Name: Vorrichtung zur Ernte Gewebe Microcolumns (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Lernen Sie eine Methode zur Gewinnung von autologem Vollhautgewebe mit minimaler Narbenbildung am Spenderort. Dieses Protokoll ermöglicht effiziente Hochdurchsatzgewinnung für Hautregenerationsforschung und Gewebetechnik.

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Diese Arbeit wurde von der Armee, Marine, NIH, Luftwaffe, VA und Health Affairs der versichere II unterstützen, unter Award Nr. teilweise unterstützt. W81XWH-13-2-0054. Die US-Armee medizinische Forschung Übernahmen, ist 820 Chandler Street, Fort Detrick, MD 21702-5014 die Vergabe und Verwaltung Erwerb Büro. Meinungen, Interpretationen, Schlussfolgerungen und Empfehlungen sind die des Autors und nicht unbedingt unterstützt werden durch das Department of Defense.

Alle Arbeiten mit lebenden Tieren und tierischen Gewebeproben vom Massachusetts General Hospital institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt worden.
(1) Produktion der Ernte Nadeln
<ol><li>Setup der Produktionsphase<ol>
<li>Sichern Sie einen weiblichen Luer Lock Anschluss auf einen Beitrag zu, und montieren Sie die Post auf einem Drehtisch, so dass die Luer-Lock in der Mitte der Bühne (Abb. 1A) ist.</li>
		<li>Diese erste Rotationstisch senkrecht, und montieren Sie ihn senkrecht auf eine zweite, horizontale Drehung Bühne (Abbildung 1B).</li>
		<li>Montieren Sie die horizontale Drehung Bühne auf einem zweiachsigen Verschiebetisch (Abbildung 1B).</li>
		<li>Befestigen Sie die Kombination auf eine stabile Unterlage, z. B. eine optische Steckbrett.</li>
		<li>Montieren Sie separat ein rotierendes Werkzeug auf dem gleichen Steckbrett mit dem Werkzeug parallel mit dem Steckbrett und in etwa die gleiche Höhe wie der Luer Lock Anschluss auf die Kombination Rotation/Verschiebetisch (Abbildung 1C) positioniert.</li>
		<li>Installieren Sie zwei Trennscheiben konzentrisch auf das Drehwerkzeug (ein kleiner, niedriger Körnung Diamant Trennscheibe über eine größere, höhere Körnung Stein Trennscheibe) (Abbildung 1D). Hinweis: Über eine 9 mm ist Unterschied zwischen den Durchmessern der beiden Räder in der Regel ausreichend.</li>
		<li>Stellung ein Overhead-Licht Quelle mit einem verstellbaren Arm über das Drehwerkzeug mit dem Licht, die darauf abzielen, die Schneidräder.</li>
		<li>Zur Verbesserung der Visualisierung positionieren Sie eines sezierenden Mikroskop über die Produktionseinrichtung so, dass das Okular auf die Schneidscheiben (Abbildung 1C) ausgerichtet ist. Hinweis: Alternativ können Benutzer vergrößernde Brillen tragen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Neugestaltung der Nadelspitze<ol>
<li>Tragen Sie Schutzbrillen und einen Mundschutz zu verhindern, dass feine Metallteilchen in die Augen oder Atemwege.</li>
		<li>Wählen Sie Injektionsnadeln der entsprechenden Größe, basierend auf experimentellen Anforderungen messen.</li>
		<li>Markieren Sie die gewünschte Länge auf jede Ernte Nadel. Hinweis: Für die Ernte von Schweinen Haut, sind 8 mm Nadeln in der Regel ausreichend; Obwohl die Länge variieren basierend auf experimentellen Anforderungen (zB., Dicke der Haut Zielgewebe, Gauge Nadel). Im Allgemeinen eignet sich eine 19-Gauge-Nadel für Schweine Haut.</li>
		<li>Niedriger markiert die Nadel senkrecht zur Drehwerkzeugs unter Spannung, mit der Kante der äußeren Trennscheibe, schneiden Sie die überschüssige Länge der Nadel an der Stelle im Schritt 1.2.3.</li>
