Name: Isolation und Decellularization eine ganze Schweine Pankreas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Lernen Sie die Präparation und Dezellularisierung eines intakten Schweinepankreas mittels Detergenz-Perfusion bei kalten Temperaturen. Diese Methode ermöglicht die Gewinnung eines vollständigen Organs für Gewebeengineering-Anwendungen.

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Diese Studie wurde finanziert durch einen Zuschuss von der schwedischen Regierung LUA ALF an S.S.H.

Die Zerlegung von Schweinen Bauchspeicheldrüse und das Decellularization-Verfahren, die hier vorgestellten folgen die ethischen Richtlinien von der Universität Göteborg.
1. Vorbereitung des Decellularization Aufbaus
<ol><li>Mit 3 x 5 mm Silikonschläuche, Waschmittel Einlass-Container an der Peristalic-Pumpe in Reihe anschließen und dann an der Bauchspeicheldrüse in der Orgel über die Degasser Kammer (siehe Abbildung 1). Schließen Sie einen männlichen Luer an das freie Ende des Schlauches in Orgel Kammer.</li>
	<li>Verwenden eine andere 3 x 5 mm Silikonschlauch, die Orgel Kammer an der Waschmittel Outlet Container über die peristaltischen Pumpe PERFUNDIERTEN Waschmittel sammeln anschließen.</li>
	<li>Eine unbeschriftete 2-ml-Pipette an den freien Enden der Röhren in Waschmittel Einlass Container und Reinigungsmittel Outlet Cointainer anschließen.</li>
	<li>Halten Sie das ganze Set-up bei 4 ° C.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig1v2.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Abbildung 1: Vorbereitung des Aufbaus Perfusion. Mit einer 3 x 5 mm Silikonschlauch, wie in das Set-up gezeigt, in Reihe Anschließen des Waschmittel Einlass-Containers der peristaltischen Pumpe, die Degasser und der Orgel-Kammer. Die schwarzen Pfeile zeigen die Flussrichtung von Waschmittel Einlass Container Orgel Kammer. Verwenden Sie für das Waschmittel Outlet eine andere 3 x 5 mm Silikonschlauch und Waschmittel Outlet-Container der Orgel Kammer über die peristaltischen Pumpe an. Die roten Pfeile zeigen die Flussrichtung von Orgel Kammer Waschmittel Outlet-Container. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
2. Vorbereitung des Decellularization Lösungen
<ol><li>Lösung 1 (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung [PBS]): 1 Liter Reinstwasser 8 g Natriumchlorid (137 mM), 0,2 g Kaliumchlorid (2,7 mM) und 1,44 g (10 mM) Natriumphosphat 0,24 g (1,8 mM) Kalium Phosphat hinzu und rühren, bis aufgelöst. Anpassen des pH-Werts 7,4 mit Salzsäure (HCl). Insgesamt ist 3,2 L dieser Lösung erforderlich.</li>
	<li>Lösung 2 (PBS + Heparin): bis 1 L Lösung 1, 3,4 mL Heparin (17 Internationale Einheiten [ie] /mL) zugeben. Bereiten Sie diese Lösung frisch zu und halten Sie ihn auf Eis, bis es kalt wird. Insgesamt ist 1,2 L dieser Lösung erforderlich.</li>
	<li>Lösung 3 (Reinstwasser, Natriumazid + binatrium Ethylenediaminetetraacetic Säure [EDTA]): bis 1 L von Reinstwasser, fügen Sie 1,86 g EDTA (5 mM) und 200 mg von Natriumazid (0,02 %). Rühren Sie, bis die Salze gelöst sind. Kühlen Sie die Lösung auf 4 ° C vor dem Gebrauch. Insgesamt ist 22 L dieser Lösung erforderlich.</li>
	<li>Lösung 4 (PBS + Natriumazid + EDTA): bis 1 L Lösung 1, fügen Sie 200 mg (0,02 %) Natriumazid und 1,86 g EDTA (5 mM). Rühren Sie, bis die Salze gelöst sind. Kühlen Sie die Lösung auf 4 ° C vor dem Gebrauch. Insgesamt ist 1 L dieser Lösung erforderlich.</li>
	<li>Lösung 5 (Reinstwasser + Natriumazid): bis 1 L von Reinstwasser, fügen Sie 200 mg von Natriumazid (0,02 %). Rühren Sie, bis die Salze gelöst sind. Kühlen Sie die Lösung auf 4 ° C vor dem Gebrauch. Insgesamt ist 260 L dieser Lösung erforderlich. Anmerkung: EDTA bildet einen Niederschlag mit der DEZA und Lösung 5 ausgeschlossen wurde, da es zum unmittelbaren waschen vor und nach der DEZA-Behandlung verwendet werden.</li>
	<li>Lösung 6 (DEZA + Triton x-100): 940 mL Reinstwasser, fügen Sie 40 g (4 % hinzu) DEZA, 60 mL (6 %) Triton x-100, 200 mg (0,02 %) Natriumazid und 69,6 mg (0,4 mM) Phenylmethylsulfonyl Fluorid (PMSF). Rühren Sie, bis aufgelöst. Kühlen Sie die Lösung auf 4 ° C vor dem Gebrauch. Fügen Sie PMSF vor Gebrauch. Insgesamt ist 9,6 L dieser Lösung erforderlich.</li>
	<li>Lösung 7 (DNase): Fügen Sie 10.000 Kunitz Einheiten der DNase-ich in 250 mL (40 Kunitz Einheiten/mL) Dulbecco PBS mit CaCl2 und MgCl2. Frisch zubereiten und sofort nutzen. Wärmen Sie die Lösung auf 37 ° C vor dem Gebrauch.</li>
	<li>Lösung 8 (PBS + Natrium Bleiazid): bis 1 L Lösung 1, fügen Sie 200 mg von Natriumazid (0,02 %). Rühren Sie, bis die Salze gelöst sind. Kühlen Sie die Lösung auf 4 ° C vor dem Gebrauch. Insgesamt ist 1 L dieser Lösung erforderlich.</li>
</ol>(3) Dissektion des porcinen Pankreas
Hinweis: In dieser Studie wurden Schweine Bauchspeicheldrüsen von seziert eingeschläfert, weibliche Schweine heparinisierten (400 IE/kg) mit einem Gewicht von 45 kg von einem Bauernhof.
<ol><li>Platzieren Sie das Schwein auf dem Seziertisch in der Rückenlage.</li>
	<li>Machen Sie einen Mittellinie Schnitt aus dem xiphoidal-Prozess mit dem Schamknochen (ca. 40 cm) mit einem Skalpell, Freilegung aller Bauchorgane.</li>
	<li>Suchen Sie die Milz, Zwölffingerdarm, und Verbindung Lappen.</li>
	<li>Suchen Sie das Niveau der großen Zwölffingerdarm Papille und verbinden Sie den Zwölffingerdarm mündlich von dieser Seite mit zwei separaten Nähte.</li>
