Name: Laminektomie und Rückenmarksfenster-Implantation in der Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Lernen Sie die Implantation eines Glasfensters auf das Rückenmark der Maus für intravitalmikroskopische Bildgebung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Proteindynamiken im intakten Zentralnervensystem.

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S.E. Lutz wird vom National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, unter dem Grant KL2TR002002 und den Start-up-Fonds des University of Illinois Chicago College of Medicine unterstützt. Simon Alford wird von RO1 MH084874 unterstützt. Der Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten des NIH dar. Die Autoren danken Dritan Agalliu in der Abteilung für Neurologie am Columbia University Medical Center für die Tg eGFP:Claudin-5 Mäuse, wissenschaftliche Diskussionen und Einblicke in die Entwicklung des chirurgischen Protokolls und bildgebende Anwendungen. Die Autoren danken Sunil P. Gandhi im Department of Neurobiology and Behavior der University of California, Irvine für die Entwicklung des ersten Prototyps des stereotaktischen Apparats und des Tiertemperaturreglers, die Diskussion des operationsischen Protokolls und Ausbildung in der Zwei-Photonen-Mikroskopie. Die Autoren danken auch Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) für die Unterstützung bei der Anpassung des chirurgischen Stereomikroskops und Ron Lipinski (Whale Manufacturing) für die Bearbeitung stereotaktischer Teile.

Alle Experimente folgen den Protokollen des Institutional Animal Care and Use Committee der University of Illinois, Chicago. Dies ist ein Terminalverfahren.
1. Reagenz-Vorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie künstliche zerebrale Rückenmarksflüssigkeit (aCSF) vor, die 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Glucose, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl26H2O, 2 mM CaCl22Oin ddH2O. Sterilfilter und Einfrieren in individuellen Aliquots enthält. ACSF in einem Wasserbad vor Gebrauch auf 39 °C erwärmen.</li>
	<li>Warmer Niedriger Schmelzpunkt Agarose (2%) in einem CSF bis vollständig gelöst in einem Wasserbad auf 65 °C eingestellt. Während der Laminektomie die geschmolzene Agarose aliquot auf 39 °C in einem Wasserbad abkühlen, so dass sie bei der physiologischen Temperatur für Schritt 5.2 bereitstehen kann. Hinweis: Die Agarose-Lösung kann bei -20 °C in Einweg-Aliquots gelagert werden.</li>
	<li>Bereiten Sie sterile 50 mg/ml Carprofen in bakteriostatischem Wasser vor. Bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Reinigen Sie die Deckgläser mit 70% Ethanol, drei Wäschen ddH2O, und lagern Sie trocken in einem staubfreien Behälter.</li>
</ol>2. Backplate 3D-Druck
<ol><li>Verwenden Sie 3D-CAD-Software wird verwendet, um ein Modell für die Abmessungen in Abbildung 1zu erstellen. Der Innenraum ist eine Ellipse am weitesten an der unteren Oberfläche in Bezug auf den Drucker und geschnitten mit einem erhabenen Schnitt zu einer kleineren Ellipse bilden ein Lumen an der gegenüberliegenden Oberfläche. Zwei projizierte Arme mit Löchern, um Schrauben zu akzeptieren, erstrecken sich seitlich, um die Rückplatte zu halten Gabel. Erstellen Sie aus dieser 3D-Struktur eine triangulierte 3D-Netzdatei (. STL-Datei). Hinweis: Siehe Abbildung 1B-D und Zusatzdateien 1 und 2.</li>
	<li>Laden Sie die triangulierte 3D-Netzdatei auf einen 3D-Drucker hoch.</li>
	<li>Drucken Sie Backplates mit einer 0,4 mm Heißenddüse und einer Schichthöhe von 0,2 mm. Wählen Sie Eine Düsentemperatur von 205 °C, eine Betttemperatur von 45 °C und eine Druckgeschwindigkeit von 45 mm/s.</li>
	<li>Bewerten Sie die resultierenden 3D-gedruckten Backplates visuell auf strukturelle Integrität (Abbildung 1E); grobes strukturelles Versagen (fehlendes Lumen, eingestürzte Wand) weist auf Druckfehler hin (Abbildung 1F).</li>
</ol>3. Chirurgische Vorbereitung
<ol><li>Heizen Sie das Heizkissen vor.</li>
	<li>Last Isofluran in die Förderspritze, während sie in einer chemischen Rauchhaube arbeiten. Befestigen Sie die Förderspritze an der Isofluran-Einheit.</li>
