Name: Quantifizierung der Intermembran Strecken mit seriellen Bild Dilatationen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Perinexus-Breite mit automatisierten Bilddilatationen und Pfadfindungsalgorithmen präzise messen. Diese Methode verbessert die räumliche Auflösung gegenüber manueller Segmentierung in der kardialen Strukturbiologie.

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Die Autoren möchte Kathy Lowe an der Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine für die Verarbeitung und Färbung TEM Proben danken. Finanzierung: National Institutes of Health R01-HL102298 National Institutes of Health F31-HL140873-01

Hinweis: Erforderlich sind ImageJ (oder ähnliche Bild bearbeiten Software), Software und Matlab R2015. Der Benutzer unter Umständen Kompatibilitätsprobleme mit anderen Versionen von Matlab.
1. Pre-Processing Bilder
<ol><li>Für jede Graustufenbild gewährleisten die maximale Intensitätswert bestimmten Pixels ist < 255. Dies geschieht in der Regel durch Subtraktion der Wert 1 aus dem Bild in das benutzerdefinierte Matlab-Programm "ImageSub.m", in zusätzliche Datei S1 enthalten.</li>
</ol>2. Gliederung der Perinexus
<ol><li>Skizzieren Sie die Perinexus in ImageJ oder einer anderen Bildverarbeitungs-Software.</li>
	<li>Sicherstellen Sie, dass der Umriss ein Pixel dick ist und auf den höchsten Intensitätswert in einem Bild (255 in ein Graustufenbild von 0 bis 255) festgelegt ist.</li>
	<li>Identifizieren Sie der GJ durch seine Pentalaminar Struktur11,12, und definieren Sie den Beginn der Perinexus als der Punkt, an dem die beiden gegenüberliegenden Zellmembran Bilayer divergieren, wie in Abbildung 1Agezeigt. BEGIN ~ 200 nm von der Kante des GJ, Rückverfolgbarkeit entlang der inneren Membran der ersten Zelle und zurück entlang der inneren Membran der zweiten Zelle. Lassen Sie in ImageJ den Stift um den Umriss automatisch zu schließen. Diese künstliche schließen wird später ausgeschnitten werden. Hinweis: Es ist entscheidend für die Perinexus mit großer Sorgfalt an so hoch skizzieren eine Vergrößerung wie möglich, da auch kleine MIS Anwendungen der Gliederung in mehrere Nanometern der Fehler bei der letzten Messung führen können.</li>
</ol>3. Einrichten der Algorithmus und Perinexus von Interesse auswählen
Hinweis: Der Pathfinding-Algorithmus erfordert Autogramm, Edge, Graph, Knoten und Pathfinding Funktionen9 im selben Verzeichnis wie die MembraneSepDist m-Datei sein. Alle Dateien finden in zusätzliche Datei S1.
<ol><li>Wählen Sie speichern Speicherorte für Daten und Zahlen. Diese sind derzeit hart codiert in der m-Datei. Hinweis: Die erste Zeile des Programms ist eine Funktion, um alle Variablen zu löschen, schließen Sie alle Fenster und deaktivieren Sie das Befehlsfenster. Speichern Sie alle gewünschten Variablen oder Zahlen vor dem Ausführen der m-Datei. Hinweis: Software-Screenshots sind in zusätzliche Datei S2 für alle hartcodierte Werte enthalten.</li>
	<li>Führen Sie das Programm "MembraneSepDist.m".</li>
	<li>Eingestellten Parameter. Hinweis: Eine GUI mit Standardparametern für gradient Schwelle, Skala, Region von Interesse und manueller Start öffnet sich. Die Standardwerte in der m-Datei geändert werden können, oder sie können für jedes einzelne Bild geändert werden.<ol>
<li>Räumliche Derivative gradient Schwelle. Hinweis: Höhere Werte führen zu mehr Punkte Mittellinie isoliert ausgewählt. Werte, die zu hoch oder zu niedrig (außerhalb einer Reihe von ca. 3,0-7,9) führen rechnerische Ineffizienz oder eine ungenaue Punktauswahl Mittellinie nachgeben ungenau Mittellinie Isolierung (siehe Abbildung 2A-C).</li>
		<li>Festlegen Sie Skala in Pixel/Skala Einheiten.</li>
		<li>Legen Sie die räumlichen unteren und oberen Grenzen für die Region von Interesse. Hinweis: Durch unser Labor Übereinkommen ist die definierte Region von Interesse zwischen 30 und 105 nm von der Kante des GJ2,3,10.</li>
		<li>Automatischer/manueller Start festgelegt. In den meisten Fällen erkennt der Algorithmus genau den Ausgangspunkt, wo die Lücke Kreuzung endet und Perinexus beginnt. Allerdings muss in einigen Fällen von unregelmäßig geformten Perinexi, der Benutzer den Startpunkt manuell identifizieren. Legen Sie diesen Wert auf 0 für Automatik, 1 für manuelle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wählen Sie das gewünschte Bild. Hinweis: Die Datei wählen Sie Ordner kann in der m-Datei geändert werden.</li>
	<li>Beschneiden Sie das Bild wählen Sie die Perinexus von Interesse.<ol>
<li>Wenn das Bild kommt, ändert der Cursor automatisch in ein Fadenkreuz. Beschneiden Sie das Bild durch ziehen einen Rahmen um die Perinexus von Interesse (siehe Abbildung 3). Der Crop-Box kann eingestellt werden, mit den Quadraten an den Ecken und Seiten machen es größer oder kleiner.</li>
		<li>Beim Zuschneiden, sorgen die "offene" Ende der Perinexus (am weitesten von der GJ, siehe Abbildung 3) wird abgeschnitten, so dass die Umrisse der beiden Membran den Rand des zugeschnittenen Bildes erreichen. Hinweis: Es wird empfohlen, das Bild im Vollbildmodus leichter zu sehen, die Perinexus von Interesse und entsprechend zuschneiden zu machen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wählen Sie die letzte Ernte per Doppelklick mit dem Cursor zwischen den gegenüberliegenden Kanten gemessen werden. Hinweis: Es ist wichtig, dass der Doppelklick innerhalb der Perinexus durchgeführt werden. Wenn das Programm nicht um eine Mittellinie zu identifizieren, starten Sie das Programm und stellen Sie sicher, dass der Klick innerhalb der Perinexus erfolgt.</li>
	<li>Beobachten der abschließenden Mittellinie nach allen Streckungen und Erosionen Pop-up für einen Endnutzer-Bewertung der Wirksamkeit des Programms. Hinweis: Ein Dialogfeld angezeigt wird auf dem Bildschirm angezeigt, während das Programm ausgeführt wird, um dem Benutzer darauf hin, dass Matlab kann nicht in der Lage, jede zusätzliche Befehle zu verarbeiten, bis das Programm beendet ist. Wie lange dieser Prozess dauert, hängt davon ab, (Bild) Arraygröße und Rechenleistung.</li>
	<li>Bei aktivierter manueller Startpunkt beobachten Sie das Bild der Mittellinie pop-up über das ursprüngliche anatomische Bild, zusammen mit einem Fadenkreuz Cursor (siehe Abbildung 2E). Wählen Sie einen Punkt außerhalb der Perinexus in der Nähe der gewünschten Startpunkt. Hinweis: Das Programm der Mittellinie Punkt am nächsten an das ausgewählte Pixel zu finden und verwenden, die als Startpunkt.</li>
	<li>Daten aufzeichnen. Hinweis: Wenn das Programm beendet ist, das Programm kehrt eine zugeordnete Mittellinie Grundstück von Perinexal Breite als Funktion des Abstandes von der Kante von der GJ. Darüber hinaus wird das Programm zurück die durchschnittliche Perinexal Breite bis zu 150 nm von der Kante der GJ sowie den Durchschnitt innerhalb der definierten Region von Interesse in der Matlab-Befehlszeile. W-p -Werte und Entfernungen von der GJ in der Variablen "WpList" gespeichert sind, oder der Benutzer kann manuell getrennt aufzeichnen.</li>
</ol>(4) Algorithmus zur Fehlerbehebung
<ol><li>Wenn die Mittellinie nicht richtig identifiziert (Abb. 2A), öffnen Sie die Figur "Gmag" und verwenden Sie den Index, um eine geeignete Gradienten Schwelle (Abbildung 2C) zu identifizieren.</li>
	<li>Wenn der Startpunkt nicht richtig erkannt wird, den Startpunkt manuell eingestellt (siehe Protokoll 3.8).</li>
</ol>