	<li>Verbinden der minderwertigen Speiseröhre mit zwei getrennten Nähten und schneiden zwischen den Ligaturen mit einer Schere den Magen herausnehmen.</li>
	<li>Trennen Sie das Bindegewebe aus dem Dickdarm, Dünndarm zu erreichen.</li>
	<li>Trennen Sie das Bindegewebe des Dickdarms, die der Milz Lappen der Bauchspeicheldrüse misst.</li>
	<li>Entfernen Sie den Doppelpunkt aus dem Dünndarm nach Ligation der Arterien.</li>
	<li>Die minderwertigen mesenterialen Vene und der minderwertigen mesenterialen Arterie Baum finden und verbinden mit einer Naht, wo sie kaudal des Pankreas erscheinen.</li>
	<li>Verbinden der Milz Arterie und Vene zusammen mit einer Naht, in der Nähe der Milz, in den Hilum und distal Schneiden mit der Schere, die Milz zu entfernen.</li>
	<li>Folgen Sie den Zwölffingerdarm, bis der Zwölffingerdarm und Verbindung Lappen gelöscht werden und den Zwölffingerdarm am Ende mit zwei separaten Nähte verbinden.</li>
	<li>Sezieren Sie die Pfortader zu, verbinden Sie es mit einer Naht zu verhindern Lecks Blut aus der Leber und proximal auf Ligatur geschnitten. Die Pfortader dient als Ventil während der Decellularization.</li>
	<li>Sezieren Sie und verbinden Sie den Gallengang und hepatischen Arterie mit zwei Nähten. Nach distal auf Nähte geschnitten.</li>
	<li>Finden Sie die Aorta unter die renale Vene zu und in kranialer Richtung von Muskel- und Bindegewebe zu sezieren Sie, bis es die Bauchspeicheldrüsen Bereich erreicht.</li>
	<li>Die Bauchspeicheldrüse vorsichtig umdrehen und sezieren der Aorta, wobei die SMA und der CT intakt, und die Aorta CT überlegen und minderwertig zu SMA mit einer Schere schneiden.</li>
	<li>Schneiden Sie die restlichen umgebende Gewebe mit einer Schere und herausnehmen Sie die Bauchspeicheldrüse.</li>
	<li>Mit einer 50-mL-Spritze mit 4-mm-arteriotomie Kanüle verbunden, die Orgel durch die Aorta mit Lösung 2 Spülen, bis es das gesamte Organ perfuses oder das gesamte Organ kalt wird.</li>
</ol>4. Vorbereitung der porcinen Bauchspeicheldrüse Decellularization
<ol><li>Halten Sie die Bauchspeicheldrüse bei 4 ° C oder auf dem Eis während des Prozesses.</li>
	<li>Schneiden Sie die Fäden mit einer Schere Zwölffingerdarm, Reinigen von Lebensmitteln durch Spülen 50-150 mL Reinstwasser mit einer 25-mL-Pipette, und verbinden Sie es wieder mit Nähten.</li>
	<li>Verbinden Sie ein Ende der Aorta und alle Niederlassungen neben der SMA und CT mit Fäden auslaufen zu verhindern.</li>
	<li>Legen Sie vom anderen Ende der Aorta eine arteriotomie 4-mm-Kanüle und verbinden Sie es mit Nähten.</li>
	<li>Durchspülen der Bauchspeicheldrüse mit Lösung 3 für 1 h bei 20 mL/min mit Decellularization Aufbau. Hinweis: Vorausfüllen Sie die Schläuche der Pumpe mit Lösung 3 so, dass keine Luftblasen die Bauchspeicheldrüse eingeben. Suchen Sie nach Undichtigkeiten von allen Seiten der Orgel und verbinden Sie alle offenen Kreislauf Zweige mit Nahtmaterial, mit Ausnahme der Pfortader.</li>
	<li>Einfrieren der Bauchspeicheldrüse bei-20 ° C in Lösung 4 bis zum Beginn der Decellularization.</li>
</ol>5. Decellularization der Schweine Bauchspeicheldrüse
<ol><li>Auftauen der Bauchspeicheldrüse bei 4 ° C.</li>
	<li>Führen Sie der peristaltischen Pumpe in den Decellularization Aufbau mit Lösung 3 bei 20 mL/min, bis keine Luftblasen in der Waschmittel Schlauch zu sehen sind.</li>
	<li>Die Bauchspeicheldrüse Decellularization Container und anschließen Sie die Waschmittel Schlauch der Aorta der Bauchspeicheldrüse. Waschen Sie die Orgel von Perfusion mit Lösung 3 Übernachtung im 20 mL/min bei 4 ° C.</li>
	<li>Gießen Sie die Lösung in der Orgel-Kammer gelassen.</li>
	<li>Lösung 3 mit Lösung 5 ersetzen und Durchspülen der Bauchspeicheldrüse für 30 min bei 20 mL/min bei 4 ° C. Gießen Sie die Lösung in der Orgel-Kammer.</li>
	<li>Lösung 6 hinzufügen und Durchspülen der Bauchspeicheldrüse für 8 h bei 20 mL/min bei 4 ° C. Gießen Sie die Lösung in der Orgel-Kammer.</li>
	<li>Waschen Sie die Orgel von Perfusion mit Lösung 5 96 h bei 20 mL/min bei 4 ° C. Gießen Sie die Lösung in der Orgel-Kammer.</li>
	<li>Vorbereiten der Bauchspeicheldrüsenkrebs DNase-Behandlung durch Rezirkulation 500 mL Dulbeccos PBS mit CaCl2 und MgCl2 für 30 min bei 37 ° C. Gießen Sie die Lösung in der Orgel-Kammer.</li>
	<li>250 mL Lösung 7 hinzugeben und Durchspülen der Bauchspeicheldrüse für 4 h bei 20 mL/min bei 37 ° C. Gießen Sie die Lösung in der Orgel-Kammer.</li>
	<li>Waschen Sie die Orgel von Perfusion mit Lösung 5 120 h bei 20 mL/min bei 4 ° C.</li>
	<li>Die Orgel in Lösung 8 bei 4 ° C für kurze Zeiträume oder bei-20 ° C über einen längeren Zeitraum aufbewahren.</li>
</ol>6. Überprüfung der Decellularization
<ol><li>Mit Schere, schneiden Sie 3 - 10 mm Biopsien aus allen Lappen der Bauchspeicheldrüse und befestigen Sie sie in Formaldehyd für 48 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen Sie die Stücke in Reinstwasser für 15 min in einem Gewebe-Prozessor nach Standardprotokollen zu verarbeiten Sie und in Paraffin einbetten.</li>
	<li>Schneiden Sie 5 µm Abschnitte mit Mikrotom und Färben sie von Meyers Hämatoxylin und 0,2 % alkoholischer Eosin (HE) nach standard-Protokolle.</li>
	<li>Zeigen Sie die Folien unter einem Lichtmikroskop, für den Verlust der Kerne zu überprüfen. Hinweis: Eine Stück von einem frischen Gewebe in gleicher Weise verarbeitet als ein Steuerelement lässt sich um auf das Vorhandensein von Kernen zu überprüfen.</li>
</ol>

