Name: Lasergestützte Lentivirale gen Lieferung an Maus befruchtete Eier (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Erfahren Sie die laserunterstützte Lentivirustransduktion zur Gentransfer in befruchtete Mäuseeier. Diese Methode ermöglicht die schnelle Entwicklung transgener Tiermodelle ohne spezialisierte Mikroinjektionsfertigkeiten.

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Diese Forschung wurde durch die Intramural Research Program des National Institute of Health (NIH), National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) unterstützt. Wir sind dankbar, Dr. Robert Petrovich und Dr. Jason Williams für kritische Lektüre des Manuskripts und hilfreiche Ratschläge. Wir möchten auch anerkennen und Dr. Bernd Gloss, der Ko-Kern, Flow Cytometry Anlage, die Fluoreszenz-Mikroskopie und Imaging Center und die vergleichende Medizin Zweig Einrichtungen des NIEHS für ihre technische Beiträge danken. Wir möchten danken Mr David Goulding aus dem vergleichenden Medizin Zweig und Frau Lois Wyrick des Imaging Center bei NIEHS für die uns mit Fotos und Illustrationen.

Alle tierischen Verfahren und Behandlungen, die in diesem Protokoll verwendeten wurden in Übereinstimmung mit den Leitlinien der NIH/NIEHS Tierbetreuung und vom Tier Pflege und Verwendung Ausschuss (ACUC) am NIH/NIEHS, Tier-Protokoll 2010-0004 genehmigt wurden.
1. Vorbereitungen
<ol><li>Vorbereitung/Kauf rekombinante nicht propagieren Lentiviren tragen Ihre gen von Interesse. In dieser Studie, Lentivirus SBI511 mit dem Ausdruck schalenlose grün fluoreszierendes Protein (CopGFP; abgekürzt GLP) aus eine Dehnung Faktor-1a-Promoter für Transduktion verwendet wurde. Standard-Protokolle2 wurden verwendet, um zu produzieren und Titer Lentiviren bei Titer höher als 1e8 3D-Steuerung Einheiten pro mL (TU/mL). Hinweis: Seien Sie vorsichtig und sämtliches Material, das in Kontakt mit Lentiviren wurden zu bleichen. Finden Sie in Ihrem Institut Richtlinien für sichere Anwendung und Handhabung von Lentiviren.</li>
	<li>Setup Brutpaare der gewünschten Maus Belastung am Tag vor der Ernte Embryonen. In diesem Experiment wurde C57BL/6J Stamm von Mäusen verwendet. Weibliche Mäuse für Eierstöcke und Eileiter Sammlung verwendet wurden nicht mit Hormonen für Superovulation behandelt.</li>
	<li>2 bis 24 h vor der Ernte Maus befruchtete Eier, mehrere Kalium Simplex optimiert Medium24 (KSOM) Drop Platten wie folgt vorbereiten: einen Tropfen 50 μL KSOM Medium in die Mitte eines 35 mm Gewebekultur-behandelte Schale und Deckel mit 2 mL Dimethylpolysiloxane (DMPS5X) und bei 37 oC, 5 % CO2, 5 % O2 und 90 % N2 equilibrate. Hinweis: Sterile Einweggeschirr und verwerfen nach Exposition gegenüber Lentiviren.</li>
	<li>1 X Lösung von Hyaluronidase in M2 Medium aus Stammlösung vorbereiten (100 X, 30 mg/mL, Lagerung bei-20 ° C). 100 x Stammlösung wurde im Wasser vorbereitet.</li>
	<li>24 h post lasergestützte Transduktion von Maus befruchtete Eier, Brutpaare zwischen vasektomierten männlichen und weiblichen Mäusen pseudopregnant weibliche Mäusen Vorbereitung eingerichtet.</li>
</ol>2. Isolierung der Maus befruchtete Eier
<ol><li>16 – 24 h Post Paarung, wählen Sie weibliche Mäuse mit vaginalen Stecker bezeichnend für erfolgreiche Paarung und Human einzuschläfern25. Die Mäuse, die in dieser Studie verwendet wurden durch zervikale Dislokation unter tiefen CO2 oder Isofluran Inhalation eingeschläfert.</li>
	<li>Eierstöcke und Eileiter nach Standardprotokollen25zu isolieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Eierstöcke und Eileiter auf eine 35 mm-Schale mit M2-Medien.</li>
	<li>Reißen Sie für jeder Eierstock Ampulla auseinander um befruchtete Eier von Kumuluszellen umgeben zu lösen.</li>
	<li>Befruchtete Eier zu übertragen und Kumuluszellen bis 35 mm Schale mit 1 X Hyaluronidase in M2 Medium und bei 3 – 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Pipettieren befruchtete Eier nach oben und unten, die Kumuluszellen freizugeben.</li>
	<li>Übertragen Sie befruchteten Eier auf eine 35-mm-Schale mit M2 Medien und Pipettieren rauf und runter, Hyaluronidase abwaschen.</li>
	<li>Übertragen Sie befruchteten Eier auf eine 35-mm-Schale mit KSOM und Pipettieren rauf und runter, die restlichen M2 Medien und Hyaluronidase abwaschen.</li>
	<li>Übertragen Sie befruchtete Eier von Schritt 1.3 auf die vorbereiteten KSOM Drop Platten. Hinweis: Maus, die befruchteten Eier in KSOM müssen in einer Gewebekultur Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO2, 5 % O2 und 90 % N2 bis equilibrate gehalten werden. Entfernen von Platten aus dem Inkubator für länger als 15 min führt zu Schäden an Embryonen.</li>
