöse Polyposis Patienten mit dem Chip-in-Rohr-Format

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Gentests zu beantworten, wie z. B. den Nachweis von Mosaik und Gentests auf der Grundlage von Flüssigbiopsien. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Hochdurchsatzdetektion von Allelfraktionen mit geringer Variante. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auch auf die Diagnose von Tumoren, da der Nachweis onkogener Mutationen mit hoher Sensitivität zur Präzisionsmedizin beitragen kann.

Beginnen Sie dieses Experiment, indem Sie 10 l DNA-Probenpuffer in die Röhrchen eines 8-Röhrchen-Streifens geben. Geben Sie dann 1 Mikroliter DNA-Leiter in das erste Röhrchen des 8-Röhrchen-Streifens und einen Mikroliter genomische DNA aus der Probe in jedes der verbleibenden Röhrchen. Verwenden Sie einen Mikrotiterplattenaufsatz, um den Inhalt des 8-Röhrchen-Streifens zu mischen, indem Sie ihn eine Minute lang vortexen.

Legen Sie den Streifen, die Pipettenspitzen und ein Gelgerät in ein Elektrophoresegerät. Drücken Sie die Starttaste, um den Lauf zu starten. Überprüfen Sie nach dem vollständigen Lauf das Elektropherogramm auf dem Display, um sicherzustellen, dass der im DNA-Probenpuffer enthaltene untere Marker auf dem Elektropherogramm korrekt zugeordnet ist.

Wenn nicht, weisen Sie den Marker manuell im Elektropherogramm-Modus der Software zu. Geben Sie dann im Regionsmodus der Software die Größenregion der genomischen DNA an, um die DNA-Konzentration automatisch zu berechnen. Fügen Sie zuvor entwickelte Primer, Sonden und genomische DNA zu einem neuen 8-Röhrchen-Streifen hinzu, um ein Gesamtvolumen von 15 l zu erreichen.

Legen Sie die Ladeplattform auf die in den frischen 8-Rohr-Streifen eingebauten Späne und legen Sie den Rohrstreifen dann in den Autoloader. Stellen Sie sicher, dass ein Kontakt zwischen den Spänen und der Ladefläche besteht. Platzieren Sie als Nächstes einen Ladeschieber in der Plattform und halten Sie den Schieber mit einem Stopper vom Lader fern

Pipettieren Sie 15 l der PCR-Mischung in der Nähe der Spitze des Schiebereglers und drücken Sie dann die Ladetaste, um den Lader eine Minute lang laufen zu lassen. Entfernen Sie den Rohrstreifen nach dem Lauf aus dem Lader und legen Sie ihn in den Dichtverstärker. Drücken Sie vorsichtig auf den Schiebedeckel und den Rand des oberen Deckels.

Lassen Sie den Dichtungsverstärker etwa zwei Minuten lang laufen. Wenn die Versiegelung unvollständig ist, was durch eine Flüssigkeitspfütze angezeigt wird, wiederholen Sie den Lauf für eine weitere Minute. Geben Sie 230 l Dichtflüssigkeit in die Rohre.

Legen Sie den Röhrchenstreifen in den Thermocycler und führen Sie die PCR wie im Protokoll beschrieben durch. Wenn es eine ungleichmäßige Verteilung der positiven Partitionen gibt, passen Sie die Temperatur oder die Dauer der PCR an. Um die Fluoreszenzintensität der PCR-Produkte zu detektieren und zu analysieren, legen Sie den Röhrchenstreifen auf die Detektionsvorrichtung und fügen Sie 6 ml destilliertes Wasser hinzu.

Entfernen Sie sichtbare Luftblasen mit einer Pipettenspitze. Laden Sie die Vorrichtung in den Detektor. Wählen Sie in der Detektionssoftware die Registerkarten Fluoreszenz, Experiment und dann Sample NTC aus und klicken Sie auf die Schaltfläche RUN, um den Lauf zu starten.

Bestätigen Sie nach dem vollständigen Lauf das Positionsdiagramm, das Histogramm und das 2D-Streudiagramm. Um das PCR-Produkt zu sammeln, entfernen Sie die Dichtungsflüssigkeit aus dem Röhrchen. Fügen Sie 100 l TE-Puffer hinzu und wirbeln Sie 30 Sekunden lang kräftig auf.

Zentrifugieren Sie die Röhrchen kurz in einer Tischzentrifuge und gehen Sie wie im Textprotokoll beschrieben vor, um die Entnahme des PCR-Produkts abzuschließen. Positionsdiagramme, die durch digitale PCR erstellt wurden, zeigen gelbe HEX-Fluoreszenz sowohl in Patienten- als auch in Vaterproben, was auf das Vorhandensein der APC-Allelvariante T hinweist, jedoch nicht in keiner Template-Kontrolle. Nur die genomische DNA der Patienten enthält die C-Variante, wie eine grüne Fluoreszenz von FAM zeigt.

Wie durch Streudiagramme weiter bestätigt, sind sowohl der Patient als auch der Vater positiv für HEX oder Variante T, während nur der Patient das Vorhandensein der Variante C zeigt.Die vom DPCR berechnete variante Allelfraktion des Patienten (VAF) betrug 13,2 %, ähnlich wie 12,7 %, die durch Next Generation Sequencing erreicht wurde. Auf der anderen Seite betrugen die VAFs der Eltern und gesunden Spender der Patienten weniger als 0,1 %. Die Elektropherese von gesammelten und konzentrierten DPCR-Produkten bestätigt, dass die Größe des vorhergesagten Fragments in der DNA von Patienten und Eltern 123 Basenpaare beträgt. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Bank sauber zu halten, z. B. durch die Verwendung einer Lüfterfiltereinheit.