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</ol>

S.S.H. hält Anteile an Verigraft, ein Unternehmen, das die Blutgefäße Gewebe-Engineering-Technologie lizenziert hat. Die anderen Autoren haben nichts preisgeben.

Das vorgeschlagene Protokoll mit Durchblutung der DEZA und Triton x-100 bei 4 ° C, werden ganze Schweine Pankreas erfolgreich decellularize. Die Herausforderung bei dieser Technik ist die Zerlegung der intakten Bauchspeicheldrüse, enthält die drei Lappen ohne Beschädigung das Parenchym und seiner liefernden Schiffe sowie die Unterbindung der anderen vaskulären Zweige der Probe um die Orgel durchspülen ohne Leckage. Porcines Bauchspeicheldrüse hat eine unterschiedliche Anatomie im Vergleich zu der menschlichen Bauchspeicheldrüse. Es besteht aus drei Lappen und bleibt in engem Kontakt mit den Dünndarm durch teilweise um ihn herum. Wir seziert den Zwölffingerdarm zusammen mit der Bauchspeicheldrüse, wie mehrere kleiner Blutgefäße aus der Bauchspeicheldrüse von den Darm verbinden. Während des Studiums Optimierung hat stumpfe schneiden dieser Blutgefässe auslaufen und eine unvollständige Perfusion Lösungen gezeigt.
Da die Aorta mit der Bauchspeicheldrüse durch die Zöliakie und überlegenen mesenterialen Arterien verbunden ist, haben wir die Aorta als einer Einbuchtung, die Perfusion einfach zu halten, nur mit Hilfe einer Kanüle und daher ein Inlet. In unserer Erfahrung Unterbindung der Aorta oberhalb der CT und unterhalb der SMA sinkt der Präparation und verringert das Risiko der Beschädigung einer der beiden Schiffe. Neben einer heparinisierten Schwein bemerkten wir auch, dass eine Perfusion der kalten Heparin über die Aorta unmittelbar nach der Dissektion hilft bei der Durchblutung von Lösungen für den gesamten Orgel zu erreichen. Wir spekulieren, dass in diesem Fall durch die Verhinderung der Bildung von Blutgerinnseln in den Blutgefäßen. Die anfängliche Perfusion der Bauchspeicheldrüse mit Reinstwasser nach Dissektion wird Erythrozyten lysiert und die Blut-Reste in der Orgel, und verhindert die Bildung von Blutgerinnseln zu entfernen. Diese Zeit kann auch genutzt werden finden unligated kleine Äste von Venen und Arterien, wie Blutfluss über der Hintergrundebene leicht bemerkt werden kann.
Wir wählten das ganze Decellularization Verfahren bei kalten Temperaturen (4 ° C) zu halten, weil dadurch die Wirkung der exokrinen Enzyme behindert wird, die von den exokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse auslösen. Die exokrine Enzyme, wenn nicht gehemmt wird, können eine schädliche Wirkung auf die Zellen und das ECM verursachen, da sie Zellmembranen und Proteine12 verdauen können. Einfrieren und Auftauen effektiv die Zellen platzen können, enthalten wir einen Frost/Tau-Schritt zunächst noch bevor die Perfusion der Waschmittel4,13. Die erste Wäsche nach dem Auftauen werden die Reste der Zelle platzt entfernen. Die Waschmittel Behandlung verwendeten wir ist eine Mischung von DEZA und Triton x-100 bei ungewöhnlich hohen Konzentrationen und mit einer hohen Durchblutung Geschwindigkeit. Wir entschieden uns für diesen Ansatz zu erreichen schneller Decellularization durch Entfernen der exokrinen Zellen, die das ECM zu beschädigen. Wir spekulieren, dass eine harte und schnelle Protokoll für Bauchspeicheldrüse Decellularization vorteilhaft ist, da weniger Zeit für Pankreas-Enzyme zur Interaktion mit der ECM, somit Erhaltung gute ECM-Komponenten zur Verfügung stehen. Um die ECM-Komponenten zu erhalten, haben wir auch Serin-Protease-Hemmer (PMSF) Waschmittel Lösungen, wie das die Aktivierung von Enzymen aus dem exokrinen Zellen14entlassen hemmt wird. Natriumazid wird alle Decellularization Lösungen hinzugefügt, da es wie eine bakteriostatische Agent wirkt, damit die Chance auf bakterielle Kontamination15Hemmung.
Die Bauchspeicheldrüse decellularized nach diesem Protokoll zeigte eine Erhaltung der ECM-Strukturen und die ECM Proteine Kollagen und Elastin. Jedoch wurde ein erheblicher Verlust von Glykosaminoglykanen decellularized Bauchspeicheldrüse bemerkt. Die Bauchspeicheldrüse decellularized auf diese Weise auch zeigte Versprechen für die Befestigung des fetalen Pankreas Stammzellen und der Ausdruck der exokrinen und endokrinen Marker in recellularized für 14 Tage12Stücke. Um eine Bauchspeicheldrüse intakt und funktionsfähig zu erzeugen, ist jedoch weitere Untersuchungen erforderlich, bei der Bewertung von richtigen Zelle Quellen, Zelltypen, Zelle seeding Strategien und Bioreaktor Kultur.