		<li>Verbinden Sie die verkürzte, stumpfe Nadel mit dem weiblichen Luer Lock Anschluss auf die Produktionsphase.</li>
		<li>Einstellen Sie die horizontale Drehung Bühne so, dass die Nadel in einem 12° Winkel parallel zur Schneidscheiben auf das Drehwerkzeug ist (Änderung des Winkels den Kraftaufwand zum Einführen der Nadel auswirkt).</li>
		<li>Schalten Sie den Overhead-Licht und stellen Sie seine Position unter Beachtung der Nadel unter Vergrößerung, bis das Licht der Mittellinie (längs) der Nadel reflektiert wird.</li>
		<li>Schalten Sie das Drehwerkzeug, dann benutze die Verschiebetisch, die Nadel nach innen (Diamant) schneiden Scheibe (Abb. 2A) zu gelangen.</li>
		<li>Halten Sie die Nadel langsam gegen die Trennscheibe voran, bis die Trennscheibe etwa die Mittellinie der Nadel (als visualisierte durch das Deckenlicht Reflexion entlang der Mittellinie) erreicht.</li>
		<li>Bewegen Sie langsam die geschnittenen Nadel-Oberfläche aus der inneren Diamantscheibe auf Stein Außenrad auf den Schnitt Nadel Oberfläche mit einer feineren Politur (Abbildung 2B).</li>
		<li>Ziehen Sie die Nadel von der Trennscheibe.</li>
		<li>Mit der vertikalen Rotationstisch, drehen Sie die Nadel 180°.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.2.9-1.2.10 um die andere Seite der Nadel umzuformen. Hinweis: Die Nadel müsste nun zwei Schneidspitzen etwa gleichlang (Abbildung 2 und 2D).</li>
		<li>Entfernen Sie die Nadel aus der Produktionsphase.</li>
		<li>Saubere Bohrung innen mit einem Metallgitter, die etwas kleiner als die Nadel Innendurchmesser.</li>
		<li>Mit einem scharfen Holzstab (zB., vom Ende des kleinen Holzstab auf einem Baumwolle Spitze Applikator Abknicken), entfernen Sie Grate, die noch an den Rändern der neu geformten Nadel angebracht werden können. Hinweis: Ernte Nadeln können elektropoliert und von Autoklaven sterilisiert werden, falls erforderlich.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Haut Gewebe Ernte
<ol><li>Verwenden Sie die Ernten Nadeln Haut Microcolumns von ex-Vivo -Gewebe oder lebende Tiere zu sammeln.</li>
	<li>Für ex-Vivo Haut Gewebe, das ist dünn (vor allem aus Proben, wo das subkutane Fett fehlt oder getrimmt wurde entfernt), halten das Zielgewebe über die Öffnung eine 50 mL Zentrifugenröhrchen, oder Stapeln zwei Stücke des Gewebes übereinander, um eine Beschädigung der n Eedle Tipps von schlagen sie gegen die harten Oberflächen. Hinweis: Für die in Vivo Ernte von lebenden Tieren, wird empfohlen, dass lokale Lidocain und Epinephrin durch intradermale Injektion für Analgesie und Blutungen zu verringern verabreicht werden.</li>
	<li>Montieren Sie die Ernte Apparat nach der Höhe des Microcolumns benötigt, wie unten beschrieben.</li>
	<li>Niedrige mittlere Volumen Option:<ol>
<li>Um kleine bis mittlere Mengen von Microcolumns zu ernten, füllen Sie einfach eine standard-Spritze (10-20 mL Spritzen in der Regel gut funktionieren) mit normalen Kochsalzlösung und verbinden Sie es mit einer Ernte Nadel.</li>
		<li>Vollständig Ernte Nadel in die Haut der Spenderin, dann es zurückziehen.</li>
		<li>Drücken Sie den Kolben der Spritze zu spülen Kochsalzlösung durch die Ernte Nadel und vertreiben die Microcolumn, die in der Nadel Bohrung eingereicht wird.</li>