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<li>Veeraraghavan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+channels+in+the+Cx43+gap+junction+perinexus+may+constitute+a+cardiac+ephapse%3A+an+experimental+and+modeling+study%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sodium channels in the Cx43 gap junction perinexus may constitute a cardiac ephapse: an experimental and modeling study.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2015).</li>
<li>George, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+sodium+dependence+of+the+conduction+velocity-calcium+relationship%3A+evidence+of+ephaptic+self-attenuation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular sodium dependence of the conduction velocity-calcium relationship: evidence of ephaptic self-attenuation.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 310 (9), 1129-1139 (2016).</li>
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<li>Rhett, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cx43+associates+with+Na%28v%291.5+in+the+cardiomyocyte+perinexus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Cx43 associates with Na(v)1.5 in the cardiomyocyte perinexus.</a> Journal of Membrane Biology. 245 (7), 411-422 (2012).</li>
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<li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+methods+of+automated+quantification+of+gap+junction+distribution+and+interstitial+collagen+quantity+from+animal+and+human+atrial+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Novel methods of automated quantification of gap junction distribution and interstitial collagen quantity from animal and human atrial tissue sections.</a> PLoS One. 9 (8), 104357(2014).</li>
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<li>Reddy, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+cardiac+magnetic+resonance+imaging+with+three-dimensional+electroanatomic+mapping+to+guide+left+ventricular+catheter+manipulation%3A+feasibility+in+a+porcine+model+of+healed+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Integration of cardiac magnetic resonance imaging with three-dimensional electroanatomic mapping to guide left ventricular catheter manipulation: feasibility in a porcine model of healed myocardial infarction.</a> Journal of the American College of Cardiology. 44 (11), 2202-2213 (2004).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Der Algorithmus verwendet serielle Bild Dilatationen um die Anzahl der Pixel zwischen zwei gegenüberliegenden 2D Kanten in einem binären Bild, die in diesem Fall die Trennung zwischen Membran des Perinexus2,3,14 ist. Eine räumliche Ableitung und einen Pathfinding-Algorithmus werden dann zur Isolieren der Mittellinie, gefolgt von einer sekundären Dilatation und Erosion Sequenz Lücken in der Mittellinie, ähnlich wie was, bevor Sie15 getan wurde. Die Mittellinie wird dann mit dem endgültigen Dilatation-Graf Bild darzustellen Perinexal Breite als Funktion des Abstandes vom Anfang des Rand-Trennung, in diesem Fall Ende des GJ und Beginn der Perinexus16kombiniert.
Vier primäre Parameter sind frei definierbar in einem GUI zu Beginn des Programms:
<ol><li>Gradient Schwelle</li>
	<li>Skala</li>
	<li>Region von Interesse-Sortiment</li>
	<li>Start-Punkt Auswahlmethode (automatisch oder manuell)</li>
</ol>Die am häufigsten verwendete Mechanismus des Scheiterns für den Algorithmus ist das Versagen der Mittellinie, der Rand des Bildes, zu erreichen, die ist, wie der Endpunkt für die Wegfindung-Algorithmus bestimmt wird. Um solch ein Problem zu beheben, kann der Benutzer erhöhen den Farbverlauf Schwellenwert im Schritt 3.3.1, wodurch das Programm mehr Punkte aus dem räumlichen Derivative Bild auswählen, die die Rechenzeit gemäß der Pathfinding-Algorithmus zu erhöhen, wird beschrieben. Dieser Algorithmus erfordert daher einen Kompromiss zwischen Geschwindigkeit und Mittellinie Integrität Berechnung. Es ist wichtig zu beachten, dass, solange alle Punkte der Mittellinie von der räumlichen Ableitung, zusammen mit einem geeigneten Startpunkt identifiziert werden die räumlichen Derivative Schwelle wird keine Auswirkungen auf die Kante-Trennung-Messung.
Bildausrichtung scheint Dilatation Werte beeinflussen, weil der Kernel in 90 Grad Schritten, die Fehlermeldung einführen können weitet, wenn der Großteil der Region von Interesse in einem Winkel von 45° zu den Achsen der Dilatation Matrizen ist. Daher möglicherweise die Anzahl der Dilatation nicht immer eine genaue Darstellung des Raums zwischen den Rändern. Diese Einschränkung ist durch einen trigonometrischen Korrekturfaktor angesprochen worden, aber möglicherweise ignoriert werden konnte, wenn alle Bilder in einem Dataset in der gleichen Richtung ausgerichtet sind. Darüber hinaus sollte mit Vorsicht erfolgen bei der Interpretation der Ergebnisse, wie es möglich ist, dass Schnittebenen nicht perfekt senkrecht zu den beiden Membranen sind. In Abbildung 9Bverwenden wir GJW darauf hin, dass unsere Perinexus Bilder in der Ebene wurden. Dennoch ist es zwingend notwendig, dass Stichprobengrößen ausreichend dimensioniert um Stationspunkte Abweichungen zwischen den Bildern zu berücksichtigen sein. Darüber hinaus sollten unsere Perinexal Breite Messungen nicht interpretiert werden, angepasst in Vivo Räumen, aber dieser Ansatz wird verwendet, um durchschnittliche Unterschiede in der Perinexal Breite im Verhältnis zu einigen Intervention oder Krankheit Zustand messen.
