Eine Net Schimmel basierende Methode der dreidimensionalen Gerüst-freie Herzgewebe Schöpfung
5. August 2018
Dieses Protokoll beschreibt eine net Schimmel basierende Methode um dreidimensionale Gerüst-freie kardialen Gewebe mit zufriedenstellenden Strukturintegrität und synchron schlagen Verhalten zu erstellen.
Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige und einfache schimmelbasierte Methode zur dreidimensionalen Erzeugung von Herzgewebe, bei der Sphäroide als Werkzeug für die Herstellung von gerüstfreiem Herzgewebe verwendet werden. In unseren Experimenten wurden drei Zelltypen, humane induzierte pluripotente Stammzellabgeleitete Kardiomyozyten, humane Herzfibroblasten und humane Nabelvenendothelzellen, isoliert und zur Erzeugung einer Zellsuspension verwendet. Mit 70 % Kardiomyozyten, 15 % Fibroblasten und 15 % Endothelzellen in einem konischen 50-ml-Röhrchen.
Anschließend dosieren wir die Zellsuspension in jede Vertiefung eines Hanging Drop-Systems mit extrem geringer Anhaftung, was nach drei Tagen zur spontanen Bildung von Hunderten von schlagenden Sphäroiden führt. Die Sphäroide werden dann geerntet und in einen neuartigen Formhohlraum gesetzt. Das Gewebe wird dann in einem sterilen Behälter mit Medium auf einem Schüttler im Inkubator für mehrere Tage aufbewahrt.
Die Form wird anschließend entfernt, was zu einem gerüstfreien Gewebepflaster mit mechanischer Integrität führt. Die hängende Fallvorrichtung ist eine wiederverwendbare, extrem niedrige Befestigungswanne mit 850 Mikroporen mit einem Durchmesser von jeweils 350 Mikrometern. Der hängende Tropfen ist mit Standard-Sechs-Well-Platten kompatibel.
Nach der Herstellung der Zellsuspension geben wir vier Milliliter Zellsuspension mit 10 Millionen Zellen in jede Vertiefung des hängenden Tropfensystems ab. Die Geräte werden bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und 95 % Luftfeuchtigkeit kultiviert. Nach 72 Stunden wird eine spontane Bildung von schlagenden Sphäroiden mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 350 Mikrometern beobachtet.
Die Sphäroide werden geerntet, indem die hängende Tropfenvorrichtung in eine andere Schale mit Medium gestellt und vorsichtig geschwenkt wird, um die Sphäroide freizusetzen und sie durch die Poren am Boden des hängenden Tropfensystems treiben zu lassen. Dies ist ein Schema der neuartigen Form für die Erstellung von dreidimensionalem, gerüstfreiem, kardialem Gewebe. Es enthält die Handhabungsmatte, die Füllbasis und die neuartige Form.
Die neuartige Form besteht aus einer Basis, einer unteren quadratischen Platte, einem unteren Netz und 10 Lagen Seitennetzen aus feinen Edelstahlzinken. Ein oberes Netz, eine obere quadratische Platte, die Halterohre und Stopperstifte. Das Novel Mold-System kann Gewebe unterschiedlicher Größe erzeugen, darunter zwei mal zwei Millimeter, vier mal vier Millimeter und sechs mal sechs Millimeter.
Der Boden, die quadratische Platte und das untere Netz werden mit Hilfe der Eckpfosten gestapelt und ausgerichtet. Anschließend werden 10 Lagen Seitennetze in abwechselnden Richtungen gestapelt, um mit Hilfe einer sterilen Pinzette ein Netz aus feinen Edelstahlzinken zu bilden. Die Füllbasis wird dann mit 1X Phosphatpufferlösung (PBS) gespült, um die Oberflächenspannung zu reduzieren, bevor die Sphäroide in die neuartige Form eingesetzt werden.
Nach dem Benetzen des neuartigen Formhohlraums mit dem gleichen Methan werden die Sphäroide in den vorausgesetzten Hohlraum der gewünschten Größe gesetzt. Nach dem Einsetzen fließt das überschüssige Medium durch die Netzform, so dass sich die Sphäroide füllen und die Form des vordefinierten Hohlraums annehmen können. Das obere Netz und die obere quadratische Platte werden dann auf die Eckpfosten montiert und die Stopperstifte und die Halterohre befestigt, um ein Auswaschen der Sphäroide zu verhindern.
Das gefüllte neuartige Formsystem wird auf eine Sechs-Well-Platte mit sechs Millimetern B-27-Zusatzmedium überführt und dann sieben bis zehn Tage lang im Inkubator auf einem schwingenden Schüttler bei 30 bis 40 U/min gehalten. Die Dauer der Inkubation kann je nach Größe des Herzpflasters geändert werden. Nach der Inkubation wird das System herausgenommen und das Halterohr, die Stopfen, die obere quadratische Platte und das obere Netz entfernt.
Die geschichteten Seitennetze werden dann vorsichtig einzeln herausgeschoben, wobei darauf geachtet wird, dass das Gewebe nicht beschädigt wird. Nach dem Entfernen aller Seitennetze wird ein intaktes Herzpflaster auf dem unteren Netz erhalten. Funktionelles synchrones Schlagen wird innerhalb von 24 Stunden beobachtet.