		<li>Um die Ernte zu beschleunigen, wiederholen Sie Schritt 2.4.2 3-bis 5-Mal vor der Vertreibung der Microcolumns im Schritt 2.4.3. Hinweis: Es ist in der Regel bequem zu vertreiben die Microcolumns in eine Standardzelle Sieb um die anschließende Sammlung von Microcolumns zu erleichtern.</li>
		<li>Wenn Nadeln verstopft werden, erhöhen Sie den Druck auf den Kolben stecken Gewebe zu vertreiben und die Verstopfung entfernen. Wenn einfach Druck nicht ausreicht, Bohrung einfügen ein Metalldraht durch die Nadel Spitze Öffnung, die Verstopfung in der Nadel zu löschen.</li>
		<li>Halten Sie die Microcolumns eingetaucht Kochsalzlösung oder mittlere bis um Austrocknung zu verhindern. Hinweis: Mit einem erfahrenen Betreiber die oben beschriebene Methode lässt sich Microcolumns mit einer Rate von ungefähr 1 Microcolumn pro Sekunde zu ernten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hohes Volumen Option:<ol>
<li>Erstellen Sie eine einfache Saug-gestützte Vorrichtung, die konstruiert werden kann, um die Sammlung von großen Mengen an Microcolumns zu erleichtern. Hinweis: Das Gerät besteht aus einer Ernte Nadel, 20 mL-Spritze mit Luer Lock Düse, Saug-Adapter in der Regel verwendet für Fettabsaugung(Abbildung 3)und sterile Absaugkanister.</li>
		<li>Entfernen Sie den Kolben aus der 20 mL Spritze.</li>
		<li>Legen Sie die Spritze auf einen Saugnapf-Adapter.</li>
		<li>Vervollständigen Sie die Versammlung durch das Anbringen einer ernten Nadel der Spritze (Abbildung 3B).</li>
		<li>Verwenden Sie ein Stück steril Saug Schlauch zum sterilen Absaugkanister saugen-Adapter herstellen. Stellen Sie sicher, dass die Ernte Apparat mit einem Kanister-Eingang verbunden ist, die Flüssigkeit in den Behälter ungehindert fließen (die Verbindung mit einem Kanister-Port, die für Abfluss anstatt Zufluss gekennzeichnet ist erfordern) ermöglicht.</li>
		<li>Schließen Sie das Gerät an eine Unterdruck-Quelle. Hinweis: Der erforderlichen Druck hängt Nadel Durchmesser und Länge, wie zuvor beschrieben8. Für das Gerät in diesem Manuskript beschrieben ist die Absaugung in typischen OP-Säle gefunden in der Regel ausreichend.</li>
		<li>Verbinden Sie eine Ernte Nadel der Spritze.</li>
		<li>Ernten Sie die Microcolumns durch die Ernte Nadel in die Haut. Hinweis: Die Microcolumns wird in die Spritze abgesaugt und dann in den Absaugkanister gespült.</li>
		<li>Zeitweise Tauchen Sie die Ernte Nadel in einen Behälter mit steriler Kochsalzlösung während der Ernteverfahren, das System zu spülen. Hinweis: Diese saline Flush erleichtert Transport von der Microcolumn und stellt sicher, dass sie bleiben hydratisiert. Alternativ kann ein MFR Luer-Adapter mit dem Luer-Lock der Spritze und durch eine Verbindung Schlauch, auch zu einem hängenden saline Tropf Beutel angeschlossen werden.</li>
		<li>Halten Sie einerseits einen Metalldraht oder Messen Sie kleinere Nadel, das ist etwas kleiner als die Ernte Nadel Innendurchmesser. Wenn die Nadel verstopft, kann es durch Einfügen der Metalldraht in die Nadel Bohrung gelöscht werden.</li>
		<li>Wenn die gewünschte Menge an Microcolumns in dem Behälter angesammelt haben, trennen Sie das Gerät von Saug-, dann gießen Sie den Inhalt des Absaugkanister, durch einen Filter, um die Microcolumns zu sammeln.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gelten Sie nach der Ernte eine topische Antibiotika Salbe über die Spender-Websites. Hinweis: Weitere Verbände sind in der Regel nicht erforderlich für Spender Websites.</li>
</ol>

