Name: Eine Net Schimmel basierende Methode der dreidimensionalen Gerüst-freie Herzgewebe Schöpfung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Erfahren Sie eine formbasierte Methode zur Herstellung dreidimensionaler, gerüstfreier Herzgewebe unter Verwendung von Sphäroiden. Diese Technik ermöglicht die Entwicklung funktioneller Gewebe mit synchroner Kontraktion für die kardiale Geweberegeneration.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren erkennen die folgende Finanzierungsquelle: Magie, dass Angelegenheiten Fonds für Herz-Kreislauf-Forschung.

1. Vorbereitung von Kardiomyozyten
<ol><li>6-Well-Platten mit Basalmembran Matrix und Kultur Mensch-induzierte pluripotente Stammzellen (HiPSCs) wie zuvor beschrieben17zu beschichten.</li>
	<li>HiPSCs in HiPSC-CMs mit der zuvor beschriebenen Methoden18zu unterscheiden.</li>
	<li>16-18 d Post-Differenzierung aussetzen der Herzmuskelzellen durch Spülen jedes gut mit 2 mL 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Kalzium und Magnesium, gefolgt von Inkubation mit 1 mL/auch von Trypsin oder Zelle Dissoziation Reagenz (siehe Tabelle des Materialien) für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Das Trypsin oder Zelle Dissoziation Reagenz zu neutralisieren (siehe Tabelle der Materialien) über ein gleiches Volumen von Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Zelle Medien mit B-27 (RPMI/B-27 Zelle Medien) ergänzt. Pipette rauf und runter um alle eingehalten Zellen zu lockern.</li>
	<li>Sammeln Sie die abgehängten Herzzellen mit einer serologischen 10-mL-Pipette und übertragen Sie sie auf eine 50 mL konische Rohr.</li>
	<li>Zentrifugieren der Zellsuspension bei 250 X g für 5 min bei Raumtemperatur einen Zelle Pellet zu erhalten.</li>
	<li>Das Pellet in 10 mL RPMI/B-27 Zelle Medien aufzuwirbeln.</li>
	<li>Kombinieren Sie 20 µL Zellsuspension mit einer gleichen Menge von 0,4 % Trypan blau Lösung und mischen Sie vorsichtig.</li>
	<li>Verwenden Sie eine manuelle Hemocytometer zu zählen und erhalten die Konzentration und Zelle Tragfähigkeit der Zellsuspension.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Fibroblasten
<ol><li>Initiieren einer Kultur einer menschlichen kardialen Fibroblasten (HCF) (Erwachsene ventrikuläre Typ)-Zelllinie wie zuvor16beschrieben.</li>
	<li>Aussetzen der TREIBGASEN durch Inkubation mit einer entsprechenden Menge an Trypsin oder Zelle Dissoziation Reagenz (siehe Tabelle der Materialien) für 5 min bei Raumtemperatur16. Für ein T175 Fläschchen wurde 10 mL Trypsin oder Zelle Dissoziation-Reagenz verwendet.</li>
	<li>Das Trypsin oder Zelle Dissoziation Reagenz zu neutralisieren (siehe Tabelle der Materialien) ein gleiches Volumen des Mediums mit, dann übertragen Sie die Probe auf eine 50 mL konische Rohr und Zentrifugieren die Zellsuspension bei 250 X g für 5 min bei Raumtemperatur zu erhalten eine Pellet.</li>
	<li>Das Pellet in 10 mL von Fibroblasten Wachstumsmedium Aufschwemmen (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>20 µL der HCF Zellsuspension mit einer gleichen Menge von 0,4 % Trypan blau Lösung kombinieren und vorsichtig mischen.</li>
	<li>Verwenden Sie eine automatisierte Zelle Zähler oder manuelle Hemocytometer zu zählen und erhalten die Konzentration und Zelle Tragfähigkeit des neuen Zellsuspension.</li>
</ol>3. Vorbereitung der Endothelzellen
<ol><li>Initiieren Sie eine Kultur der menschlichen nabelader Endothelzellen (HUVECS) Zeile wie oben beschrieben17. Aussetzen der Mediumwechsel durch Inkubation mit einer entsprechenden Menge an Trypsin oder Zelle Dissoziation Reagenz (siehe Tabelle der Materialien) für 3 min bei Zimmertemperatur17. Das Trypsin oder Zelle Dissoziation Reagenz zu neutralisieren (siehe Tabelle der Materialien) ein gleiches Volumen des Mediums verwenden, übertragen Sie dann auf eine 50 mL konische Rohr und Zentrifugieren die Zellsuspension bei 250 X g für 5 min bei Raumtemperatur ein Pellet zu erhalten. Hinweis: Für eine Flasche T175 war 10 mL Trypsin oder Zelle Dissoziation Reagenz verwendet.</li>
	<li>Das Pellet in 10 mL von Endothelzellen Wachstumsmedium Aufschwemmen (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Kombinieren Sie 20 µL der HUVECS Suspension zu und Färben Sie es mit einer gleichen Menge von 0,4 % Trypan blau Lösung und mischen Sie vorsichtig.</li>
	<li>Verwenden Sie eine automatisierte Zelle Zähler oder eine manuelle Hemocytometer zu zählen und erhalten die Konzentration und Zelle Tragfähigkeit der Zellsuspension.</li>