Diabetes Mellitus ist gekennzeichnet durch das Vorhandensein von erhöhte Konzentration von Glukose im Blut. Es wird als eine wichtige gesundheitspolitische Herausforderung in den meisten Ländern1erkannt. Hohe Konzentrationen von Glukose im Blut beeinflussen die Blutgefäße und Nervensystem, was zu Schäden an den Augen, das Herz und die Nieren und Extremität Ischämie. Traditionelle Methoden der Behandlung gehören Injektionen von exogenen Insulins, Drogen und Änderungen des Lebensstils. Abgesehen von einer Heilung für die Krankheit in einigen Fällen, nicht verfügbare Behandlungen das Insulin auf therapeutische Ebenen, wodurch Hyperglykämie zu pflegen. Obwohl die Transplantation von Inseln oder ganze Bauchspeicheldrüse Krankheit beseitigt, ist es nicht allgemein durch einen Mangel an geeigneten Spenderorganen und wegen der Risiken und Schwierigkeiten von Immunsuppression und Kapselung2getan.
Aktuelle Verbesserungen im Bereich des Tissue engineering und regenerativer Medizin besitzen die Fähigkeit zur Bereitstellung einer Lösung für diese Probleme. Mit der Technik des Decellularization das Zellmaterial von einem menschlichen oder tierischen Spender entfernt werden, während die Proteine wichtig extrazelluläre Matrix (ECM), Wachstumsfaktoren, und Signalmoleküle sind in das Gerüst erhalten. Solche Gerüste können möglicherweise ohne die Notwendigkeit einer Immunsuppression, die Orgel nach Recellularization mit dem des Empfängers nicht immunogen Stammzellen3,4Wiederherstellung verpflanzt werden. Tissue-engineering Organe aus allogene und xenogene Quellen können in klinische Transplantation verwendet werden, wie die großen extrazellulären matrixproteine unter Arten konserviert sind und nicht nach Transplantation5abgelehnt werden könnte.
Decellularization ist eine gut erforschte Methode, die die optimale Nutzung der physikalischen Kräfte, chemischen Reinigungsmitteln und Enzyme in einem physiologischen Rahmen, Zellen und Kernmaterial aus einem Gewebe oder Organ zu entfernen. Recellularization ist ein Verfahren der Aussaat Zellen wieder in die azellulären Orgel. Es ist eine intellektuell schwierige Verfahren erfordern eine große Anzahl von Zellen, eine optimale Zelle-säen-Strategie und ein bioreaktorsystem für die Kultur des Organs an physiologisch akzeptablen Bedingungen wie Temperatur, Druck und Gase6.
Die Bauchspeicheldrüse kann eine anspruchsvolle Gewebe für das Tissue Engineering wegen der exokrinen und endokrinen Kapazitäten gelten. Die exokrine Gewebe sondert verschiedene Verdauungsenzyme, während der endokrine Teil Hormone, einschließlich Insulin absondert. Die Decellularization der intakte Bauchspeicheldrüsen von Maus7,8, menschliche9und Schwein10 hat bereits berichtet worden, mit Hilfe von Enzymen (Trypsin, Deoxyribonuclease [DNase]) und nicht-ionische (Triton x-100) und Ionischen Detergentien ( Natrium Deoxycholate [DEZA] und Sodium Dodecyl Sulfat [SDB]). Jedoch nach den veröffentlichten Protokollen kämpfen wir mit einem erfolgreichen Dissektion und komplette Perfusion und Decellularization unter Beibehaltung einer ECM-Struktur. Wir vermuteten, dass die verwendeten Reinigungsmittel während der Decellularization Lyse der Zellen, verursachen dadurch Freisetzung von Verdauungsenzymen in der Orgel. Die freigesetzten Enzymen werden eine irreversible Schäden an das ECM-Gerüst und ineffizient für Decellularization und Recellularization zu machen. Eine Design der Methode, die effektiv Bauchspeicheldrüse decellularizes während die Aktion von Verdauungs-Enzymen hemmen kann das Problem lösen. Wir entschieden uns für die Strategie der Peloso Et Al., der Decellularization der Bauchspeicheldrüse bei kalten Temperaturen, obwohl sie nicht auf, warum Kälte verwendet9melden. Zur gleichen Zeit haben wir eine Dissektion Strategie mit Modifikationen von Taylor Et Al. durch die Wahl der Aorta als einer Perfusion Bucht über die Zöliakie Stamm (CT) und der überlegenen mesenterialen Arterie (SMA)11entwickelt.
In einem kürzlich erschienenen Artikel12zeigen wir eine Methode zur effektiven Isolierung und Decellularization von Schweinen Bauchspeicheldrüse unter Beibehaltung einiger ECM-Komponenten. In diesem Papier wir zeigen eine detaillierte Beschreibung wie man eine ganze Schweine Pankreas, Milz, Zwölffingerdarm enthält sezieren und Verbindung Lappen, und präsentieren eine schrittweise Protokoll für erfolgreiche Decellularization.