Der aktuelle Algorithmus erfordert auch eine manuell verfolgt Gliederung der Kanten als Eingabe. Es ist wichtig zu beachten, dass, solange die Waage richtig eingestellt ist, räumlicher Auflösung keinen Einfluss auf den Algorithmus Messungen hat, wie die unterschiedlichen Auflösungen der Bilder in Abbildung 6 und ein zusätzliches Bild mit niedriger Auflösung in ergänzenden belegen S6-Datei. Der nächste Schritt bei der Verbesserung des Algorithmus ist menschliches Eingreifen vom Umriss Generation zusammen mit einem Tool entfernen, die den gewünschten Bereich auswählen können. Diese Funktionen würden wahrscheinlich erhöhen die Genauigkeit der Messung und Benutzer Vorspannung reduzieren.
Diese rechnerisch effiziente Algorithmus bietet eine schnellere Methode, erfordert ungefähr ein Fünftel der Arbeitsstunden zur Quantifizierung der Perinexus ohne nachweisbare Strafe auf Reproduzierbarkeit im Vergleich zu den manuellen Segmentierungsprozesses. Darüber hinaus nutzt die manuelle Segmentierung-Prozess eine Messung alle 15 Nanometer Quantifizierung Perinexal Breite, was zu unter Probenahme führen kann, da die Membran-Trennung von der Perinexus innerhalb dieser 15 nm-Bereich erheblich ändern kann. Im Gegensatz dazu hat das automatisierte Programm eine Ortsauflösung entspricht derjenigen der bildgebenden Modalität, in diesem Fall 2,9 Pixel pro Nanometer entlang der Länge des Perinexus, daher liefert einen feiner aufgelöst Durchschnitt der Perinexal Breite.
Während die Anwendungen im Bereich der kardialen Strukturbiologie vielversprechend sind und aufregend, dieser Algorithmus verwendet sich nicht auf TEM Bilder beschränken. Jeder Bereich erfordert eine präzise, hochauflösende Messung zweier quasi parallel 2D Kanten machen kann dieses Algorithmus verwenden. Der Algorithmus kann verwendet werden, etwas vom Flussufer Erosion und Hochwasser Muster aus Satellitenbildern zu vaskulären Entwicklung mit Hellfeld oder fluoreszierende Mikroskopie verfolgen. Eines der vielversprechendsten möglichen Anwendungen ist im Bereich der Kardiologie und Messung der linksventrikulären Ejektionsfraktion (EF) mit Point-of-Care kardiale Echokardiographie. Derzeit ist die Standardtechnik der Doppeldecker-Methode von Festplatten17, wenn ein neuer Algorithmus, AutoEF, derzeit Schneide EF-Quantifizierung Methode18,19 werden. Für Doppeldecker-Methode von Datenträgern die betreffende Kammer manuell verfolgt und quantifiziert mit einer modifizierten Simpson Methode, wobei die Gesamtlautstärke durch die Summierung der gestapelten elliptischen Scheiben automatisch berechnet wird. Die Haupteinschränkung bei dieser Methode ist, dass es nur die totale Querschnittsfläche der gewünschte Kammer, mit keine Lösung gelangen für bestimmte Regionen von Interesse, zu identifizieren und auch erhebliche menschliches Zutun und Know-how erfordert. Die neuere Methode, AutoEF, identifiziert und beschreibt den Rand des Ventrikels mit Hilfe eines 2D speckling Algorithmus und berechnet dann die ventrikuläre Querschnittsfläche. Dieser Prozess hat während präzise und effizient zur Messung der linksventrikulären Bruttofläche, auch eine ähnliche inhärente Einschränkung nur totale Querschnittsfläche zu messen. Diese primäre Nachteil begrenzt Kliniker diagnostischen und therapeutischen Fähigkeiten. Im Gegensatz dazu der Algorithmus präsentiert in dieser Handschrift erkennen eine Mittellinie und hat eine Auflösung entspricht die Auflösung der bildgebenden Modalität zu bestimmte Regionen des Interesses zu lokalisieren. Dies ist wichtig, da Ultraschall-Scanner mit einer räumlichen Auflösung Mikrometer handelsübliche20,21 sind, was bedeutet, dass dieser Algorithmus könnte lokalisierte Wand Bewegung Anomalien bei der Auflösung von Mikrometern zu erkennen statt Zentimeter. Während dieser Anwendung experimentell überprüft werden muss, ist es eine der unmittelbarsten vielversprechenden Anwendungen dieses Algorithmus. In der Tat, es könnte leicht kombinierbar mit der Speckle tracking-Funktionen von AutoEF oder die manuelle Spuren in manuellen Planimetrie, höherer Auflösung Informationen parallel zu herkömmlichen EF-Daten verwendet.
So vielseitig und anwendbar, da der aktuelle Algorithmus ist, wurde es für 2D Bilder entwickelt. Jedoch, wie imaging-Technologien zu verbessern weiter, gibt es eine steigende Nachfrage für 3- und 4-D-Quantifizierung-Technologien. Daher ist die nächste Iteration des Algorithmus, den gleichen Ansatz, seriell Dilatation ein binäres Bild auf ein 3-dimensionales Objekt, wo automatisch definieren eine Mittellinie derzeit über die Möglichkeiten der aktuellen imaging-Programme ist anzupassen. Solcher Algorithmus hätte breite Anwendungen klinisch und experimentell im kardiologischen Bereich allein, auch 3D kardiale Echokardiogramm22,23, 3D Elektronenmikroskopie24,25, 26und 3D Magnetresonanz-Tomographie27,28,29.