	<li>Lassen Sie befruchteten Eier für 2 h in den Inkubator zu erholen, bevor mit dem nächsten Schritt fort.</li>
</ol>(3) Perforation der Maus befruchtete Eier mit XYClone Laser
<ol><li>Setup und Kalibrierung XYClone Laser nach Empfehlung des Herstellers. Andere Laser, normalerweise verwendet für in-vitro- Befruchtung, können für XYClone Laser zu perforieren befruchtete Eier ersetzt werden.<ol>
<li>Befestigen Sie den Laser Controller Box Draht Lasergerät am Mikroskop.</li>
		<li>Legen Sie die Laser-Controller-Box auf den Computer mit der Lasersoftware über einen USB-Anschluss. 3.1.3 der Laser-Controller anschließen und einschalten.</li>
		<li>Blick durch das Okular, Perforieren Sie eine Probe (z.B. trocken abwischbaren Markierungen auf einem Objektträger).</li>
		<li>Verwenden eines kleinen Schraubendrehers (enthalten in der Laser-Kit) Anpassung der X und Y-Position des Lasers entsprechen die LED Licht sichtbar durch das Mikroskop Okular und kalibrieren den Laser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie eine KSOM Drop-Platte mit Maus befruchteten Eier auf den Mikroskoptisch. Halten Sie nicht die Platte außerhalb der Inkubator für länger als 15 Minuten.</li>
	<li>Blick durch das Mikroskop Okular und sicherstellen, dass der Embryo Zona Pellucida im Mittelpunkt steht und der Laser LED-Licht sichtbar ist.</li>
	<li>Bewegen Sie den Mikroskoptisch, Zona mit dem LED-Licht/Laser Ziel.</li>
	<li>Legen Sie mithilfe der Computersoftware XYClone Laser auf 250 μs.</li>
	<li>Passen Sie die LED Licht Größe zum gewünschten Abmessungen (Einstellung 5 in diesem Experiment).</li>
	<li>Perforieren der Zona jeder befruchteten Eizelle dreimal mit dem Laser. Die Zona werden durchbohrt oder verdünnt. Mithilfe der oben genannten Einstellungen erzeugt der Laser ein Loch mit einem Durchmesser von 10 μm (Abbildung 2). Hinweis: Mit dem Ziel, in der Nähe der Polkörper Laser hält, Weg von der embryonalen Zelle.</li>
	<li>Lassen Sie befruchteten Eier für 2 h in der Gewebekultur Inkubator zu erholen, bevor mit dem nächsten Schritt fort.</li>
</ol>(4) Transduktion Maus befruchtete Eier nach XYClone Laserperforation
<ol><li>Pipettieren 2 μL der konzentrierten Lentivirus (größer als 1e8 TU/mL Titer) in den 50 μL KSOM Tropfen. Tun Sie nicht Pipettieren rauf und runter. Befruchtete Eier legen leicht bis zur Spitze pipettieren. Basierend auf unserer Erfahrung, 1e5 5e5 3D-Steuerung Einheiten des Lentivirus in einem Volumen von weniger als 3 μL ist optimal für gen-Lieferung.</li>
	<li>Lassen Sie befruchtete Eier für 4 Tage im Inkubator zu Blastozysten entwickeln. Keine Notwendigkeit, die Medien zu ändern.</li>
</ol>5. nicht-chirurgische Übertragung von ausgestrahlt Mausembryonen Pseudo-schwangeren Mäusen
<ol><li>Verwenden Sie pseudopregnant Mäuse, 3,5 Tage nach der Paarung im Schritt 1.5 vorbereitet.</li>
	<li>Verwenden Sie Non-Surgical Embryo Transfer (NSET) Gerät, in pseudopregnant Mäuse Maus-Embryonen einzupflanzen.<ol>
<li>Mit einem chirurgischen oder Mikroskop, sezieren einfügen ein vaginal Spekulum, den Gebärmutterhals zu visualisieren.</li>
		<li>Das nicht-chirurgische Embryo Transfer (NSET) Gerät ca. 5 mm in die Zervix und Kaution Embryonen in einem Volumen von ca. 2 μL einsetzen. Hinweis: Ist eine sterile NSET Gerät für jede Übertragung verwendet und nach dem Eingriff verworfen. Alle Reagenzien in der Manipulation der Embryonen müssen steril sein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Übertragen Sie 10 – 15 gesunde Blastozyste 2 μL Volumen der KSOM auf jeder pseudopregnant Mäuse.</li>
	<li>Weiter zur Überwachung und Messung der Gewichtszunahme bei pseudopregnant Mäusen an folgenden Tagen um festzustellen, ob die NSET erfolgreich war.</li>
	<li>Indem die schwangere Mäuse gebären natürlich oder Durchführung einen Kaiserschnitt 17 Tage nach dem Embryotransfer26Welpen zu erholen. Ein Kaiserschnitt ist oft notwendig, wenn sehr wenige Embryonen vorhanden sind und sie zu groß für die natürliche Geburt wachsen.</li>
	<li>Sammeln Sie Gewebe von Welpen für die Genotypisierung zur Bestimmung des Transgenese27.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Fähigkeit der Lentiviren, in deren Wirtsgenom integrieren macht sie einen idealen Vektor für stabile gen Lieferung. Lentivirale Vektoren können bis zu 8,5 Kilobase paar (Kbp) des genetischen Materials führen, die zellspezifische oder induzierbaren Promotern, Selektionsmarker oder fluoreszierende Moieties aufnehmen können. Eingearbeitete genomische Material kann als Bestandteil ihrer Wirtsgenom replizieren und zu äußern oder zu gewünschten Zeitpunkten deaktivieren geregelt werden. Diese Vektoren ermöglichen räumlich-z...