<ol><li>Sun, B. K., Siprashvili, Z., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+skin+grafting+and+treatment+of+cutaneous+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Advances in skin grafting and treatment of cutaneous wounds.</a> Science. 346 (6212), 941-945 (2014).</li>
<li>Singh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenging+the+Conventional+Therapy%3A+Emerging+Skin+Graft+Techniques+for+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Challenging the Conventional Therapy: Emerging Skin Graft Techniques for Wound Healing.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 136 (4), 524-530 (2015).</li>
<li>Tam, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractional+Skin+Harvesting%3A+Autologous+Skin+Grafting+without+Donor-site+Morbidity%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery.+Global+Open%22%5BJournal%5D)">Fractional Skin Harvesting: Autologous Skin Grafting without Donor-site Morbidity.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 1 (6), 47(2013).</li>
<li>Tam, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+full-thickness+skin+by+microcolumn+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of full-thickness skin by microcolumn grafting.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (10), 2796-2805 (2017).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+hair+and+other+skin+appendages%3A+A+microenvironment-centric+view%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Regeneration of hair and other skin appendages: A microenvironment-centric view.</a> Wound Repair and Regeneration. 24 (5), 759-766 (2016).</li>
<li>Fernandes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-mechanical+fractional+skin+rejuvenation%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Micro-mechanical fractional skin rejuvenation.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (2), 216-223 (2013).</li>
<li>Rettinger, C. L., Fletcher, J. L., Carlsson, A. H., Chan, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+epithelialization+and+improved+wound+healing+metrics+in+porcine+full-thickness+wounds+transplanted+with+full-thickness+skin+micrografts%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Accelerated epithelialization and improved wound healing metrics in porcine full-thickness wounds transplanted with full-thickness skin micrografts.</a> Wound Repair and Regeneration. 25 (5), 816-827 (2017).</li>
<li>Franco, W., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/270571598_Fractional_Skin_Harvesting_Device_Operational_Principles_and_Deployment_Evaluation">Fractional skin harvesting: device operational principles and deployment evaluation.</a> Journal of Medical Devices. 8 (4), 041005(2014).</li>
<li>Rasmussen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+autologous%2Fallogeneic+constructs+for+skin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Military+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric autologous/allogeneic constructs for skin regeneration.</a> Military Medicine. 179, 8 Suppl 71-78 (2014).</li>
<li>Ter Horst, B., Chouhan, G., Moiemen, N. S., Grover, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+keratinocyte+delivery+in+burn+wound+care%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Advances in keratinocyte delivery in burn wound care.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 123, 18-32 (2018).</li>
<li>Wong, V. W., Levi, B., Rajadas, J., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+niches+for+skin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Stem cell niches for skin regeneration.</a> International Journal of Biomaterials. 2012, 926059(2012).</li>
<li>Manstein, D., Herron, G. S., Sink, R. K., Tanner, H., Anderson, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractional+photothermolysis%3A+a+new+concept+for+cutaneous+remodeling+using+microscopic+patterns+of+thermal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fractional photothermolysis: a new concept for cutaneous remodeling using microscopic patterns of thermal injury.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 34 (5), 426-438 (2004).</li>
<li>Iriarte, C., Awosika, O., Rengifo-Pardo, M., Ehrlich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+applications+of+microneedling+in+dermatology%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical%2C+Cosmetic+and+Investigational+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Review of applications of microneedling in dermatology.</a> Clinical, Cosmetic and Investigational Dermatology. 10, 289-298 (2017).</li>
<li>Anderson, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+treatment+of+traumatic+scars+with+an+emphasis+on+ablative+fractional+laser+resurfacing%3A+consensus+report%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Laser treatment of traumatic scars with an emphasis on ablative fractional laser resurfacing: consensus report.</a> Journal of the American Medical Association Dermatology. 150 (2), 187-193 (2014).</li>
<li>Hogan, S., Velez, M. W., Ibrahim, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedling%3A+a+new+approach+for+treating+textural+abnormalities+and+scars%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cutaneous+Medicine+and+Surgery%22%5BJournal%5D)">Microneedling: a new approach for treating textural abnormalities and scars.</a> Seminars in Cutaneous Medicine and Surgery. 36 (4), 155-163 (2017).</li>
<li>Manuskiatti, W., Fitzpatrick, R. E., Goldman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+effectiveness+and+side+effects+of+carbon+dioxide+laser+resurfacing+for+photoaged+facial+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Academy+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Long-term effectiveness and side effects of carbon dioxide laser resurfacing for photoaged facial skin.</a> Journal of the American Academy of Dermatology. 40 (3), 401-411 (1999).</li>
</ol>