Diese neuartige formbasierte Methode ist eine effiziente und einfache Methode zur Herstellung von dreidimensionalem, gerüstfreiem Herzgewebe mit minimalem manuellen Aufwand. Die resultierenden mehrschichtigen Gewebe bestehen aus verschmolzenen Sphäroiden mit zufriedenstellender struktureller Integrität und synchronem Schwebverhalten. Diese neuartige, auf Formen basierende Methode stellt eine kostengünstige und skalierbare Alternative zu den derzeitigen Biofabrikationsmethoden von künstlich hergestellten Geweben dar.
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Überblick
Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige formbasierte Methode zur Erzeugung dreidimensionaler scaffold-freier kardialer Gewebe. Die Methode verwendet Sphäroide, um eine zufriedenstellende strukturelle Integrität und synchrones Schlagverhalten zu erreichen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Herzgewebe-Engineering
- Stammzellenbiologie
- Regenerative Medizin
Hintergrund
- Dreidimensionale Herzgewebe sind entscheidend für die Untersuchung der Herzfunktion.
- Scaffold-freie Methoden können die Gewebeintegration und Funktionalität verbessern.
- Sphäroide dienen als vielversprechendes Werkzeug für die Herzgewebeentwicklung.
- Die Kombination verschiedener Zelltypen kann die Gewebeeigenschaften verbessern.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer zuverlässigen Methode zur Erzeugung scaffold-freier kardialer Gewebe.
- Untersuchung der Verwendung von Sphäroiden in der kardialen Gewebebildung.
- Bewertung der strukturellen Integrität und Funktionalität der erzeugten Gewebe.
Verwendete Methoden
- Isolierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten, Fibroblasten und endothelialen Zellen.
- Herstellung einer Zellsuspension mit spezifischen Zelltyp-Verhältnissen.
- Einfüllen der Zellsuspension in ein Ultra-Low Attachment Hanging Drop System.
- Ernte der Sphäroide und Platzierung in eine neuartige Formhöhle zur Gewebeerhaltung.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Bildung von Hunderten von schlagenden Sphäroiden nach drei Tagen.
- Erhaltung des Gewebes in einer sterilen Umgebung führte zu lebensfähigen kardialen Geweben.
- Die Methode zeigte zufriedenstellende strukturelle Integrität.
- Synchrones Schlagverhalten wurde in den entwickelten Geweben beobachtet.
Schlussfolgerungen
- Die formbasierte Methode ist effektiv für die Erstellung scaffold-freier kardialer Gewebe.
- Die Verwendung von Sphäroiden verbessert die Entwicklung funktionaler kardialer Gewebe.
- Dieser Ansatz kann Auswirkungen auf die regenerative Medizin und die Herzforschung haben.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This scaffold-free cardiac tissue method addresses the need for reproducible, physiologically relevant models in early cardiovascular drug discovery. By generating mature, beating human cardiac tissues from iPSC-derived cells, it enables mechanistic de-risking of cardiotoxicity and efficacy targets. The approach supports predictive confidence in lead identification and preclinical triage through scalable, low-cost tissue fabrication.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a multicellular human cardiac model containing cardiomyocytes, fibroblasts, and endothelial cells.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing synchronous beating and structural integrity as functional readouts for pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces hundreds of uniform spheroids per run, enabling standardized preparation of tissue-building blocks for downstream assembly.
- Operational Value: The hanging drop system is compatible with standard 6-well plates and allows scalable spheroid generation for assay readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Generates mature, multilayered cardiac patches with synchronous beating within 7–10 days, supporting disease-relevant functional assessment.
- Operational Value: Offers a scaffold-free, reusable mold system that reduces variability and enhances reproducibility across preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation to preclinical model development, providing a bridge between spheroid-based screening and functional tissue evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through co-culture of three key cardiac cell types in a physiologically relevant ratio.
- Screening: Enables scalable spheroid production with quantitative outputs (size, beating frequency) for compound effect assessment.
- Analytics: Provides functional readouts including synchronous beating and structural integrity to compare treatment conditions.
- Translational Research: Delivers disease-relevant human cardiac tissue that models multicellular interactions and maturation processes.
- Enterprise Reuse: The mold and hanging drop systems are reusable, positioning the method as a sustainable platform for repeated tissue generation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through functional, scaffold-free human cardiac tissue with multicellular composition.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via ultra-low attachment hanging drops and precision-molded tissue casting.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk in cardiovascular programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on early human tissue-level efficacy and safety signals.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, spheroid formation, and tissue handling.
- Depends on ultra-low attachment hanging drop systems and sterile stainless steel mold components.
- Necessitates standardized seeding ratios and incubation conditions for batch-to-batch consistency.
- Adaptation to other tissue types would require optimization of cell ratios and mold geometry.
- Manual spheroid seeding and mold assembly steps may limit throughput without automation integration.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:14
Process Flow of Cardiac Tissue Creation by Novel Mold
1:21
Spheroids Creation by Hanging Drop Method
3:26
Seeding Spheroids into the Mold Cavity
5:16
Result: The 3D Cardiac Patch Contains of Stacked Spheroids with Functional Beating after Removing from Novel Mold
5:58
Conclusion