Diese Methode bietet detaillierte Anweisungen für die Zona Pellucida der Maus befruchtete Eier permeabilizing embryonale Zellen von Lentiviren gen Lieferung zugänglich zu machen. Lentiviren sind naturgemäß für effiziente gen Lieferung für Säugerzellen ausgelegt. Sie trennende und nicht teilenden Zellen infizieren und ihre Gastgeber Chromosomen1das Lentivirale Genom integrieren. Das Lentivirale Wirtszellen ist leicht durch Pseudotyping der rekombinanten Lentivirus mit vesikuläre Stomatitis Virus Glykoprotein (VSV-G), aufgrund der breiten Tropismus des VSV-G Protein2erweitert. Nach Transduktion Lentivirale Gene stabil integriert und als Teil ihrer Host-Chromosomen schaffen ein ideales Werkzeug zur Erzeugung transgener Tiere ausgedrückt. Frühen Stadium embryonalen Zellen geliefert, das Lentivirale Genom repliziert und ausgedrückt in den gesamten Organismus. Lentivirale Transduktion hat dazu geführt, die Produktion von Mäusen, Ratten, Huhn, Wachtel und Schwein3,4,5,6,7 unter anderen Arten von gentechnisch veränderten Pflanzen. Die typische Art der Lentivirale gen Lieferung, erfordert jedoch qualifizierte Techniker und Spezialgeräte, die Zona Pellucida-Barriere zu überwinden, die die frühen Embryonen kapselt. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die Zona mit Hilfe eines Lasers auf um Lentivirale gen Lieferung zu erleichtern permeabilize beschreiben.
Säugetier Eier sind von der Zona Pellucida umgeben, nach Befruchtung härtet, die befruchteten Eier gegen Polyspermy zu schützen und Umweltwechselwirkungen8,9zu beschränken. Die Zona bildet eine Barriere, die Lentiviren Weg von den embryonalen Zellen hält, bis die Embryonen als Blastozyste ausgebrütet werden. Kultivierte Maus befruchteten Eiern schlüpfen nach 4 Tagen und muss in pseudopregnant Mäuse vor der Schraffur für eine normale Entwicklung in Welpen implantiert werden. Daher sind für die Transduktion, Lentiviren vor dem schlüpfen aus der Zona in der Perivitelline Hohlraum, der Raum zwischen der Zona und die embryonalen Zellen mikroinjiziert.
Die Zona Pellucida wird oft für in-vitro- Befruchtung der menschlichen Eizellen, die Befruchtung Rate10erhöhen entfernt. Jedoch chemische Entfernung der Maus Zona Pellucida nachteilig wirkt sich auf die Entwicklung des Embryos und ist schädlich für die embryonalen Zellen11,12. Andere Methoden für die gen-Lieferung an Maus befruchtete Eier überwunden die Zona Pellucida Barriere durch direkte Mikroinjektion von DNA in die Zelle Kern13. Man Mikroinjektion ist ein effizientes Mittel zur Bereitstellung von Genen für Embryonen. Da jedes Embryo im Ort individuell für die Mikroinjektion stattfindet, kann die Praxis mühsam und zeitaufwendig für einen Neuling jedoch.
Andere Methoden wie Electroporation und Photoporation eignen sich für transiente und kurzfristige gen Lieferung an Maus befruchtete Eier14,15,16. Mit diesen Methoden sind ausführlich für die Bereitstellung von CRISPR-Cas9 Komponenten und Rekombinasen. Electroporation und Photoporation Bereitstellung von Gene jedoch kann nicht effizient zum gentechnisch veränderten Pflanzen zu schaffen. Spermien, die aus punktierten Maus Nebenhoden gesammelt werden können auch von Lentiviren ausgestrahlt und für in-vitro- Befruchtung verwendet, um transgene Tiere17,18,19, zu produzieren 20.
In diesem Protokoll wird die Lentivirale gen Lieferung an Mäuseembryonen durch permeabilizing der Zona mit Hilfe eines Lasers erleichtert. Die XYClone Laser wurde als Hilfsmittel für in-vitro- Befruchtung21 und Anbau von embryonalen Stammzellen22entwickelt. Es ist ein kleiner Apparat, der einfach zu installieren und einfach zu bedienen ist. Einmal installiert am Mikroskop, es den Raum von einem Objektiv nimmt und die mitgelieferte Software ermöglicht mit dem Ziel des Lasers beim Blick durch das Mikroskop Okulare (siehe Protokoll: Abschnitt 3). Sobald die Zona vom XYClone Laser perforiert ist, können die Nährmedien für gen Lieferung23Lentiviren eingeführt. Mehreren Lentiviren könnte verwendet werden, um gleichzeitig mehrere Gene für chromosomale Integration liefern.
Dieses Protokoll wird beschrieben, wie Sie zu isolieren und Kultur Maus Eier befruchtet, veranschaulicht die Verwendung der Laser für die Perforation der Zona Pellucida und zeigt die Signalweiterleitung Maus embryonalen Zellen von Lentiviren.