<table><tbody><tr><td>4mm DLP Arteriotomiekanüle</td><td>Medtronic</td><td>31104</td><td></td></tr><tr><td>2ml Unmarkierte Pipette</td><td>vWR</td><td>612-3720</td><td></td></tr><tr><td>Degaser</td><td>Biotech AB</td><td>0001-6484</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Worthington</td><td>LS0020007</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS mit CaCl2 und MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Dinatriumsalz-Dihydrat</td><td>AlfaAesar</td><td>A15161. OB</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Leo</td><td>387107</td><td></td></tr><tr><td>Luer Stecker mit 1/8" ID Barb</td><td>Oina</td><td>LM-2PP-QC</td><td>Für 3X5mm Silikonschlauch</td></tr><tr><td></td><td>Schlauchpumpe Oina</td><td>SP-1X4</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Roche</td><td>10837091001</td><td>Instabil in wässriger Lösung. Sollte vor der Perfusion frisch zugegeben werden.</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumhydrogenphosphat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>SDC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Silikonschlauch 3X5mm</td><td>VWR</td><td>2280706</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13423</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydrogenphosphat</td><td>Merck</td><td>71640-M</td><td></td></tr><tr><td>Nahtmaterial</td><td>V&ouml; mel</td><td>14817</td><td></td></tr><tr><td>Spritze 50mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>300137</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>AlfaAesar</td><td>A16046. Von</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation und decellularization eine ganze schweine pankreas

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Gewebe-Engineering der gesamten Bauchspeicheldrüse kann aktuelle Behandlungsmethoden für Diabetes Mellitus verbessern. Das Endziel ist Gewebe Ingenieur Pankreas von einer allogenen oder xenogene Quelle mit menschlichen Zellen. Eine Demonstration der Methoden für die effiziente Dissektion, Decellularization und Recellularization von Schweinen Bauchspeicheldrüse könnte Bereich profitieren. Ähnlich wie menschliche Bauchspeicheldrüsen porcinen Bauchspeicheldrüsen haben eine spezielle anatomische Anordnung mit drei Lappen (Milz, Zwölffingerdarm, und Verbindung) abgerundet durch den Zwölffingerdarm und Dünndarm. Der Zwölffingerdarm Lappen der Bauchspeicheldrüse verbindet sich mit den Zwölffingerdarm durch mehrere kleine Blutgefäße. Gewebe-Engineering der Bauchspeicheldrüse ist exokrine und endokrine naturgemäß kompliziert. In diesem Beitrag zeigen wir ein detailliertes Protokoll zu zerlegen die ganze Schweine Pankreas und decellularize es mit Reinigungsmitteln und sparen Sie dabei seine Struktur und einige Komponenten der extrazellulären Matrix. Um komplette Perfusion zu erreichen, wird die Aorta als Einlauf und die Pfortader als Outlet gewählt. Andere Blutgefäße (leberarterie, Milz Vene, Milz Arterie, mesenterialen Arterie und Vene Baum) und der Gallengang sind ligiert. Um die Bildung von Thromben zu verhindern, das Schwein ist heparinisierten und unmittelbar nach Dissektion, die Orgel ist mit kalten Heparin gespült. Um die Wirkung der exokrinen Enzyme hemmen, ist die Bauchspeicheldrüse Decellularization bei 4 ° c eingestellt. Die Decellularization erfolgt durch Perfusion der Triton x-100, Natrium Deoxycholate und Deoxyribonuclease, mit einer intermittierenden und letzte umfangreiche waschen. Mit einem erfolgreichen Decellularization die Bauchspeicheldrüse erscheint weiß, und eine histologische Auswertung mit Hämatoxylin und Eosin zeigt keine Kerne mit einer erhaltenen extrazelluläre Matrix-Struktur. Somit kann die vorgeschlagene Methode erfolgreich zu sezieren und decellularize ganze Schweine Pankreas verwendet werden.