</ol>4. Schaffung von hängenden Tropfen Sphäroide
<ol><li>Legen Sie die hängenden Tropfen Gerät enthält 850 Mikroporen (jeweils mit einem Durchmesser von 350 µm) in sterilen 6-Well-Platten.</li>
	<li>Die drei Arten von Zellen zu isolieren, wie oben beschrieben: HiPSC-CMs und TREIBGASEN Mediumwechsel. Kombinieren sie in einem Verhältnis von 70 % iPSC-CMs, 15 % TREIBGASEN und 15 % Mediumwechsel in einem 50 mL konische Röhrchen mit RPMI/B-27 Zelle Medien in einer Konzentration von 2.475.000 Zellen pro mL.</li>
	<li>4 mL Zellsuspension (2.475.000 Zellen pro mL) in jede Vertiefung einer ultra-niedrigen Anlage hängen Drop-System (mit Zusammenarbeit von 350 µm Durchmesser) sitzt in einem 6-Well-Platte zu verzichten.</li>
	<li>Sphäroide bilden sich spontan innerhalb von 12 h der Verzicht auf der Zellsuspension in den hängenden Tropfen Gerät. Kultur für eine Gesamtmenge von 72 h (3 d) bei 37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit für die Reifung der Sphäroide weiter.</li>
	<li>Nach 72 h Kultur, Ernte der Sphäroide durch die Poren an der Unterseite der hängenden System indem das Gerät in eine Schale mit Medium und wirbelnden es sanft um die Sphäroide aus der hängenden freizugeben fallen Tropfen Gerät.</li>
</ol>5. 3-d-Patch-Erstellung unter Verwendung neuartige Net Form
<ol><li>Die Basis, quadratische Bodenplatte Bodennetz und 10 geschichteten Seite Netze montiert sind, um die neuartige Form mit Hilfe von ein paar sterilen Pinzette zu erstellen. Zuerst, stapeln Sie und richten Sie die Base, quadratische Bodenplatte, und unten Sie Netz mit den Eckpfosten. Dann Stapeln und Schicht 10 Seite Netze in wechselnden Richtungen um ein Netz von feinen Edelstahl-Zinken zu erstellen.</li>
	<li>Spülen Sie die Füllung mit PBS oder Medium zu reduzieren die Oberflächenspannung und übertragen Sie anschließend die zusammengebaute Form auf die Füllung-Basis.</li>
	<li>Befeuchten Sie die net Kavität mit PBS oder Medium in der gleichen Methode. Füllen Sie langsam die Sphäroide in vorausgesetzten Hohlraum der gewünschten Größe (2 x 2 x 1 mm, 4 x 4 x 1 mm oder 6 x 6 x 1 mm). Hinweis: Stellen Sie sicher, dass 120 % des erwarteten Volumens der Sphäroide in den Hohlraum zugeführt wird, so dass die Zelle Aggregate in engen Zusammenhang stehen und statisch bleiben.</li>
	<li>Montieren Sie die obere Netz und quadratische Deckplatte auf die Eckpfosten und sichern Sie den Stopper und Holding Röhren eine Auswaschung der Sphäroide zu verhindern.</li>
	<li>Übertragen Sie gefüllte net Schimmel-System auf eine 6-Well-Platte mit 6 mL RPMI/B-27 Zelle Medien oder in einen sterilen Behälter mit genügend Mittel zur Deckung der gesamten zusammengesetzten Form.</li>
	<li>7-10 Tage bei 3.000-4.000 X ginkubieren Sie 6-Well-Platte mit dem gefüllten Schimmel-System auf einen schwingenden Shaker. Hinweis: Die Dauer der Inkubation wird durch die Größe der kardialen Patches entschieden. Mit größeren Patches müssen die Inkubationszeit für kardiale Patch Reifung erhöht werden.</li>
</ol>6. Entfernen des Patches aus der neuartigen Net Form
<ol><li>Entfernen Sie das Schimmel-System aus den Medien und legen Sie es auf die sterilisierten Umgang mit Matte in eine sterile 10-cm-Schüssel.</li>
	<li>Entfernen Sie das halteröhrchen, Stopper, quadratische Deckplatte und im besten Netz. Schieben Sie vorsichtig mit einer sterilen Pinzette heraus die geschichteten Seite Netze eins nach dem anderen. Nach Decannulation wird ein intakter Herz Patch oben auf das Bodennetz erhalten.</li>
	<li>Das Bodennetz mit dem Patch mit sterilen Pinzette Abholung und transfer das Bodennetz in eine 35-mm-Schale mit 5 mL RPMI/B27 Medien. Lösen Sie vorsichtig den Patch von net unten durch das Netz langsam umschwenken, in der Schale oder mit einem sterilen Zelle Schaber. Nach der Loslösung von der Bodennetz kann das Herzgewebe mit RPMI/B27 Medien kultiviert werden.</li>
	<li>Weiter zu den frei schwebenden 3-d-kardiale Patch in der 35-mm-Schale zu inkubieren. Funktionale synchron schlagen kann bereits 24 Stunden nach der Entnahme aus der Form beobachtet werden.</li>
	<li>Nach dem Entfernen des Patchs aus dem net Werkzeug, zu beobachten, dass seine Form mit Integrität und der Intensität der synchron schlagen steigt mit der Zeit erhalten bleibt. Hinweis: Die 3-d-net Schimmel-basierte kardiale Patches ausgestellt elektrische Integration der Komponente Cardiospheres nach Decannulation. Wir beobachteten eine Tracht Prügel-Frequenz von 60 bis 80 Schlägen pro Minute, die länger als 60 Tage beibehalten.</li>
</ol>