<table><tbody><tr><td>CD510B-1-Plasmid</td><td>System Biosciences</td><td>CD510B-1</td><td>zur Verpackung des Lentivirus, das EF1a-copGFP exprimiert</td></tr><tr><td>Dimethylpolysiloxan</td><td>Sigma</td><td>DMPS5X</td><td>zur Kultivierung von Embryonen</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma</td><td>H3506</td><td>zur Entfernung von Kumuluszellen</td></tr><tr><td>XYClone Laser Hamilton</td><td>Thorne Biosciences</td><td></td><td>Perforation von befruchteten Mauseiern</td></tr><tr><td>Gerät für den nicht-chirurgischen Embryotransfer (NSET)</td><td>ParaTechs</td><td>60010</td><td>NSET von Embryonen</td></tr><tr><td>KSOM medium</td><td>Millipore</td><td>MR-020P-5F</td><td>Kultivierung von Embryonen</td></tr><tr><td>Zusammensetzung von KSOM:</td><td></td><td></td><td>mg/100mL</td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td>555</td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td>18,5</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td></td><td></td><td>4,75</td></tr><tr><td>MgSO4 7H2O</td><td></td><td></td><td>4,95</td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td></td><td></td><td>25</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td></td><td></td><td>210</td></tr><tr><td>Glukose</td><td></td><td></td><td>3,6</td></tr><tr><td>Na-Pyruvat</td><td></td><td></td><td>2.2</td></tr><tr><td>DL-Milchsäure, Natriumsalz</td><td></td><td></td><td>0.174mL</td></tr><tr><td>10 mM EDTA</td><td></td><td></td><td>100&micro; L</td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td></td><td></td><td>5</td></tr>, <tr><td>Penicillin</td><td></td><td></td><td>6,3</td></tr><tr><td>0,5 % Phenolrot</td><td></td><td></td><td>0,1 ml</td></tr><tr><td>, L-Glutamin</td><td></td><td></td><td>14,6</td></tr><tr><td>MEM Essentielle Aminosäuren</td><td></td><td></td><td>1</td></tr><tr><td>mL MEM, nicht essentiell AA</td><td></td><td></td><td>0,5 mL</td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td>100</td></tr><tr><td>M2 medium</td><td>Millipore</td><td>MR-015-D</td><td>Kultivierung von Embryonen</td></tr><tr><td>Zusammensetzung von M2:</td><td></td><td></td><td>mg/100mL</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td></td><td></td><td>25,1</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat (wasserfrei)</td><td></td><td></td><td>16,5</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td></td><td></td><td>35,6</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat, einbasisch</td><td></td><td></td><td>16,2</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td></td><td></td><td>35</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td></td><td></td><td>553,2</td></tr><tr><td>Albumin, Rinderfraktion</td><td></td><td></td><td>400</td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td></td><td></td><td>100</td></tr><tr><td>Na-HEPES</td><td></td><td></td><td>54,3</td></tr><tr><td>Phenolrot</td><td></td><td></td><td>1,1</td></tr><tr><td>Brenztraubensäure</td><td></td><td></td><td>3,6</td></tr><tr><td>DL-Milchsäure</td><td></td><td></td><td>295</td></tr></tbody></table>