Der folgende Algorithmus wurde entwickelt, um der intermembran Abstand zwischen zwei strukturell gekoppelt Kardiomyozyten an dem Punkt zu messen, die sie voneinander, am Rande einer Lücke Kreuzung Plakette in eine Nanodomain trennen, genannt der Perinexus1, die hat in Ephaptic2,3,4,5Kupplung in Verbindung gebracht. Bei der Analyse von Hunderten von Übertragung Elektronenmikroskopie (TEM) Bilder von Perinexi mit einer manuellen Segmentierung Methode in einer früheren Studie6, wurde die Notwendigkeit für einen höheren Durchsatz-Methode identifiziert, die Perinexal Breite in höher abgetastet räumliche Auflösung unter Beibehaltung der Genauigkeit des früheren manuellen Segmentierungsprozesses während manueller Segmentierung, sind Linien in 15 nm Abständen etwa senkrecht zur Mittellinie, um Perinexal Breite zu messen. Der neue Algorithmus nimmt einen ein Pixel Dicke binäre Überblick über zwei parallele Linien und serielle Bild Streckungen verwendet, um die Anzahl der Pixel zwischen den beiden Membranen. Während Bild Streckungen häufig in einer Vielzahl von Bild-Verarbeitungsanwendungen eingesetzt wurden, verwendet einschließlich der Kontur oder Edge Detection7,8, dieser Algorithmus Streckungen als ein Zählwerk. Die Mittellinie ist dann isoliert mit einer Pfadfindung Algorithmus9 und Perinexal Breite mit einer Auflösung entlang der Länge des Perinexus entspricht die Auflösung des Bildes dann gemessen wird. Der Unterschied in der Auflösung ist in diesem Fall 1 Messung pro 15 nm für manuelle Segmentierung und 1 Messung pro 0,34 nm mit dem neuen Algorithmus, eine 44-fold Zunahme der räumlichen Sampling-Frequenz. Darüber hinaus wird diese erhöhte Abtastfrequenz in etwa 1/5th den Zeitaufwand für manuelle Segmentierung erreicht.
Dieser Algorithmus wird in seiner jetzigen Form verwendet werden, um Perinexal Breite bei der konventionellen 0-150 Messen nm von der Kante eines Gap Junction Plakette5 (GJ) sowie innerhalb einer bestimmten Region von Interesse, wo die Perinexus zwischen 30 und 105 nm2 Hochebenen , 3 , 10. erhöhte Abtastfrequenz reduziert die Variabilität der einzelnen Perinexus Messungen im Vergleich zu manuellen Segmentierung und deutlich verkürzt Analyse, so dass für die effiziente Verarbeitung großer Datenmengen. Dieses Programm ist jedoch nicht beschränkt auf nanoskaligen TEM Bilder von kardialen eingefügten Festplatten. Der gleiche Ansatz könnte verwendet werden, um vaskuläre Durchmesser, linksventrikulären Auswurffraktion oder sogar nicht-biologischen Phänomene wie Flusserosion oder Überschwemmungen zu quantifizieren. Dieser Algorithmus eignet sich für die Quantifizierung des Abstand zwischen zwei quasi-parallelen Kanten.