Repräsentative porcinen Bauchspeicheldrüse Dissektion Bilder, die können helfen beim Auffinden und sezieren die minderwertigere mesenterialen Arterie und Vene, Baum, der Pfortader, der leberarterie, der Gallengang und der Aorta, die Verzweigung in CT und SMA, entnehmen Sie bitte Abbildung 2A, 2 bund 2 C (gelbe Pfeile), beziehungsweise. Abbildung 3A zeigt die grobe Morphologie des normalen Bauchspeicheldrüse, hellrosa und enthält Milz, Verbindungs- und Zwölffingerdarm Lappen. Nach Decellularization die rosa Farbe verloren und die decellularized Bauchspeicheldrüse sieht blass weiß in der Farbe. Die grobe Morphologie Abbildung Milz, ist Verbindungs- und Zwölffingerdarm Lappen der Bauchspeiseldrüse decellularized in Abbildung 3 bgezeigt. Abbildung 3 zeigt die Anwesenheit von vielen blauen Kernen in einem normalen Bauchspeicheldrüse durch Färbung mit er. In einem decellularized Bauchspeicheldrüse, der HE-Färbung zeigte einen Verlust von Kernen, da keine blaue Kerne zu sehen sind (Abbildung 3D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig2v2.jpg"> Abbildung 2: Bilder von einem porcinen Bauchspeicheldrüse Dissektion. (A) Position des minderwertigen mesenterialen Arterie und Vene Baum (gelber Pfeil). (B) Unterbindung der Pfortader, der leberarterie und der Gallengang (gelber Pfeil). (C) Aorta Verzweigung in der Zöliakie Stamm und der überlegenen mesenterialen Arterie (gelber Pfeil). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58302/58302fig3.jpg"> Abbildung 3: Brutto-Morphologie und Färbung der normalen und decellularized Bauchspeicheldrüsen. (A) Brutto Morphologie von einem normalen Pankreas. (B) Brutto Morphologie der Bauchspeiseldrüse decellularized. (C) er Färbung zeigt die Anwesenheit von blauen Kernen in einem normalen Pankreas. (D) er Färbung zeigt das Fehlen der blaue Kerne in einer decellularized Bauchspeicheldrüse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58302/58302fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Gewebe-Engineering der gesamten Bauchspeicheldrüse ist eine Herausforderung, weil die exokrinen und endokrine Funktionen. Wir zeigen eine Methode für die Zerlegung einer intakten Schweinen der Bauchspeicheldrüse und der Prozess der erfolgreichen Decellularization von Perfusion von Waschmitteln Triton x-100, Natrium Deoxycholate und Deoxyribonuclease.

Isolation und Decellularization eine ganze Schweine Pankreas

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...