lasergestützte lentivirale gen lieferung an maus befruchtete eier

Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Lentiviren sind effiziente Vektoren für gen-Lieferung für Säugerzellen. Nach Transduktion Lentivirale Genom ist stabil in das Host-Chromosom integriert und werden an die Nachkommen weitergegeben. Daher sind sie ideale Vektoren für die Schaffung von stabilen Zelllinien, in Vivo Lieferung von Indikatoren und Transduktion Einzelzelle befruchtete Eier transgene Tiere zu erstellen. Aber Maus befruchtete Eier und frühen Embryonen sind geschützt durch die Zona Pellucida, ein Glykoprotein-Matrix, die eine Barriere gegen Lentivirale gen Lieferung bildet. Lentiviren sind zu groß, um die Zona durchdringen und werden in der Regel durch Mikroinjektion von viralen Partikel in der Perivitelline Hohlraum, der Raum zwischen der Zona und die embryonalen Zellen geliefert. Der Bedarf an hochqualifizierten Technologen und spezialisierte Ausrüstung hat die Verwendung von Lentiviren für gen-Lieferung an Mäuseembryonen minimiert. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Maus, die befruchteten Eier durch Perforation der Zona mit einem Laser permeabilizing. Laser-Perforation führt nicht Schäden an Embryonen und Lentiviren Zugriff auf embryonale Zellen für gen Lieferung ermöglicht. Ausgestrahlt Embryonen können entwickeln sich zu Blastozysten in-vitro- und wenn bei pseudopregnant Mäusen implantiert in transgenen Welpen entwickeln. Die in diesem Protokoll verwendeten Laser ist effektiv und einfach zu bedienen. Gene stabil von Lentiviren geliefert in embryonalen Mauszellen integrieren und Keimbahn übertragbare sind. Dies ist eine alternative Methode zur Erstellung von transgenen Mäusen, die keine Mikromanipulation erfordert und Mikroinjektion von befruchteten Eiern.