<ol><li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Tissue+Engineering+With+Cells+Derived+From+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+a+Native-Like%2C+High-Resolution%2C+3-Dimensionally+Printed+Scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold.</a> Circulation Research. 120 (8), 1318-1325 (2017).</li>
<li>Borovjagin, A. V., Ogle, B. M., Berry, J. L., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Microscale+Devices+to+3D+Printing%3A+Advances+in+Fabrication+of+3D+Cardiovascular+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">From Microscale Devices to 3D Printing: Advances in Fabrication of 3D Cardiovascular Tissues.</a> Circulation Research. 120 (1), 150-165 (2017).</li>
<li>Tandon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+systems+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering.</a> Nature Protocols. 4 (2), 155-173 (2009).</li>
<li>Duran, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+Medicine%2FCardiac+Cell+Therapy%3A+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Regenerative Medicine/Cardiac Cell Therapy: Pluripotent Stem Cells.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66 (1), 53-62 (2018).</li>
<li>Lux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+maturation+of+large-scale+cardiac+patches+based+on+a+perfusable+starter+matrix+by+cyclic+mechanical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">In vitro maturation of large-scale cardiac patches based on a perfusable starter matrix by cyclic mechanical stimulation.</a> Acta Biomaterialia. 30, 177-187 (2016).</li>
<li>Eschenhagen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstitution+of+embryonic+cardiomyocytes+in+a+collagen+matrix%3A+a+new+heart+muscle+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstitution of embryonic cardiomyocytes in a collagen matrix: a new heart muscle model system.</a> The FASEB Journal. 11 (8), 683-694 (1997).</li>
<li>Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+the+Kenzan+Method+for+Robotic+Cell+Spheroid-Based+Three-Dimensional+Bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (3), 237-244 (2017).</li>
<li>Sugiura, T., Hibino, N., Breuer, C. K., Shinoka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+cardiac+patch+seeded+with+human+induced+pluripotent+stem+cell+derived+cardiomyocytes+promoted+the+regeneration+of+host+cardiomyocytes+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiothoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered cardiac patch seeded with human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes promoted the regeneration of host cardiomyocytes in a rat model.</a> Journal of Cardiothoracic Surgery. 11 (1), 163(2016).</li>
<li>Caspi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+vascularized+cardiac+muscle+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells.</a> Circulation Research. 100 (2), 263-272 (2007).</li>
<li>Ong, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterial-Free+Three-Dimensional+Bioprinting+of+Cardiac+Tissue+using+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Biomaterial-Free Three-Dimensional Bioprinting of Cardiac Tissue using Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4566(2017).</li>
<li>Kelm, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+concept+for+scaffold-free+vessel+tissue+engineering%3A+self-assembly+of+microtissue+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 46-55 (2010).</li>
<li>Noguchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+three-dimensional+pre-vascularized+scaffold-free+contractile+cardiac+patch+for+treating+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Heart+and+Lung+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (1), 137-145 (2016).</li>
<li>Zuppinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+culture+for+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">3D culture for cardiac cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (7 Pt B), 1873-1881 (2016).</li>
<li>Langenbach, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+differentiation+of+microtissues+from+multipotent+precursor+cells+for+use+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation and differentiation of microtissues from multipotent precursor cells for use in tissue engineering.</a> Nature Protocols. 6 (11), 1726-1735 (2011).</li>
<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Agocha, A., Sigel, A. V., Eghbali-Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+adult+human+heart+fibroblasts+in+culture%3A+a+comparative+study+of+growth%2C+proliferation+and+collagen+production+in+human+and+rabbit+cardiac+fibroblasts+and+their+response+to+transforming+growth+factor-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of adult human heart fibroblasts in culture: a comparative study of growth, proliferation and collagen production in human and rabbit cardiac fibroblasts and their response to transforming growth factor-beta1.</a> Cell Tissue Research. 288 (1), 87-93 (1997).</li>
<li>Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+isolation+and+culture+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells.</a> Nature Protocols. 2 (3), 481-485 (2007).</li>
<li>Pimentel, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+fabrication+of+thick+and+densely+populated+soft+constructs+with+complex+and+actively+perfused+channel+network%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional fabrication of thick and densely populated soft constructs with complex and actively perfused channel network.</a> Acta Biomaterialia. 65, 174-184 (2018).</li>
<li>Shimizu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysurgery+of+cell+sheet+grafts+overcomes+diffusion+limits+to+produce+thick%2C+vascularized+myocardial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Polysurgery of cell sheet grafts overcomes diffusion limits to produce thick, vascularized myocardial tissues.</a> The FASEB Journal. 20 (6), 708-710 (2006).</li>
<li>Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+three-dimensional+vascularized+cardiac+tissue+with+cell+sheet+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering.</a> Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).</li>
<li>Ong, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+Cardiac+Tissue+Exhibiting+Mechanical+Integration+of+Spheroids+Using+3D+Bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting.</a> Journal of Visualized Experiments. 125 (e55438), (2017).</li>
<li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+number+per+spheroid+and+electrical+conductivity+of+nanowires+influence+the+function+of+silicon+nanowired+human+cardiac+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Cell number per spheroid and electrical conductivity of nanowires influence the function of silicon nanowired human cardiac spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 51, 495-504 (2017).</li>
<li>Karra, R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+cardiac+growth+mechanisms+for+therapeutic+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Redirecting cardiac growth mechanisms for therapeutic regeneration.</a> Journal of Clinical Investigation. 127 (2), 427-436 (2017).</li>
<li>Bartholoma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+in+vitro+reaggregates+of+embryonic+cardiomyocytes%3A+a+potential+model+system+for+monitoring+effects+of+bioactive+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional in vitro reaggregates of embryonic cardiomyocytes: a potential model system for monitoring effects of bioactive agents.</a> Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 814-822 (2005).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Bedeutung dieser Methode liegt in ihrer Reproduzierbarkeit und die Wirksamkeit der daraus resultierenden vielschichtigen Herzgewebe. Im Bereich der kardialen Gewebetechnik ist eines der aktuellen Ziele zu identifizieren, eine Methode um schlagen, vielschichtig und funktionale 3-d-kardiale Patches zu konstruieren. Wir berichten über eine effiziente und reproduzierbare Methode vielschichtigen kardialen Gewebe durch manuelle Direktsaat der Sphäroide bestehend aus Herzzellen, Endothelzellen und Fibroblasten in eine neuar...