Die Autoren sind Co-Erfinder auf Patente im Zusammenhang mit der Technologie beschrieben in diesem Artikel, aus denen sie Lizenzen erhalten haben und Lizenzeinnahmen durch ihre Institution, Massachusetts General Hospital. J. Tam berät auch bei Medline Industries, Inc., die eine kommerzielle Lizenz für diese Technologie hält.

Die hier beschriebenen Methoden sollen die Sammlung von Gewebe Microcolumns in ausreichenden Mengen für in Vivo große tierexperimentellen Studien mit Werkzeugen aus handelsüblichen Laborbedarf zu ermöglichen. Dieses Gerät hat früher bei der Ernte Gewebe aus ausgeschnittenen Menschenhaut4,9 , sowie live Schweine Haut3. Die einzelnen Parameter beschrieben sind diejenigen, die am besten geeignet für den Einsatz bei Schweinen zu finde...

Autologe Hauttransplantationen ist die Hauptstütze der Wunde Reparatur, aber es ist begrenzt durch Spender Website Knappheit und Morbidität, führt zu gemeinsamen Anstrengungen in den letzten Jahrzehnten entwickeln neue Therapieoptionen zu ersetzen konventionelle Hauttransplantationen1,2 . Wir vor kurzem entwickelt eine alternative Methode zur Ernte Haut um die Vorteile der voll-dicke Hauttransplantationen zu nutzen, bei gleichzeitiger Minimierung der Spender Website Morbidität. Durch das Sammeln von voll-dicke Haut in Form von kleinen (~0.5 mm Durchmesser) "Microcolumns", Spender Websites sind in der Lage, schnell und ohne Narben unter normalen Umständen zu heilen (für mögliche Ausnahmen siehe Abschnitt Diskussion)3. Microcolumns können direkt in die Wunde Betten Wundverschluss zu beschleunigen, reduzieren Kontraktion3angewendet werden, und wiederherstellen den unterschiedlichsten epidermalen und dermalen Zelltypen und Adnexe Funktionsstrukturen4, von denen viele in fehlen konventionelle Split-Dicke Hauttransplantation oder aktuelle biotechnologisch Haut Ersatz5. Die Fähigkeit der Microcolumns um Heilung zu erweitern und ihre Spender Websites ohne Narbenbildung heilen wurden beide unabhängig validiert durch weitere Forschung Gruppen6,7.
Zuvor haben wir ein Labor Erntesystem um die Sammlung von Microcolumns bei Skala8zu ermöglichen; Allerdings besteht dieses System aus vielen kundenspezifischen Komponenten, die nicht allgemein verfügbar sind. Hier beschreiben wir im Detail den Prozess für die Herstellung von Nadeln sowie einfache Sammelsysteme, die Ernte von meist handelsübliche Komponenten gebildet, die verwendet werden, um Volumen-Ernte zu erreichen. Der Apparat beschrieben in diesem Manuskript ist geeignet für in-vitro- und tierische Arbeit, aber nicht für den Einsatz beim Menschen. Eine klinische Gerät mit FDA-Zulassung für die Anwendung dieser Technik in den Menschen ist im Handel erhältlich, aber nicht hier im Detail besprochen werden.

<table><tbody><tr><td>Diamantscheibe</td><td>Dremel</td><td>545</td><td></td></tr><tr><td>Injektionsnadel (19G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-840-98</td><td>Andere Nadelgrößen können verwendet werden, je nach experimentellem Bedarf</td></tr><tr><td>Steinrad</td><td>Dremel</td><td>540</td><td></td></tr><tr><td>Spritze (20mL mit Luer-Lock)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-124-967</td><td></td></tr><tr><td>Absaugadapter</td><td>Tulip Medical</td><td>PA20BD</td><td>Optional, für die Ernte großer Mengen</td></tr><tr><td>Saugkanister</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-898-212</td><td>Optional, für die Ernte in großen Mengen. Vor Gebrauch sterilisieren.</td></tr><tr><td>Saugschlauch</td><td>Medline</td><td>DYND50216H</td><td>Optional, für die Ernte großer Mengen</td></tr></tbody></table>

vorrichtung zur ernte gewebe microcolumns

Apparatus for Harvesting Tissue Microcolumns

Dieses Manuskript beschreibt den Produktionsprozess für ein Laborgeräte, hergestellt aus Standardkomponenten, die verwendet werden, um Microcolumns von voll-dicke Hautgewebe zu sammeln. Die geringe Größe der Microcolumns kann die Spender Standorte schnell heilen ohne Entnahmestelle Narbenbildung, bei der Ernte voll dicke Gewebe ermöglicht die Einbeziehung aller zellulären und extrazellulären Komponenten von Hautgewebe, einschließlich verbunden mit tiefer dermalen Regionen und die Adnexe Hautstrukturen müssen die noch mit konventionellen Tissue engineering-Techniken erfolgreich wiedergegeben werden. Die Microcolumns kann direkt in Hautwunden erweitern Heilung angewendet werden, oder sie können als autologe Zellen/Gewebe-Quelle für andere Gewebe-engineering-Ansätze verwendet werden. Die Ernten Nadeln erfolgt durch Ändern der standard Kanülen, und sie allein für die Ernte von kleinen Mengen von Gewebe verwendet werden können oder gepaart mit einem einfachen Saug-basierte Auflistung System (auch aus handelsüblichen Laborbedarf hergestellt) für Großserien-Ernte um Studien in großen Tiermodellen zu erleichtern.