Entwicklung von isoliert/ausgestrahlt Maus befruchteten Eiern kann unter dem Mikroskop täglich (Abbildung 1) überprüft werden. Gesunde Embryonen entwickeln sich zu Blastozysten innerhalb von 3 – 4 Tagen. In diesem Protokoll entwickeln 60 – 70 % der unbehandelten Embryonen sich zu Blastozysten23. Aus 114 Laser perforiert ausgestrahlt Embryonen, 54 entwickelte sich zu Blastozysten (Höhe von 47 %) und 46 Blastozysten ausgedrückt GFP (46/5...

Befruchtete Eier Maus und frühen Embryonen sind geschützt durch die Zona Pellucida, ein Glykoprotein-Matrix, die eine Barriere gegen gen Lieferung bildet. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Perforation der Zona mit einem Laser, embryonale Zellen mit Lentivirale Vektoren transduzieren und transgene Mäuse zu schaffen.

Lasergestützte Lentivirale gen Lieferung an Maus befruchtete Eier

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...

Dies ist eine alternative und einfach zu bedienende Methode zur Lieferung von Genen von Interesse an befruchtete Mauseier mittels Laserperforation der Zona pellucida und lentiviralgen Genabgabe. Die laserunterstützte Perforation des Mausspenderverfahrens kann auch auf befruchtete Eier anderer Arten anwendbar sein, um den Eintritt anderer Arten von Viren oder Transfektionsreagenzien zu erleichtern. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie keine speziellen Fähigkeiten für die Mikromanipulation und Mikroinjektion der befruchteten Mauseier erfordert.Der Nachweis des befruchteten Bio-Ei-Isolationsverfahrens wird Page Myers sein, ein Forscher aus der Abteilung Vergleichende Medizin am NIEHS. 16 bis 24 Stunden nach der Paarung, isolieren Sie die Eierstöcke und Eizellen von weiblichen Mäusen mit Vaginalsteckern, nach Standardprotokollen. Wenn alle Gewebe gesammelt sind, reißen Sie die Ampulla jedes Eierstocks auseinander, und geben Sie die befruchteten Eier, umgeben von Haufenzellen, frei und übertragen Sie die Eier in cumulösen Zellen in eine 35-Millimeter-Schale, die eine x Hyaluronidase in frischem M2-Medium enthält, für eine drei- bis fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur.Pipette die Eier ein paar Mal, um die Cumulous-Zellen freizugeben, und übertragen Sie die Eier auf eine neue 35-Millimeter-Schale mit M2-Medium, mit Pipetten, um das Enzym abzuwaschen. Als nächstes übertragen Sie die gewaschenen Eier in eine 35-Millimeter-Schale mit Kalium-Simplex-optimiertem Medium oder KSOM und Pipette, um das restliche M2-Medium und Hyaluronidase abzuwaschen. Dann übertragen Sie die Eier auf 35 Millimeter Gewebekultur behandelt Platten mit 50 Mikroliter KSOM und zwei Milliliter Dimethylpolysiloxan für eine zweistündige Gleichgewicht bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und Sauerstoff und 90% Stickstoff gesät.Während sich die Eier im Inkubator befinden, richten Sie den XYClone-Laser gemäß den Empfehlungen des Herstellers ein und kalibrieren Sie sie. Wenn die Eier fertig sind, legen Sie die erste Fallplatte auf die Lasermikroskop-Stufe und fokussieren Sie die Zona pellucida manuell. Nachdem Sie bestätigt haben, dass das Laser-LED-Licht durch das Objektiv sichtbar ist, bewegen Sie die Mikroskopstufe, um die Zona mit dem LED-Laser anzuvisieren, und verwenden Sie