Das Ziel des aktuellen Herzgewebe Engineering ist, eine Therapie zu ersetzen oder zu reparieren, die Struktur und Funktion des verletzten Herzmuskelgewebe1zu entwickeln. Methoden zum Erstellen von 3-d-Herzgewebe Modelle präsentiert die wichtigeren kontraktilen und elektrophysiologischen Eigenschaften des nativen Herzgewebe haben2,3rasch ausgedehnt. Eine Vielzahl von Strategien haben erforscht und in Studien4,5verwendet worden. Diese Methoden reichen von den Einsatz von speziellen synthetischen und natürlichen bioaktiven Hydrogele, wie Gelatine, Kollagen, Fibrin und Peptide6, auf Bio-Tinte Ablagerung Technologien2 und Bioprinting Technologien7.
Es hat sich gezeigt, dass Gerüst-freie Methoden als Biomaterial-basierte Methoden, ohne die Nachteile der Einbeziehung ausländischer Gerüst Material8vergleichbare Gewebe produzieren können. Oren Caspi Et Al. zeigten, dass die Einbeziehung der verschiedenen Arten von Zellen die Generation stark vaskularisierte menschlichen entwickelt Herzgewebe9ermöglicht. Kinn Et Al. entwickelt eine 3-d-Druckverfahren für kardiale Patch Kreation aus Sphäroide. Daraus resultierende Patches bestehen aus Herzzellen, Fibroblasten und Endothelzellen in einem 70:15:15 Verhältnis10. Sphäroide nachweislich wirksame "Bausteine" der Gerüst-freie Herzgewebe Schöpfung, wie sie sind resistent gegen Hypoxie und verfügen über ausreichende mechanische Integrität für Implantation11,12. Frühere Studien haben gezeigt, verschiedene Herstellungsmethoden für Sphäroid Schöpfung, einschließlich der Verwendungdes der hängenden drop-Methode, Spinner Fläschchen13, mikrofluidische Systeme14und nicht anhaftende Kultur Oberflächen unbeschichtet oder beschichtet mit Agarose Mikro-Gußformen15. In diesem Protokoll verwenden wir die hängenden Tropfen Gerät, enthält Mikroporen für Hunderte von Sphäroide gleichzeitig kondensiert.
Diese Studie stellt eine neuartige und effiziente Gerüst-freie Methode für Herzgewebe Erstellung, manuell die Sphäroide in einen quadratischen Formhohlraum Aussaat und Inkubation des Gewebes auf einen Shaker für Reifung. Unter üblichen statischen Kulturbedingungen ist Sauerstoffdiffusion beschränkt sich auf die äußeren Aspekte der Gewebe-Konstrukt, was zentrale Nekrose. Mit der net Form Tauchen alle Sphäroide ausgesät in die Form jedoch in Medien mit einer Konstanten fluidische Bewegung, so dass für die verstärkte Verbreitung von Nährstoffen und Sauerstoff. Darüber hinaus diese Form-basierte Methode ermöglicht die gleichzeitige Erstellung von unterschiedlich großen Gewebe Patches mit minimalem manuellen Aufwand und das resultierende Gewebe kann leicht aus der Form entfernt werden. Diese neuartige Methode ermöglicht die effiziente und reproduzierbare Erstellung von Gerüst-frei, vielschichtigen kardiale Patches.