Die Ernten Nadeln sollen Microcolumns von voll-dicke Hautgewebe mit ca. 80-90 % Erfolgsrate zu sammeln, und jedes Microcolumn sollte enthalten, Epidermis, Dermis und einige Fettpölsterchen (Abbildung 4). Wenn die Erfolgsquote bei der Ernte niedrig ist, oder wenn es schwierig wird, legen eine Nadel in das Gewebe, wird eine neue Nadel wahrscheinlich benötigt. Wenn die Erfolgsrate für die Ernte konstant niedrig, sogar mit neuen Nadeln ist, sind die Nadeln wahrsc...

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Herstellung von Ernte Nadeln, die verwendet werden, um voll-dicke Hautgewebe zu sammeln, ohne dass Spender Website Narbenbildung. Die Nadeln kombinierbar mit einer einfachen Sammelsystem Großserien-Ernte zu erreichen.

Vorrichtung zur Ernte Gewebe Microcolumns

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns ...

Diese Methode kann helfen, wesentliche Fragen im Hautgewebe Regenerationsfeld zu beantworten, die ist, wie die verschiedenen Zelltypen und Strukturen, die in der natürlichen Haut enthalten sind zu ersetzen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass autologe Volldicke Haut mit minimaler Spender-Site-Morbidität gesammelt werden kann. Demonstriert wird das Verfahren von Bill Farinelli, der wissenschaftlicher Mitarbeiter in unserem Labor ist.Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Einrichtung der Produktionsphase, wie im Textprotokoll beschrieben. Installieren Sie zwei Trennscheiben konzentrisch auf das Drehwerkzeug. Verwenden Sie ein kleineres niedrigeres Diamant-Cutoff-Rad über einem größeren höheren Rasterstein-Cutoff-Rad.Positionieren Sie eine Oberlichtquelle mit verstellbarem Arm über dem Drehwerkzeug mit dem Licht, das auf die Schneidräder gerichtet ist. Um die Visualisierung zu verbessern, positionieren Sie ein Sezieren von Mikroskop über dem Produktionsaufbau, sodass das Okular auf die Schneidscheiben fokussiert ist. Tragen Sie beim Umformen der Nadelspitze eine Schutzbrille und eine chirurgische Maske, um zu verhindern, dass feine Metallpartikel in die Augen oder Atemwege gelangen.Wählen Sie hypodermische Nadeln der entsprechenden Messgröße basierend auf experimentellen Anforderungen. Markieren Sie die vorgesehene Länge auf jeder Erntenadel. Senken Sie die Nadel senkrecht zum Drehwerkzeug mit der Einschaltkraft, die die Kante der äußeren Schneidscheibe verwendet, um die überschüssige Länge der Nadel an der markierten Stelle abzuschneiden.Schließen Sie die verkürzte stumpfe Nadel an den weiblichen Luer-Verriegelungsstecker auf der Produktionsbühne an. Stellen Sie die horizontale Drehstufe so ein, dass sich die Nadel in einem 12-Grad-Winkel parallel zu den Schneidscheiben am Drehwerkzeug befindet. Schalten Sie das Oberlicht ein und passen Sie seine Position an, während Sie die Nadel unter der Vergrößerung beobachten, bis das Licht von der Mittellinie der Nadel reflektiert wird.Schalten Sie das Drehwerkzeug ein. Verwenden Sie dann die Übersetzungsstufe, um die Nadel in Richtung der inneren Schneidscheibe zu bringen. Bewegen Sie die Nadel langsam gegen die Schneidscheibe, bis die Schneidscheibe ungefähr die Mittellinie der Nadel erreicht.Bewegen Sie die geschnittene Nadeloberfläche vom inneren Diamantrad langsam auf das äußere Steinrad, um die geschnittene Nadeloberfläche mit einer feineren Politur zu beenden. Ziehen Sie die Nadel von der Schneidscheibe weg. Drehen Sie die Nadel mit der vertikalen Rotationsstufe um 180 Grad.Wiederholen Sie diese Schritte, um die andere Seite der Nadel umzuformen. Entfernen Sie nun die Nadel von der Produktionsstufe. Reinigen Sie die Innenbohrung mit einem Metalldraht, der etwas kleiner ist als der Innendurchmesser der Nadel.Entfernen Sie mit einem scharfen Holzstab alle Grate, die noch an den Rändern der neu gebildeten Nadel befestigt werden können. Wenn ein hohes Volumen an Mikrosäulen benötigt wird, entfernen Sie den Kolben aus einer 20-Milliliter-Spritze. Befestigen Sie die Spritze dann an einem Saugadapter.Vervollständigen Sie die Montage, indem Sie eine Erntenadel an der Spritze befestigen. Verwenden Sie ein Stück sterile Saugschläuche, um den Saugadapter an einen sterilen Saugkanister anzuschließen. Stellen Sie sicher, dass das Erntegerät mit einem Kanistereingang verbunden ist, der es ermöglicht, ungehindert Flüssigkeit in den Kanister zu fließen.Verbinden Sie das Gerät nun mit einer Unterdruckquelle. Ernten Sie die Mikrosäulen, indem Sie die Erntenadel in die Haut einlegen. Tauchen Sie die Erntenadel während des Erntevorgangs zeitweise in einen Behälter mit steriler Saline, um das System zu spülen.Halten Sie einen Metalldraht oder eine Nadel bereit, die etwas kleiner ist als der Innendurchmesser der Erntenadel. Wenn die Nadel verstopft wird, kann sie durch Einsetzen des Metalldrahtes in die Nadelbohrung gelöscht werden. Wenn sich die gewünschte Menge an Mikrosäulen im Kanister angesammelt hat, trennen Sie das Gerät von der Absaugung.Dann gießen Sie den Inhalt des Saugkanisters durch einen Filter, um die Mikrosäulen zu sammeln. Hier ist eine fertige Erntenadel von vorne und von der Seite betrachtet. Beachten Sie die beiden Schnittpunkte an der Spitze.Die Erntenadeln sollten in der Lage sein, Mikrosäulen aus volldicken Hautgewebe mit einer Erfolgsrate von ca. 80 bis 90% zu sammeln. In dieser Abbildung stellen Häkchen einen Millimeter dar. Jede Mikrosäule sollte Epidermis, Dermis und etwas subkutanes Fett enthalten.Mikrosäulen können direkt auf die Wundheilung aufgetragen oder mit verschiedenen Matrixmaterialien kombiniert werden, um Kombinationskonstrukte zu erzeugen. Mikrosäulen können auch in der Kultur für In-vitro-Studien gepflegt werden. Bei der Durchführung von Hochvolumen-Ernte, ist es wichtig, denken Sie daran, eine intermittierende Saline-Flush zu integrieren.Obwohl diese Methode für die Reparatur von Hautwunden entwickelt wurde, könnte ein ähnliches Prinzip auf andere Organsysteme wie Muskeln angewendet werden, bei denen eine autologe Gewebetransplantation erforderlich ist.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Video beschreibt die Technik zur Gewinnung einer einzelnen Zelle aus einer heterogenen Zellpopulation mittels Laser-Capture-Mikrodissektion. Die einzelne isolierte Zelle kann für weitere genomische Studien oder die Krebsforschung verwendet werden.