die Computersoftware, um den XYClone-Laser auf 250 Mikrosekunden einzustellen.Passen Sie die LED-Lichtgröße an die entsprechenden Abmessungen an, und perforieren Sie die Zona pellucida jedes Ei dreimal mit dem Laser, um drei 10-Mikrometer-Löcher zu erzeugen. Es ist wichtig, die Perforation schnell durchzuführen, aber sorgfältig, da die befruchteten Eier nicht länger als 15 Minuten außerhalb des Inkubators halten können. Dann geben Sie die perforierten Eier für weitere zwei Stunden an den Brutkasten zurück.Behandeln Sie am Ende der zweiten Inkubation den 50-Mikroliter-KSOM-Tropfen mit zwei Mikrolitern konzentriertem Lentivirus ohne Mischen. Und die Eier für vier Tage in den Brutkasten zurückbringen. Wenn sich die Eier zu Blastozysten entwickelt haben, verwenden Sie ein nicht-chirurgisches Embryotransfergerät, um etwa 10-15 Embryonen in etwa zwei Mikroliter KSOM zu deponieren.17 Tage nach dem Embryotransfer die schwangere Maus auf natürliche Weise zur Welt bringen oder die Neonate nach Kaiserschnitt sammeln lassen. Dann sammeln Sie Gewebe von den Welpen für die Genotypisierung, um die Rate der Transgenese zu bestimmen. Isolierte und transduzierte mausbefruchtete Eientwicklung kann täglich unter dem Mikroskop überprüft werden.60 bis 70% der gesunden, unbehandelten Embryonen entwickeln sich innerhalb von drei bis vier Tagen zu Blastozysten. Während sich etwa 47 % der laserperforierten, transduzierten Embryonen zu Blastozysten entwickeln, von denen 85 % das übertragene Gen von Interesse ausdrücken. Das Ausrichten des Lasers, um die Zona zu verdünnen, anstatt ein Loch zu schaffen, ermöglicht es den sich entwickelnden Embryonen, von einer intakten, verkapselnden Zona pellucida zu profitieren, während sie für die lentivirale Transduktion freibleibend bleiben.Die Transduktion mit einem rekombinanten Lentivirus, das copepodes GFP aus einem Dehnungsfaktor 1A-Promotor ausdrückt, induziert mehrere lentivirale Integrationen und eine hohe Expression von GFP unter einer blauen LED-Lampe. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Fähigkeit von Lentiviren, sich in das Wirtsgenom zu integrieren, sie zu einem leistungsstarken Werkzeug für eine stabile Genabgabe macht, aber die zufällige Integration kann auch Insertionsmutationen einleiten. Diese Technik könnte es Forschern auf dem Gebiet der Genetik ermöglichen, schnell transgene Tiermodelle für die Erforschung von Krankheiten für die In-vivo-Proteinproduktion oder für funktionelle Genstudien zu entwickeln.Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Immunhistochemie an isolierten Gewebeproben von transduzierten Welpen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über den Standort und das Ausmaß der Genexpression in verschiedenen Geweben von Interesse zu beantworten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lentiviren extrem gefährlich sein kann. Befolgen Sie daher bitte Ihre institutionellen Richtlinien für die Arbeit mit Lentiviren.Tragen Sie persönliche Schutzkleidung und dekontaminieren Sie alle Abfälle vor der Entsorgung.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Diese Operationstechnik veranschaulicht die Injektion von Gentherapie-Vektoren und Stammzellen in den subretinalen Raum des Auges Maus.