<table><tbody><tr><td>Humane kardiale Fibroblasten (HCF)</td><td>Sciencell</td><td>6310</td><td></td></tr><tr><td>FM-2 besteht aus Basalmedium</td><td>Sciencell</td><td>2331</td><td>HCF-Kulturmedium</td></tr><tr><td>Humane Nabelvenendothelzellen (HUVEC)</td><td>Lonza</td><td>CC-2935</td><td></td></tr><tr><td>EGM+Bullet Kit&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>CC5035</td><td>HUVEC Kulturmedium</td></tr><tr><td>E8 Medien</td><td>Invitrogen</td> A1517001 <td>HiPSC-Nährmedium</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Invitrogen</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzym (1X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604013</td><td>Trypsin und Zelldissoziationsreagenz</td></tr><tr><td>RPMI-Medien</td><td>Invitrogen</td><td>11875093</td><td>RPMI-Medien mit B-27-Supplement sind hiPSC-CM-Kulturmedium</td></tr><tr><td>B-27-Supplement (50x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td>RPMI-Medien mit B-27-Supplement sind hiPSC-CM-Kulturmedium</td></tr><tr><td>Trypanblau Lösung, 0,4 %</td> <td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Neuartige Netzform&nbsp;</td><td>TissueByNet Co.,Ltd</td><td>NM25-1</td><td></td></tr><tr><td>Hängende Fallplatte</td><td>Kuraray Co.,Ltd</td><td>MPc350</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platten&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS-3516</td><td></td></tr></tbody></table>

eine net schimmel basierende methode der dreidimensionalen gerüst-freie herzgewebe schöpfung