<table><tbody><tr><td>Touchscreen-Monitor</td><td>Dell</td><td>S2240T</td><td>Benötigt einen Stift mit weicher Spitze</td></tr><tr><td>Desktop</td><td>Dell</td><td>Precision T1650</td><td>8 GB RAM</td></tr><tr><td>Betriebssystem</td><td>Microsoft</td><td>Windows 7 Enterprise</td><td>64-Bit-Betriebssystem</td></tr><tr><td>Programmplattform</td><td>Mathworks</td><td>Matlab R2015b</td><td>Programm ist möglicherweise nicht kompatibel mit neueren/älteren Versionen von Matlab</td></tr></tbody></table>

quantifizierung der intermembran strecken mit seriellen bild dilatationen

Quantifying Intermembrane Distances with Serial Image Dilations

Kürzlich beschrieben extrazelluläre Nanodomain, genannt Perinexus, hat in Ephaptic Kupplung, verwickelt, was ist ein alternativer Mechanismus für die elektrische Leitfähigkeit zwischen Kardiomyozyten. Die aktuelle Methode zur Quantifizierung dieses Raumes durch manuelle Segmentierung ist langsam und hat geringe räumlichen Auflösung. Wir einen Algorithmus entwickelt, der serielle Bild Streckungen einer binären Gliederung verwendet, um die Anzahl der Pixel zwischen zwei gegenüberliegenden 2 dimensionale Kanten. Dieser Algorithmus erfordert weniger Arbeitsstunden und hat eine höhere räumliche Auflösung als die manuelle Methode unter Beibehaltung der Reproduzierbarkeit des manuellen Prozesses. In der Tat erlebt und Anfänger Ermittler konnten die Ergebnisse einer früheren Studie mit diesem neuen Algorithmus zu rekapitulieren. Der Algorithmus wird durch menschliches Zutun erforderlich, um die Perinexus manuell zu skizzieren und Rechenleistung vor allem belastet durch eine vorbestehende Pathfinding-Algorithmus begrenzt. Allerdings machen des Algorithmus Hochdurchsatz-Fähigkeiten, hohe räumliche Auflösung und Reproduzierbarkeit es vielseitig und robust Messinstrument für den Einsatz in einer Vielzahl von Anwendungen, bei denen die Messung des Abstandes zwischen jeder 2-dimensionale (2D ) Kanten.