Subretinalen Injektion von Vektoren für die Gentherapie und Stammzellen in die Maus Eye

Quelle: Lutz, D., et al. Beurteilung der ultrastrukturellen Neuroplastizitätsparameter nach in utero-Transduktion des sich entwickelnden Mausgehirns und des Rückenmarks. J. Vis. Exp. (2019).Dieses Video zeigt die Virustransduktion durch In-utero-Injektion in Mausembryonen. Eine trächtige Maus wird auf die Operation vorbereitet, und es wird ein Mittellinienschnitt gemacht, um die Gebärmutterhörner freizulegen. Eine Mischung aus einem Virus, das das gewünschte Gen enthält, und einem...

In utero Virustransduktion bei einer Maus

Dieses Video beschreibt die pronukleäre Injektion von lentiviralen Vektoren in den perivitellinen Raum eines befruchteten Mausembryos. Das Lentivirus enthält das Transgen, das in das Genom des befruchteten Embryos eingebaut wird und schließlich transgene Mäuse hervorbringt.

Lentivirale vektorbasierte Perivellin-Injektion: Eine Methode zur Transduktion des interessierenden Gens in befruchtete einzellige Maus-Eizellen

In diesem Video demonstrieren wir die lasergestützte Permeation der Schutzschicht der Zona pellucida in Mäuseeiern, um die lentivirale Genübertragung zu erleichtern. Das Lentivirus ermöglicht die Erzeugung transgener Tiere mit einem Gen von Interesse, das stabil in ihr Genom integriert ist.

Lasergestützte lentivirale Genabgabe: Eine Technik zur Permeabilisierung von befruchteten Eiern von Mäusen, um die lentivirale Genübertragung zu erleichtern

Dieses Protokoll zeigt, wie zytoplasmatische Mikroinjektionen in Nutztierzygoten durchgeführt werden. Diese Technik kann verwendet werden, um jede Lösung in den einzelligen Embryo zu bringen, wie z. B. Genom-Editing-Tools zur Erzeugung von Knockout-Tieren.

Lasergestützte Zytoplasmatischen Mikroinjektions in Vieh Zygotes

Konventionelle Verlustfunktion-Studien von Genen mit Knockout-Tiere wurden oft kostspielig und zeitaufwendig. Elektroporation-basierte CRISPR-vermittelte somatische Mutagenese ist ein leistungsfähiges Werkzeug, gen in VivoFunktionen zu verstehen. Hier berichten wir über eine Methode, um Ko-Phänotypen in proliferierenden Zellen des Kleinhirns zu analysieren.

CRISPR-vermittelten Verlust der Funktionsanalyse in zerebelläre Untermodul Zellen mit In Utero Elektroporation-basierte Gentransfer

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Förderung der Transgen-Integration und Herstellung von Gründer Transgene Mäuse mit hoher Wirksamkeit durch eine einfache Injektion eines Lentivirale Vektors in den Perivitelline Raum einer befruchteten Eizelle.

Lentivirale vermittelte Produktion von transgenen Mäusen: eine einfache und hocheffiziente Methode für die direkte Untersuchung der Gründer

Wir beschreiben ein Protokoll für eine Transplantation in Utero (IUT) durch intravenöse und Intra-Fruchtwasser Routen der Injektion in das Mausmodell ausführen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, Zellen, virale Vektoren und anderen Stoffen in die einzigartige immun-toleranten fetalen Umgebung einzuführen.

Intravenöse und Intra-Fruchtwasser In der Gebärmutter Transplantation in den Mausmodell

Dieser Artikel zielt darauf ab, die Methodik für die lentivirale Transgenese bei Rattenembryonen unter Verwendung mehrerer Injektionen einer Virussuspension in den zygoten Perivitelline-Raum bereitzustellen. Weibliche Ratten, die mit einem fruchtbaren männlichen Stamm mit einer anderen dominanten Fellfarbe gepaart werden, werden verwendet, um pseudoschwangere Pflegemütter zu erzeugen.

Generierung transgener Ratten mit einem Lentiviral Vector Ansatz

Hier beschreiben wir eine schnelle und direkte in vivo CRISPR/Cas9 Screening-Methodik mit Ultraschall-geführten in utero embryonalen lentiviralen Injektionen, um gleichzeitig die Funktionen mehrerer Gene in der Haut und Mundhöhle von immunkompetenten Mäusen zu bewerten.

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening zur gleichzeitigen Bewertung der Genfunktion in Maushaut und Oralhöhle

Hier stellen wir ein Protokoll zur Entwicklung genetisch veränderter Mausmodelle mit embryonalen Stammzellen vor, insbesondere für große DNA-Knock-In (KI). Dieses Protokoll wird mithilfe der CRISPR/Cas9-Genom-Editierung optimiert, was zu einer signifikant verbesserten KI-Effizienz im Vergleich zur konventionellen homologen rekombinationsvermittelten linearisierten DNA-Targeting-Methode führt.

CRISPR/Cas9-vermitteltes hocheffizientes Gen-Targeting in embryonalen Stammzellen zur Entwicklung genmanipulierter Mausmodelle

Erfahren Sie die laserunterstützte Lentivirustransduktion zur Gentransfer in befruchtete Mäuseeier. Diese Methode ermöglicht die schnelle Entwicklung transgener Tiermodelle ohne spezialisierte Mikroinjektionsfertigkeiten.

Lasergestützte Lentivirale gen Lieferung an Maus befruchtete Eier

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