Diese Methode kann für die Zerlegung von Schweinepankreas verwendet werden, die Verbindung, Zwölffingerdarm- und Milzlappen enthalten, und schließlich zur Dezellularisierung durch die Perfusion von Reinigungsmitteln bei kalten Temperaturen. Obwohl diese Methode der Dezellularisierung Einblicke in die Schweinebauchspeicheldrüse bietet, kann sie auch auf Pankreata von anderen großen Tieren angewendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie das intakte Abrufen eines komplizierten Organs, wie der Bauchspeicheldrüse, für weitere Gewebetechnik-Anwendungen erleichtert.Im Allgemeinen, Personen neu zu dieser Methode, werden sie kämpfen, weil Die Sezieren der intakten Bauchspeicheldrüse während der Identifizierung und Ligaung aller umliegenden Blutgefäße erfordert eine Menge Übung zu meistern. Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, verbinden Sie den Waschmittelbehälter mit einem drei mal fünf Millimeter großen Silikonrohr mit der Peristaltikpumpe und ein zweites drei mal fünf Millimeter großes Silikonrohr, um die peristaltische Pumpe über den Entgaser mit der Orgelkammer zu verbinden. Verbinden Sie einen männlichen Luer mit dem freien Ende des zweiten Rohres und verwenden Sie ein drittes drei mal fünf Millimeter großes Silikonrohr, um die Organkammer über die Peristaltikpumpe mit dem Waschmittelsammelbehälter zu verbinden.Schließlich eine zwei Millimeter unbeschriftete Pipette an die freien Enden der Rohre im Waschmittelbehälter und den Waschmittelsammelbehälter anschließen. Platzieren Sie dann die Dezellularisierungseinrichtung bei vier Grad Celsius. Um die Bauchspeicheldrüse zu ernten, legen Sie ein heparinisiertes, 45-Kilogramm-weibliches Schwein auf einen Dissektionstisch in der Supine-Position, und verwenden Sie ein Skalpell, um einen 40-Zentimeter-Mittellinienschnitt vom xiphoiden Prozess bis zum Schambein zu machen, um die Bauchorgane freizulegen.Nachdem Sie die Milz-, Duodenal- und Verbindungslappen identifiziert haben, suchen Sie die hauptbeuge Zwölffingerpapille und verwenden Sie zwei einzelne Nähte, um das Zwölffingerdarm von der Website oral zu ligieren. Ligate die unterlegene Speiseröhre mit zusätzlichen Nähten, und schneiden zwischen den Ligaturen mit der Schere, um die Entfernung des Magens zu erleichtern. Trennen Sie das Bindegewebe vom Dickdarm, um den Dünndarm zu erreichen, und trennen Sie das Bindegewebe des Dickdarms, der sich an den Milzlappen der Bauchspeicheldrüse anheftet.Der Dünndarm wird durch Bindegewebe am Milzlappen an der Bauchspeicheldrüse befestigt, umgibt aber auch die Bauchspeicheldrüse. Sie müssen sorgfältig dem Darmweg folgen, um das Bindegewebe zwischen Darm und Bauchspeicheldrüse zu entwirren und zu trennen. Nach dem Liganderdern der Arterien, entfernen Sie den Dickdarm aus dem Dünndarm.Identifizieren Sie die minderwertige mesenterische Vene, den minderwertigen mesenterischen Arterienbaum, und ligaten Sie die Gefäße mit einer Naht kaudal an die Bauchspeicheldrüse und schneiden Sie mit einer Schere. Ligate die Milzarterie und Vene zusammen in der Hilum, in der Nähe der Milz, und schneiden distally mit der Schere, um die Milz zu entfernen. Folgen Sie dem Zwölffingerdarm, bis das Duodenal und die Verbindungslappen gelöscht sind, und ligaten Sie das Zwölffingerdarm am Ende mit zwei separaten Nähten.Der Teil des Zwölffingerdarms, der in engem Kontakt mit der Verbindung und dendenalen Lappen ist, wird mit der Bauchspeicheldrüse entfernt, da die Ligation aller kleinen Blutgefäße zwischen den beiden Organen zu schwierig ist. Nach der Zersebung der Portalvene, ligate das Gefäß mit einer Naht, um blutaustritt aus der Leber zu verhindern, und sezieren und ligate die Gallengang und Leberarterie mit zwei Nähten. Dann schneiden Portal Vene, Leberarterie, und Gallengang mit Schere.Suchen Sie die Aorta unter der Nierenvene und sezieren Sie die Aorta in Schädelrichtung vom Muskel und Bindegewebe, bis das Gefäß die Bauchspeicheldrüse erreicht. Nun, kippen Sie sanft die Bauchspeicheldrüse um, und sezieren Sie die Aorta, wobei die überlegene mesenterische Arterie und der Zöliakiestamm intakt bleiben. Schneiden Sie die Aorta Schädel auf den ZöliakieStamm, und stumpf sezieren Sie das verbleibende umgebende Gewebe, um die Ernte der Bauchspeicheldrüse zu ermöglichen.Verwenden Sie dann eine 50-Milliliter-Spritze, die mit einer Vier-Millimeter-Arteriotomiekanüle verbunden ist, um das Organ mit Lösung zwei durch die Aorta zu spülen, bis das gesamte Organ durchgepeitscht ist oder bis das ganze Organ kalt wird. Legen Sie die Lösung zwei durchfundierte Bauchspeicheldrüse auf eine Metallschale auf Eis, mit Aorta nach oben, und verwenden Sie eine Schere, um die Nähte aus dem Zwölffingerdarm zu schneiden. Verwenden Sie eine 25-Milliliter-Pipette, um das Zwölffingerdarm mit 50 bis 150 MilliliterRinpurem zu spülen und das Gewebe mit frischen Nähten umzuligieren.Ligate ein Ende der Aorta und alle Zweige, mit Ausnahme der überlegenen mesenterischen Arterie und des Zöliakie-Stamms, um Leckagen zu verhindern, und legen Sie eine Vier-Millimeter-Arteriotomie-Kanüle in das andere Ende der Aorta. Als nächstes legen Sie die Bauchspeicheldrüse in die Orgelkammer und verbinden Sie die Kanüle in der Bauchspeicheldrüse mit einem männlichen Luer. Dann durchdringen Sie die Bauchspeicheldrüse mit Lösung drei für eine Stunde bei 20 Milliliter pro Minute, und frieren Sie die doppelt durchsetzte Bauchspeicheldrüse bei minus 20 Grad Celsius in Lösung vier bis zum Beginn der Dezellularisierung ein.Am Tag des Beginns der Dezellularisierung, tauen Sie die Bauchspeicheldrüse bei vier Grad Celsius, und legen Sie die aufgetaute Bauchspeicheldrüse in der Dezellularisierung Organkammer. Verbinden Sie das Waschmittel-Einlassrohr mit der Aorta der Bauchspeicheldrüse und waschen Sie die Bauchspeicheldrüse mit Lösung drei mit 20 Millilitern pro Minute über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Morgen, dekantieren Sie jede Lösung in der Orgelkammer, und durchdringen Sie die Bauchspeicheldrüse für 30 Minuten bei 20 Milliliter pro Minute in Lösung fünf bei vier Grad Celsius.Am Ende der Lösung fünf Perfusion, durchdringen die Bauchspeicheldrüse für acht Stunden bei 20 Milliliter pro Minute in Lösung sechs und vier Grad Celsius, gefolgt von einer 96-Stunden-Waschanlage in frischer Lösung fünf bei 20 Milliliter pro Minute und vier Grad Celsius. Ersetzen Sie die Wäsche durch 500 Milliliter DPBS, ergänzt durch Kalzium und Magnesium für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius, gefolgt von einer Perfusion mit 250 Milliliter Lösung sieben für vier Stunden bei 20 Millilitern pro Minute und 37 Grad Celsius. Dann waschen Sie das Organ für weitere 120 Stunden mit frischer Lösung fünf bei 20 Milliliter pro Minute und vier Grad Celsius, und lagern Sie die Orgel in Lösung acht.Hier kann die grobe Morphologie einer normalen Bauchspeicheldrüse beobachtet werden, die hellrosa erscheint und Milz-, Verbindungs- und Zwölffingerdarmlappen enthält. Nach der Dezellularisierung geht die rosa Farbe verloren, und die verarbeitete Bauchspeicheldrüse erscheint blassweiß. In einer normalen Bauchspeicheldrüse sind viele blaue Kerne durch H- und E-Färbung sichtbar, während in einer dezellularisierten Bauchspeicheldrüse die Kerne nicht mehr visualisiert werden können, was ihren Verlust bestätigt.Die isolierte intakte Schweinebauchspeicheldrüse, nach diesem Verfahren, wird es eine vollständige Perfusion und erfolgreiche Dezellularisierung ermöglichen, während die Struktur erhalten und auch einige extrazelluläre Matrixproteine erhalten werden können. Die dezellularisierte Bauchspeicheldrüse kann zur Entwicklung von Ganzorganrezellularisierungsstrategien in Bioreaktorsystemen mit relevanten Zelltypen eingesetzt werden. Nach rezellulärisierender Stammzellen kann die gewebegefertigte Bauchspeicheldrüse für klinische Anwendungen und Arzneimitteltests verwendet werden.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Triton X-100 und SDC extrem gefährlich sein kann und dass Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen von Handschuhen und die Vorbereitung der Lösungen unter Rauchhaube, immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.