Einzelzellprobenahme mittels Laser-Capture-Mikrodissektion: Eine Technik zur Gewinnung von Zielzellen aus einer heterogenen Zellpopulation

In diesem Video stellen wir das Protokoll zur Gewinnung von fein gemahlenem extrazellulärem Matrixpulver aus lyophilisiertem dezellularisiertem Gewebe durch Kryomahlen vor. Das pulverförmige ECM behält seine biochemische Zusammensetzung und kann für die Microcarrier-Synthese verwendet werden.

Kryomahlen von dezellularisiertem Gewebe: eine Technik zur Gewinnung von feinem extrazellulärem Matrixpulver

Dieses Video demonstriert das Verfahren der Herstellung von Mikrocarriern aus extrazellulärer Matrix durch Elektrospraying. Diese Microcarrier simulieren die native gewebespezifische Mikroumgebung und sind in Langzeit-3D-In-vitro-Zellkulturmodellen stabil.

Herstellung von Biogerüsten durch Elektrospraying: Eine Technik zur Erzeugung von Microcarrier-Gerüsten, die aus der extrazellulären Matrix von dezellularisiertem Gewebe gewonnen werden

In diesem Video demonstrieren wir die SPME-Sonden-basierte Extraktion von Metaboliten aus einer vorentnommenen Spenderniere. Die extrahierten Metaboliten können für metabolomische und lipidomische Analysen verwendet werden, um die Organqualität für eine Transplantation zu beurteilen.

Festphasen-Mikroextraktionsprobenahme: Eine sondenbasierte Technik zur Probenextraktion aus Transplantatgewebe

Dieses Video zeigt eine Methode zur Erzeugung dreidimensionaler Astrozyten-Gerüste in Hydrogel-Mikrosäulen. Die Innenseite der Mikrosäulen ist mit Kollagen beschichtet. Es werden Astrozyten eingeführt, die an Kollagen haften und sich bei weiterer Inkubation selbst zu einem dreidimensionalen Gerüst zusammensetzen.