Dieser Algorithmus soll kontinuierlich Messen Sie den Abstand zwischen zwei 2-dimensionale Kanten mit seriellen Bild Streckungen und Wegfindung. Dieser Algorithmus kann auf eine Vielzahl von Bereichen wie kardiale Strukturbiologie, vaskuläre Biologie und Tiefbau angewendet werden.

Quantifizierung der Intermembran Strecken mit seriellen Bild Dilatationen

A recently-described extracellular nanodomain, termed the perinexus, has been implicated in ephaptic coupling, which is an alternative mechanism for ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im kardialen elektrophysiologischen Bereich zu beantworten, über die Struktur des extrazellulären Raumes und zelluläre Kommunikationsmechanismen. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie über hohe Durchsatzfunktionen und eine verbesserte räumliche Sampling-Frequenz verfügt. Im Wesentlichen können wir Messungen schneller und mit höherem Vertrauen als bisher erhalten.Perinexus-Identifikation und Programmfehlersuche sind ohne visuelle Demonstration schwer zu erlernen, da das Perinexus eine relativ neu definierte Struktur ist und die Fehlerbehebung für Forscher, die mit MATLAB nicht vertraut sind, möglicherweise nicht intuitiv ist. Verwenden Sie für Graustufenbilder numerische Computersoftware, um sicherzustellen, dass kein Pixel eine Intensität größer als 255 aufweist. Öffnen Sie dann unser gekoppeltes Bild in der Bildverarbeitungssoftware und zoomen Sie auf das Perinexus.Es ist wichtig, das Perinexus richtig zu identifizieren. Der erste Schritt besteht darin, eine Spaltknoten-Plakette zu identifizieren, die ein gestreiftes Erscheinungsbild hat. Dann suchen wir nach zwei gegenüberliegenden Membranen, in der Ebene, bis zu etwa 200 Nanometer.Identifizieren Sie die Lücke Kreuzung Plaque von seiner Pentylaminer Struktur. Der Beginn des Perinexus ist der Punkt, an dem die beiden gegenüberliegenden Zellmembran-Doppelschichten auseinandergehen. Zeigen Sie eine Skalenleiste in Nanometern an.Der Anfangs- und Endpunkt der Perinexus-Umrisslinie wird 200 Nanometer vom Beginn des Perinexus sein. Wählen Sie als Nächstes das Freihandauswahlwerkzeug aus. Klicken und ziehen Sie, oder verwenden Sie einen Stift, um sorgfältig entlang der inneren Membran einer Zelle, bis zum Anfang des Perinexus und zurück entlang der inneren Membran der zweiten Zelle zu verfolgen.Schließen Sie den ausgewählten Bereich, indem Sie die Maustaste loslassen oder den Stift anheben. Legen Sie dann die Linienbreite auf ein Pixel und die Vordergrundfarbe auf den höchsten Intensitätswert für den Bildtyp fest. Z. B. Weiß, für Graustufenbild.Erstellen Sie eine nachverfolgte Gliederung aus der Auswahl, und speichern Sie das resultierende Bild als Dateityp, der mit der Analysesoftware kompatibel ist, z. B. JPEG oder TIFF. Öffnen Sie bei Bedarf die Membranentfernungsentfernungsanalysesoftware, und ändern Sie die Speicherorte für die zu generierenden Daten und Zahlen. Speichern Sie die Datei, und schließen Sie sie.Führen Sie dann das Programm aus. Legen Sie den Schwellenwert für den räumlichen abgeleiteten Verlaufsgradienten entsprechend für die Mittellinienidentifikation fest. Legen Sie die Skalierung und die Pixel pro Längeneinheit fest.Legen Sie die räumlichen unteren und oberen Grenzwerte für den Interessenbereich in Bezug auf den Rand des Spaltknotens fest. Wählen Sie entweder automatische oder manuelle Startpunkterkennung aus. Für unregelmäßig geformte Perinexi kann eine manuelle Startpunkterkennung erforderlich sein.Öffnen Sie dann das Bild mit dem umrissenen Perinexus. Klicken und ziehen Sie, um ein Feld um das Perinexus zu zeichnen, ohne das geschlossene Ende. Doppelklicken Sie in den verfolgten Perinexus-Umriss, um das Bild zuzuschneiden und die Mittellinie zu identifizieren.Wenn der Startpunkt manuell ausgewählt werden soll, werden ein Fadenkreuzcursor und eine Mittellinie über dem Originalbild angezeigt. Wählen Sie einen Punkt außerhalb des Perinexus in der Nähe des gewünschten Startpunkts aus, um den Prozess fortzusetzen. Sobald der Prozess abgeschlossen ist, bestätigen Sie, dass die Mittellinie innerhalb des Perinexus bleibt und den Startpunkt ordnungsgemäß schneidet.