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Das Erreichen hoher Qualität und ausreichender Menge menschlicher Inselchen ist einer der führenden Voraussetzungen für eine erfolgreiche Inseltransplantation. In diesem Video, beschreiben wir Schritt für Schritt die Verfahren für die menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation (Teil I: Verdauung und Sammlung von Pankreasgewebe) mit einem modifizierten automatisierte Methode.

Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part I: Verdauung und Sammlung von Pankreasgewebe

Dieses Video beschreibt die Technik, die zur Isolierung von Azinuszellen der Bauchspeicheldrüse verwendet wird - exokrine Zellen -, die eine Vielzahl von Verdauungsenzymen enthalten. Primäre Azinuszellen sind nützlich in der ex vivo-Studie der Azinus-zu-duktalen Metaplasie (ADM) - einem frühen Ereignis bei der Entwicklung von Bauchspeicheldrüsenkrebs.

Primäre Isolierung von Azinuszellen: Eine Methode zur Isolierung von Azinuszellen aus der Bauchspeicheldrüse der Maus

Pankreasinseln, auch Langerhans-Inseln genannt, sind eine Ansammlung von endokrinen Zellen, die Hormone für die Glukoseregulierung und andere wichtige biologische Funktionen produzieren. Dieses Protokoll erklärt eine Methode zur Isolierung von Pankreasinseln, indem zuerst Kollagenase über Ampulla von Vater perfundiert wird, um das exokrine Pankreasgewebe zu verdauen, und eine vereinfachte Dichtegradientenzentrifugation, um die Inselzellen von Mäusen zu reinigen.

Isolierung von Pankreasinseln durch Kollagenase-Perfusion: Eine enzymatische Methode zur Isolierung von Pankreas-Inselzellen

Die Untersuchung in vitro β-Zell-Funktion mit isolierten Maus-Langerhans-Inseln ist ein wichtiger Bestandteil in der Studie der Diabetes Pathophysiologie und Therapie. Während viele Downstream-Anwendungen zur Verfügung stehen, dieses Protokoll beschreibt speziell die Messung der intrazellulären zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP) als wesentlicher Parameter, der β-Zellfunktion.

Eine Methode zur Maus-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation und intrazellulären cAMP-Bestimmung

Dieses Inselisolierungsprotokoll beschrieb einen neuartigen Weg der Kollagenase-Injektion zur Verdauung des Exokringewebes und ein vereinfachtes Gradientenverfahren, um die Inseln von Mäusen zu reinigen. Es beinhaltet enzymatische Verdauung, Gradiententrennung/Reinigung und Islet-Handpicking. Eine erfolgreiche Isolierung kann 250–350 hochwertige und voll funktionsfähige Inselchen pro Maus ergeben.

Ein einfaches Hocheffizienzprotokoll für die Isolierung von Pankreas-Isleten von Mäusen

Dezelluläre extrazelluläre Matrix (dECM) kann geeignete mikroökologische Hinweise liefern, um die inhärenten Funktionen von Zielgeweben in einem konstruierten Konstrukt zu rekapitulieren. Dieser Artikel erläutert die Protokolle für die Dezellularisierung von Bauchspeicheldrüsengewebe, die Bewertung von DECM-Bioink aus Bauchspeicheldrüsengewebe und die Generierung von 3D-Pankreasgewebekonstrukten mit einer Bioprinting-Technik.

Pankreasgewebe-abgeleitete extrazelluläre Matrix Bioink für den Druck 3D-Zell-Laden Pankreasgewebe Konstrukte

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Diese Studie entwickelte eine vereinfachte Methode, um funktionelle primäre Inselchen und Acinarzellen effizient aus der Bauchspeicheldrüse der Maus zu extrahieren, was ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der interzellulären Kommunikation in der Pathogenese des akuten Pankreatitis-induzierten Diabetes bietet.

Eine einfache und schnelle Methode zur gleichzeitigen Isolierung von primären Inselchen und primären Pankreas-Acinarzellen von Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt eine standardisierte Methode zur chirurgischen Entnahme, enzymatischen Verdauung und Dichtegradientenreinigung von Lewis-Rattenpankreasinseln, die ertragreiche, hochreine Präparate für den direkten Einsatz bei Transplantationen oder in vitro-Studien ermöglicht.

Isolierung und Reinigung von Pankreasinseln bei Lewis-Ratten mittels enzymatischer Verdauung und Dichtegradiententrennung

Perfusion Dezellularisierung ist eine neuartige Technik, um ganze Leber Gerüste, dass die Orgel extrazellulären Matrix Zusammensetzung und Mikroarchitektur behält produzieren. Hierbei wird das Verfahren zur Herstellung von ganzen Organs Gerüste mit Perfusion Dezellularisierung und anschließende Wiederaufforstung mit Hepatozyten beschrieben. Funktionelle und transplantierbaren Leber Transplantate kann mit Hilfe dieser Technik werden.

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Isolation und Decellularization eine ganze Schweine Pankreas

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