A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation

Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige und einfache net Schimmel-basierte Methode, dreidimensionale (3D) kardialen Gewebe ohne zusätzliche Gerüst-Material. Human-induzierte pluripotente Stammzellen-Zelle abgeleitet Kardiomyozyten (iPSC-CMs), menschliche kardialen Fibroblasten (TREIBGASEN) und menschliche nabelader Endothelzellen (Mediumwechsel) zu isolieren und verwendet, um eine Zellsuspension mit 70 % iPSC-CMs, 15 % TREIBGASEN und 15 % Mediumwechsel generieren. Sie sind in eine extrem niedrige Befestigungssystem "hängenden Tropfen", die Mikroporen für Hunderte von Sphäroide gleichzeitig kondensiert enthält Co kultiviert. Die Zellen aggregieren und spontan schlagende Sphäroide nach 3 Tagen der kokultur bilden. Die Sphäroide werden geerntet, in einen Roman Formhohlraum entkernt und auf einen Shaker im Brutschrank kultiviert. Die Sphäroide werden Reife Funktionsgewebe ca. 7 Tage nach der Aussaat. Die daraus resultierende mehrschichtige Gewebe bestehen aus verschmolzenen Sphäroide mit zufriedenstellenden Strukturintegrität und synchron schlagen Verhalten. Diese neue Methode hat viel versprechende Potenzial als eine reproduzierbare und kostengünstige Methode, um technische Gewebe für die Behandlung der Herzinsuffizienz in der Zukunft zu schaffen.

In unseren Experimenten haben wir eine Zellsuspension 70 % iPSC-CMs, 15 % TREIBGASEN und 15 % Mediumwechsel in RPMI/B-27 Zelle Medien in einer Konzentration von 2.475.000 Zellen pro mL verwendet. Nach dem Erstellen der Zellsuspension, verzichtet wir 4 mL Zellsuspension in jede Vertiefung der Dateianhang Ultra low Drop Aufhängesystem, wie unter Punkt 4.3 des Protokolls beschrieben. Die Verwendung des Behangs fundsystem führte die spontane Bildung von Hunderten Sphäroide nach 3 Tagen der Ku...

Dieses Protokoll beschreibt eine net Schimmel basierende Methode um dreidimensionale Gerüst-freie kardialen Gewebe mit zufriedenstellenden Strukturintegrität und synchron schlagen Verhalten zu erstellen.

Eine Net Schimmel basierende Methode der dreidimensionalen Gerüst-freie Herzgewebe Schöpfung

This protocol describes a novel and easy net mold-based method to create three-dimensional (3-D) cardiac tissues without additional scaffold material. ...

Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige und einfache schimmelbasierte Methode zur dreidimensionalen Erzeugung von Herzgewebe, bei der Sphäroide als Werkzeug für die Herstellung von gerüstfreiem Herzgewebe verwendet werden. In unseren Experimenten wurden drei Zelltypen, humane induzierte pluripotente Stammzellabgeleitete Kardiomyozyten, humane Herzfibroblasten und humane Nabelvenendothelzellen, isoliert und zur Erzeugung einer Zellsuspension verwendet. Mit 70 % Kardiomyozyten, 15 % Fibroblasten und 15 % Endothelzellen in einem konischen 50-ml-Röhrchen.Anschließend dosieren wir die Zellsuspension in jede Vertiefung eines Hanging Drop-Systems mit extrem geringer Anhaftung, was nach drei Tagen zur spontanen Bildung von Hunderten von schlagenden Sphäroiden führt. Die Sphäroide werden dann geerntet und in einen neuartigen Formhohlraum gesetzt. Das Gewebe wird dann in einem sterilen Behälter mit Medium auf einem Schüttler im Inkubator für mehrere Tage aufbewahrt.Die Form wird anschließend entfernt, was zu einem gerüstfreien Gewebepflaster mit mechanischer Integrität führt. Die hängende Fallvorrichtung ist eine wiederverwendbare, extrem niedrige Befestigungswanne mit 850 Mikroporen mit einem Durchmesser von jeweils 350 Mikrometern. Der hängende Tropfen ist mit Standard-Sechs-Well-Platten kompatibel.Nach der Herstellung der Zellsuspension geben wir vier Milliliter Zellsuspension mit 10 Millionen Zellen in jede Vertiefung des hängenden Tropfensystems ab. Die Geräte werden bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und 95 % Luftfeuchtigkeit kultiviert. Nach 72 Stunden wird eine spontane Bildung von schlagenden Sphäroiden mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 350 Mikrometern beobachtet.Die Sphäroide werden geerntet, indem die hängende Tropfenvorrichtung in eine andere Schale mit Medium gestellt und vorsichtig geschwenkt wird, um die Sphäroide freizusetzen und sie durch die Poren am Boden des hängenden Tropfensystems treiben zu lassen. Dies ist ein Schema der neuartigen Form für die Erstellung von dreidimensionalem, gerüstfreiem, kardialem Gewebe. Es enthält die Handhabungsmatte, die Füllbasis und die neuartige Form.Die neuartige Form besteht aus einer Basis, einer unteren quadratischen Platte, einem unteren Netz und 10 Lagen Seitennetzen aus feinen Edelstahlzinken. Ein oberes Netz, eine obere quadratische Platte, die Halterohre und Stopperstifte. Das Novel Mold-System kann Gewebe unterschiedlicher Größe erzeugen, darunter zwei mal zwei Millimeter, vier mal vier Millimeter und sechs mal sechs Millimeter.Der Boden, die quadratische Platte und das untere Netz werden mit Hilfe der Eckpfosten gestapelt und ausgerichtet. Anschließend werden 10 Lagen Seitennetze in abwechselnden Richtungen gestapelt, um mit Hilfe einer sterilen Pinzette ein Netz aus feinen Edelstahlzinken zu bilden. Die Füllbasis wird dann mit 1X Phosphatpufferlösung (PBS) gespült, um die Oberflächenspannung zu reduzieren, bevor die Sphäroide in die neuartige Form eingesetzt werden.Nach dem Benetzen des neuartigen Formhohlraums mit dem gleichen Methan werden die Sphäroide in den vorausgesetzten Hohlraum der gewünschten Größe gesetzt. Nach dem Einsetzen fließt das überschüssige Medium durch die Netzform, so dass sich die Sphäroide füllen und die Form des vordefinierten Hohlraums annehmen können. Das obere Netz und die obere quadratische Platte werden dann auf die Eckpfosten montiert und die Stopperstifte und die Halterohre befestigt, um ein Auswaschen der Sphäroide zu verhindern.Das gefüllte neuartige Formsystem wird auf eine Sechs-Well-Platte mit sechs Millimetern B-27-Zusatzmedium überführt und dann sieben bis zehn Tage lang im Inkubator auf einem schwingenden Schüttler bei 30 bis 40 U/min gehalten. Die Dauer der Inkubation kann je nach Größe des Herzpflasters geändert werden. Nach der Inkubation wird das System herausgenommen und das Halterohr, die Stopfen, die obere quadratische Platte und das obere Netz entfernt.Die geschichteten Seitennetze werden dann vorsichtig einzeln herausgeschoben, wobei darauf geachtet wird, dass das Gewebe nicht beschädigt wird. Nach dem Entfernen aller Seitennetze wird ein intaktes Herzpflaster auf dem unteren Netz erhalten. Funktionelles synchrones Schlagen wird innerhalb von 24 Stunden beobachtet.Diese neuartige formbasierte Methode ist eine effiziente und einfache Methode zur Herstellung von dreidimensionalem, gerüstfreiem Herzgewebe mit minimalem manuellen Aufwand. Die resultierenden mehrschichtigen Gewebe bestehen aus verschmolzenen Sphäroiden mit zufriedenstellender struktureller Integrität und synchronem Schwebverhalten. Diese neuartige, auf Formen basierende Methode stellt eine kostengünstige und skalierbare Alternative zu den derzeitigen Biofabrikationsmethoden von künstlich hergestellten Geweben dar.

a-net-mold-based-method-scaffold-free-three-dimensional-cardiac

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

In diesem Protokoll demonstrieren wir die Herstellung von biomimetischen Herzzellkultursubstraten, die aus zwei unterschiedlichen Polymermaterialien mittels Kapillarkraftlithographie hergestellt werden.  Die beschriebenen Methoden bieten eine skalierbare, kostengünstige Technik, um die Struktur und Funktion von makroskopischem Herzgewebe für in vitro und in vivo Anwendungen zu entwickeln.

Kapillar-Force-Lithographie für Herz-Tissue Engineering

Die Erzeugung von ausgerichteten Myokardgewebe ist eine wesentliche Voraussetzung für die Anpassung der jüngsten Fortschritte in der Stammzellbiologie, um klinisch nützliche Zwecke. Hier beschreiben wir einen Mikrokontaktdruck Ansatz für die präzise Steuerung der Zelle Form und Funktion. Mit hoch gereinigte Populationen von embryonalen Stammzellen abgeleitete kardiale Vorläuferzellen, wir erzeugen dann anisotropen funktionale Herzmuskelgewebe.

Generation Ausgerichtet Functional Myokardgewebe Durch Mikrokontaktdrucken

In diesen Studien bieten wir Methodik für Roman, Neugeborenen, murine Herzgerüste für den Einsatz in der regenerativen Studien.