Überprüfen Sie die generierten Daten, und zeichnen Sie die Perinexalbreite. Wenn die Mittellinie nicht richtig identifiziert und isoliert wurde, öffnen Sie das g-mag-Bildarray, um einen geeigneten Gradientenschwellenwert zu bestimmen. Wir verwenden das Indexwerkzeug, um die Mittellinie zu klicken, und das g-mag-Array, um eine Vorstellung davon zu erhalten, welches Pixel der Suchalgorithmus für die Mittellinie auswählen soll.Der Gradientenschwellenwert sollte dann knapp über dem Intensitätswert dieser Pixel festgelegt werden. Wählen Sie das Indexwerkzeug aus, und klicken Sie auf und um die Mittellinie, um den Indexwert der Pixel anzuzeigen, die ausgewählt werden sollen. Legen Sie den Schwellenwert für den räumlichen abgeleiteten Gefälle auf knapp über dem Indexwert fest, und führen Sie den Prozess erneut aus.Wenn der Startpunkt im automatisierten Prozess nicht korrekt erkannt wurde, führen Sie das Programm erneut mit der manuellen Startpunkterkennung aus. In diesem Prozess werden manuelle Umrisse in 1 Pixel-Schritten erweitert, um die Anzahl der Pixel zwischen den beiden Kanten zu zählen. Jedes Inkrement wird einem Arbeitsbild hinzugefügt, um eine räumliche Ableitung zu generieren.Die ursprüngliche Umrisslinie und die Mittellinie sind Diskontinuitäten in ihrer Größe. Nach der Isolierung der Mittellinie wird sie durch Dilatation, Erosion und einen Pfadfindungsalgorithmus verfeinert. Perinexalbreite wird als Funktion der Entfernung vom Beginn des Perinexus oder innerhalb eines Bereichs von Interesse und als Durchschnitt dieser beiden Funktionen dargestellt.Als sich die Perinexus-Orientierung änderte, wurden je nach Dilatationsmuster Über- oder Unterschätzungen in der Perinexusbreite beobachtet. Die Trigonometrische Korrektur lieferte Ergebnisse, die stark mit Bildern korreliert waren, die gedreht wurden, um das Perinexus horizontal auszurichten. Der Algorithmus wurde für unterschiedliche räumliche Auflösungen, Referenzeinheiten und Bildgrößen validiert.Sowohl erfahrene als auch unerfahrene Benutzer verfolgten die Gliederung schneller, als sie das Bild manuell segmentiert haben. Und der automatisierte Prozess hatte eine deutlich größere räumliche Auflösung. Erfahrene und unerfahrene Beobachter identifizierten genau signifikante Unterschiede in der Perinexalbreite zwischen Patienten mit und ohne vorbestehende vorhofflimmernde Behandlung.Diese Beobachter identifizierten auch genau keinen signifikanten Unterschied zwischen absoluten Lückenknotenbreiten in derselben Population. Die Perinexal- und Spalt-Kreuzungsbreiten entsprachen früheren Berichten. Denken Sie beim Versuch dieses Verfahrens daran, sich Zeit mit dem Umriss zu nehmen, da schon kleine Abweichungen von der Membran erhebliche Fehler in diesem Maßstab verursachen können.Im Allgemeinen kämpfen Personen, die neu bei dieser Methode sind, weil sie mit der Struktur, die sie messen, nicht vertraut sind, oder sie sind unsicher, wie sie Probleme beheben können, um die Punktidentifikation oder die Mittellinienabweichung zu starten. Diese Bildverarbeitungsmethode wird angezeigt. Da Perinexus-Identifikation und Algorithmus-Fehlerbehebung sind schwer zu lernen, ohne sie.Und wir wollen sicherstellen, dass wir quantifizieren, was wir sagen, dass wir messen. Diese Technik ebnet den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Herzgesundheit, um eine höhere Auflösung Quantifizierung vieler Ebenen der Herzfunktion zu erforschen. Von nanoskaligen, extrazellulären Räumen bis hin zur klinischen Bestimmung der ventrikulären Effizienz oder Unfunktion.Obwohl diese Methode mit Elektromikroskopie-Bildern demonstriert wurde, kann sie auch auf andere bildgebende Verfahren wie die Kardiographie angewendet werden, um die mechanische Funktion des Herzens genauer zu quantifizieren. Diese Methode kann Anwendungen in jedem Bildgebungsfeld finden, da das Programm den Abstand zwischen zwei definierten Kanten messen kann, wenn der Maßstab entsprechend festgelegt ist und die Kanten nahezu parallel sind.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir beschreiben eine super-resolution imaging Methode, um die strukturelle Organisation des bakteriellen FtsZ-Ring, ein wesentlicher Vorrichtung zur Zellteilung zu untersuchen. Diese Methode basiert auf quantitativen Analysen von photoaktivierten Lokalisierungs-Mikroskopie (PALM) Bilder und kann auf andere bakterielle Proteine ​​des Zytoskeletts angewendet werden.