Eine In-vitro-Methode zur Erzeugung von Astrozyten-Gerüsten in Hydrogel-Mikrosäulen

Quelle: Struzyna, L. A. et. al., Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Entwicklung von neuronalen Netzwerken aus Mikrogewebe unter Verwendung einer Hydrogel-Mikrosäule mit einem extrazellulären Matrixkern. Ausgesäte neuronale Aggregate haften an, erweitern Projektionen und bilden strukturierte neuronale Netzwerke, die zu Fortschritten in der...

Entwicklung eines neuronalen Netzwerks mit Mikrogewebe unter Verwendung einer Hydrogel-basierten Mikrosäule

Marginating-pulmonale Leukozyten weisen im Vergleich zu anderen Leukozytenpopulationen einzigartige Eigenschaften und unterschiedliche immunologische Funktionen auf. Hier beschreiben wir die selektive Entnahme dieser Subpopulation von Lungenleukozyten durch erzwungene Perfusion der Lunge bei Ratten und Mäusen. Marginating-pulmonale Leukozyten scheinen entscheidend für die Bestimmung der Anfälligkeit für durch Blut übertragbare und lungenbedingte Krankheiten zu sein.

Selektive Ernte von Marginating-Lungen-Leukozyten

Marginating-hepatische Leukozyten weisen im Vergleich zu anderen Leukozytenpopulationen einzigartige Eigenschaften und unterschiedliche immunologische Funktionen auf. Hier beschreiben wir eine Methode zur selektiven Entnahme dieser spezifischen Leberzellpopulation durch erzwungene Perfusion der Leber von Ratten oder Mäusen. Marginating-hepatische Leukozyten scheinen entscheidend für die Bestimmung der Anfälligkeit für hepatische Erkrankungen und Metastasen zu sein.

Selektive Ernte von Marginating-Leber-Leukozyten

Dieses Manuskript beschreibt die Herstellung von mikrogewebetechnischen neuronalen Netzen: dreidimensionale mikrometergroße Konstrukte, die aus lang ausgerichteten axonalen Traktaten bestehen, die aggregierte neuronale Populationen umfassen, die in einem tubulären Hydrogel umhüllt sind. Diese lebenden Gerüste können als funktionelle Relais dienen, um neuronale Schaltkreise zu rekonstruieren oder zu modulieren oder als biofidelische Testbetten, die grau-weiße Materie Neuroanatomie nachahmen.

Anatomisch inspirierte dreidimensionale Mikro-Gewebe-konstruierte Neuronale Netze für Nervensystem-Rekonstruktion, Modulation und Modellierung

Wir präsentieren die Entwicklung des selbst-zusammengebauten, dreidimensionale Bündel longitudinal ausgerichteten astrocytic Somata und Prozesse innerhalb ein neuartiges Biomaterial-Ummantelung. Diese "lebende Gerüste", präsentiert Mikron-Skala Durchmesser noch Zentimeter in der Länge, Verlängerung dienen als Testumgebungen zu Entwicklungsstörungen Mechanismen zu studieren oder zu erleichtern Neuroregeneration Regie neuronalen Migration und/oder axonalen entwickelt Pathfinding.

Dreidimensionale Gewebezüchtungen ausgerichtet Astrozyten Netzwerke Nervensystem Regeneration zu rekapitulieren Entwicklungsmechanismen

Dieses Protokoll beschreibt eine kosteneffiziente Methode zur Beschleunigung der Plasmid-DNA-Extraktion. Durch die Verwendung von maßgeschneiderten 3D-gedruckten Racks, die mit Standardrotoren mit Schaufelplatten kompatibel sind, können Forscher bis zu 48 Rotationssäulen mit Kappen oder bis zu 116 Rotationssäulen ohne Kappen gleichzeitig verarbeiten, was die Handhabungszeit im Vergleich zu manuellen Mikrozentrifugenmethoden deutlich verkürzt.

Mitteldurchsatz-Säulen-DNA-Extraktion mit 24-Well-Racks

Lernen Sie eine Methode zur Gewinnung von autologem Vollhautgewebe mit minimaler Narbenbildung am Spenderort. Dieses Protokoll ermöglicht effiziente Hochdurchsatzgewinnung für Hautregenerationsforschung und Gewebetechnik.

Vorrichtung zur Ernte Gewebe Microcolumns

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