Neonatal Cardiac Scaffolds: Neuartige Matrices für Regenerative Studies

Dieses Protokoll beschreibt das 3D-Bioprinting von Herzgewebe ohne den Einsatz von Biomaterialien. 3D-Bioprints-Herz-Patches zeigen mechanische Integration von Komponenten-Sphäroiden und sind vielversprechend bei der Herz-Gewebe-Regeneration und als 3D-Modelle von Herzerkrankungen.

Schaffung von Herzgewebe, die mechanische Integration von Sphäroiden mit 3D-Bioprinting ermöglicht

Das vorliegende Protokoll erzeugt netzförmige stämmige Herzgewebe, das kardiovaskuläre Zellen enthält, die aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden, um die Untersuchung der Zellimplantationstherapie für Herzkrankheiten zu ermöglichen.

Vorbereitung von Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues derived from Human iPS Cells for In Vivo Myokard repair

Hier beschreiben wir eine einfach zu bedienende Methodik zur Erzeugung von 3D-selbstorganisierten kardialen Mikrogewebe-Arrays, die aus vordifferenzierten humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten, Herzfibroblasten und Endothelzellen bestehen. Diese benutzerfreundliche und zellarme Technik zur Erzeugung kardialer Mikrogewebe kann für die Krankheitsmodellierung und frühe Stadien der Arzneimittelentwicklung implementiert werden.

Herstellung von 3D-Cardiac Microtissue Arrays unter Verwendung von humanen iPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten, kardialen Fibroblasten und Endothelzellen

Künstliche Gewebe sind stark auf geeignete vaskuläre Netzwerke angewiesen, um lebenswichtige Nährstoffe und Gase bereitzustellen und Stoffwechselabfälle zu entfernen. In dieser Arbeit erstellt ein schrittweises Seeding-Protokoll von Endothelzellen und Stützzellen hochorganisierte vaskuläre Netzwerke in einer Hochdurchsatzplattform, um das Entwicklung des Gefäßverhaltens in einer kontrollierten 3D-Umgebung zu untersuchen.

Schrittweise Zellaussaat auf tessellierten Gerüsten zur Untersuchung keimender Blutgefäße

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Entwicklung eines dreidimensionalen (3D) mikrofluidischen Modells von hoch ausgerichtetem menschlichem Herzgewebe zu erklären und zu demonstrieren, das aus Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten besteht, die mit Herzfibroblasten (CFs) in einem biomimetischen, kollagenbasierten Hydrogel in Kokulturiert sind, für Anwendungen in der Kardgewebeentwicklung, im Arzneimittelscreening und in der Krankheitsmodellierung.

Entwicklung von 3D-organisiertem menschlichem Herzgewebe innerhalb einer mikrofluidischen Plattform

Patientenspezifische Modelle verbessern das Vertrauen von Chirurgen und Mitmenschen bei der Entwicklung oder dem Erlernen von Operationsplänen. Dreidimensionale (3D) Drucker erzeugen ausreichende Details für die chirurgische Vorbereitung, replizieren jedoch nicht die haptische Treue des Gewebes. Es wird ein Protokoll vorgestellt, das die Erstellung von patientenspezifischen Silikon-Herzmodellen beschreibt und 3D-Druckpräzision mit simuliertem Silikongewebe kombiniert.

Erstellung patientenspezifischer Silikon-Herzmodelle mit Anwendungen in präoperativen Plänen und Hands-on-Training

Es wird eine reproduzierbare Methode zur Erzeugung von 3D-Myokardgeweben vorgestellt, bei der MEW-Gerüste (Melt Electrospinning Writing), Polycaprolacton (PCL)-Gerüste und Fibrin-Hydrogele mit hiPSC-abgeleiteten Kardiomyozyten und Fibroblasten kombiniert werden. Diese Technik bietet eine präzise Kontrolle über die Gerüstarchitektur und kann in präklinischen Arzneimitteltests und bei der Modellierung von Herzerkrankungen eingesetzt werden.

3D-Generierung von humanem Myokardgewebe mittels Schmelzelektrospinnen, Schreiben von Polycaprolacton-Gerüsten und hiPSC-abgeleiteten Herzzellen

Erfahren Sie eine formbasierte Methode zur Herstellung dreidimensionaler, gerüstfreier Herzgewebe unter Verwendung von Sphäroiden. Diese Technik ermöglicht die Entwicklung funktioneller Gewebe mit synchroner Kontraktion für die kardiale Geweberegeneration.

Eine Net Schimmel basierende Methode der dreidimensionalen Gerüst-freie Herzgewebe Schöpfung

Weitere Videos entdecken