Super-Resolution Imaging der Bakterien Abteilung Machinery

Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Analyse des Membranprotein-vermittelten Transports auf Einzeltransporterebene unter Verwendung von porenübergreifenden, lösungsmittelfreien Lipiddoppelschichten. Dies wird durch die Herstellung von in großen Mengen hergestellten Nanoporen-Array-Chips in Kombination mit einer hochparallelen Datenerfassung und -analyse erreicht, die die zukünftige Etablierung von Membranprotein-Effektor-Screenings ermöglicht.

Membrantransportprozesse durch eine hochparallele Nanopore Chip-System bei Einzel Protein Resolution Analysierte

Dieses Protokoll effizient studiert Säugetier-Zellteilung in 3D Kollagen Matrizen durch die Integration von Synchronisation der Zellteilung, Überwachung der Abteilung Veranstaltungen in 3D Matrizen mit live-Cell imaging Technik, zeitaufgelöste konfokale Reflexion Mikroskopie und quantitative bildgebende Analyse.

Säugetier-Zellteilung in 3D Matrizen über Quantitative konfokale Reflexion Mikroskopie

Ziel dieses Protokolls ist es, eine neuartige Methode zur Beurteilung der segmentalen Herzfunktion bei embryonalen Zebrafischen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu beschreiben.

Displacement Analysis of Myocardial Mechanical Deformation (DIAMOND) Reveals Segmental Heterogeneity of Cardiac Function in Embryonic Zebrafish

Die vorgestellte Methode beinhaltet das einachsige Dehnen von 3D-Weichhydrogelen, die in Silikonkautschuk eingebettet sind, während eine konfokale Live-Mikroskopie ermöglicht wird. Die Charakterisierung der externen und internen Hydrogelstämme sowie die Faserausrichtung werden demonstriert. Das entwickelte Gerät und Protokoll kann die Reaktion von Zellen auf verschiedene Belastungsregime beurteilen.

Kontrollierte Dehnung von 3D-Hydrogelen unter Live-Mikroskopie-Bildgebung

Hier wird ein Ansatz für die intravitale Langzeitbildgebung mit optisch klaren Silikonfenstern vorgestellt, die direkt auf das interessierende Gewebe/Organ und die Haut geklebt werden können. Diese Fenster sind billiger und vielseitiger als andere, die derzeit im Feld verwendet werden, und das chirurgische Einführen verursacht begrenzte Entzündungen und Leiden bei den Tieren.

Längsschnittliche intravitale Bildgebung durch klare Silikonfenster

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Visualisierung und Messung von Aktinringen und anderen Komponenten des periodischen Membranskeletts des Axon-Anfangssegments unter Verwendung von kultivierten Ratten-Hippocampus-Neuronen und 3D-strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (3D-SIM).

Messung der Eigenschaften des periodischen Membranskeletts des Axon-Anfangssegments mittels 3D-strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (3D-SIM)

Ein einfaches und umfassendes Protokoll, um dreidimensionale Details von Membrankontaktstellen zwischen Organellen in Hepatozyten aus der Leber oder Zellen in anderen Geweben zu erfassen.

Dreidimensionale Charakterisierung von interorganellen Kontaktstellen in Hepatozyten mittels serieller Schnittelektronenmikroskopie

Wir stellen ein Protokoll zur Implementierung der Interferenzreflexionsmikroskopie und der Total-Interreflexions-Fluoreszenzmikroskopie für die gleichzeitige Abbildung von dynamischen Mikrotubuli und fluoreszenzmarkierten Mikrotubuli-assoziierten Proteinen vor.

Simultane Interferenzreflexion und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie zur Abbildung dynamischer Mikrotubuli und assoziierter Proteine

Die vorliegenden Protokolle beschreiben neuartige Whole Mount Imaging zur Visualisierung peripherer Strukturen in der Okularlinse mit Methoden zur Bildquantifizierung. Diese Protokolle können in Studien verwendet werden, um die Beziehung zwischen mikroskaligen Strukturen der Linse und der Entwicklung/Funktion der Linse besser zu verstehen.

Bildgebung des gesamten Bajonetts zur Visualisierung und Quantifizierung der peripheren Linsenstruktur, Zellmorphologie und -organisation

Hier präsentieren wir ein vielseitiges äquibiaxiales Streckgerät, das pneumatisch betätigt wird und mit der hochauflösenden Mikroskopie kompatibel ist.

Äquibiaxiales Stretching-Gerät für die konfokale Fluoreszenzmikroskopie mit lebenden Zellen mit hoher Vergrößerung

Erfahren Sie, wie Sie die Perinexus-Breite mit automatisierten Bilddilatationen und Pfadfindungsalgorithmen präzise messen. Diese Methode verbessert die räumliche Auflösung gegenüber manueller Segmentierung in der kardialen Strukturbiologie.

Quantifizierung der Intermembran Strecken mit seriellen Bild Dilatationen

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