	<li>Wählen Sie eine 8-u201212-Woche alte Maus aus. Wiegen Sie das Tier. Induzieren Sie anästhesie mit 2% Isofluran in einer Induktionskammer. Carprofen mit 5 mg/kg subkutan injizieren.</li>
	<li>Positionieren Sie den Nasenkegel und liefern Sie Isofluran bei 2% mit einer Durchflussrate von 150 ml/min für die Aufrechterhaltung einer chirurgischen Anästhesieebene (Abbildung 2A- U2012E). Wickeln Sie das Heizkissen mit einem Einweg-Absorber-Pad für eine einfache Reinigung.</li>
	<li>Positionieren Sie ein Tier auf dem Heizkissen an der chirurgischen Station und installieren Sie den Nasenkegel. Schmieren Sie das Thermometer mit Petroleumgelee und legen Sie es 5 mm in das Rektum. Verkleben Sie die Thermometersonde an den Schwanz, um stabilitätsstabil zu sein. Tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf die Augen der Maus auf.</li>
	<li>Um die Hydratation aufrechtzuerhalten, wenden Sie bis zum Ende des Experiments alle 30 min 200 L laktierte Ringerlösung durch subkutane Injektion an.</li>
	<li>Das Dorsum mit 70% Ethanol besprühen, Fell mit Clippern entfernen und die Stelle mit Povidon-Jod reinigen.</li>
</ol>4. Laminektomie
<ol><li>Positionieren Sie das Tier zwischen den Ohrstangen; diese halten die Kopfposition der Maus in Bezug auf den Nasenkegel.</li>
	<li>Bestätigen Sie, dass das Tier tief beästhetisiert ist, wie durch den Mangel an interdigitalen Pinch-Reflex und stetigen Atemmuster beurteilt.</li>
	<li>Machen Sie einen 1,5 cm rostral-kaudalen Schnitt an der Mittellinie über dem unteren Brust-/Oberen Lendenbereich mit #11 Klinge (Abbildung 2). Trennen Sie die Haut, indem Sie sie mit stumpfer Zahnzange und/oder gehandicapten Fingern erfassen. Verwenden Sie Zangen, um das verbleibende transparente Bindegewebe unter der Haut zu trennen und abzuziehen. Die oberflächliche Muskulatur sollte nun freigelegt werden; mit einem Schaumchirurgischen Speer zu verdrängen.</li>
	<li>Verwenden Sie Schaumchirurgische Speere (oder eine Kurette), um die verbleibende, tiefere Muskulatur des Zielwirbels (thorakal 12) zu entfernen. Um einen Sitz für die Rückwand zu schaffen, auch weg Muskel aus dem hinteren Aspekt der Brust 11, und der vordere Aspekt der Brust 13. Kontrollieren Sie Blutungen, indem Sie sanften Druck mit einem chirurgischen Speer ausüben oder verwenden Sie einen minimalen Puls mit einer Kauterpistole. Weiter, um den verbleibenden Muskel weg von den Sehnen mit Zangen zu entfernen</li>
	<li>Sobald die Muskeln entfernt sind, lösen Sie die Sehnen vorsichtig, indem Sie sie mit Zangen schneiden. Es sollte genügend Platz zum Visualisieren und Manipulieren der Schnur vorhanden sein, wenn dieser Schritt abgeschlossen ist. Prüfen Sie, ob die Dura-Materie des Intervertebral-Raums, der halbtransparente Laminarknochen, das zentrale oberflächliche Blutgefäß unter dem Knochen und die anterior estrahlende Arterie nun deutlich sichtbar sind.</li>
	<li>Befeuchten Sie die Region mit warmem ACSF. Verwenden Sie den Mikrobohrer, um den laminaren Knochen mit geraden Strichen parallel zur langen Achse des Rückenmarks zu verdünnen (Abbildung 2, Abbildung 3). Verwenden Sie auf Wunsch eine Gleitstufe, um die operationschirurgische Plattform für einen verbesserten ergonomischen Komfort zu drehen (z. B. kann ein Rechtshänder die Operationsplattform für den Bohrschritt gegen den Uhrzeigersinn drehen). Hinweis: Die verwendete Gleitstufe besteht aus einer oberen Aluminiumplatte, die in Bezug auf die feste Grundplatte um 15 mm gleitet.</li>
	<li>Greifen Sie vorsichtig den oberflächlichen Spinnprozess mit Zangen und heben Sie den Wirbel; der Knochen sollte leicht wegheben. Wenn es Widerstand gibt, wiederholen Sie die Knochenverdünnung mit dem Bohrer und verwenden Sie bei Bedarf iris Schere, vorsichtig zu zielen die Schere Spitzen nach oben, um zu vermeiden, das Gewebe zu beschädigen. Hinweis: Um die Dura intakt zu halten, ist es wichtig, nicht auf den Knochen zu ziehen.</li>
	<li>Verwenden Sie #4 Zange, um alle Knochenscherben zu löschen. Verwenden Sie einen chirurgischen Speer, um sanften konstanten Druck anzuwenden, um alle Blutungen zu kontrollieren. Gewebe mit warmem aCSF abspülen. Lassen Sie das Gewebe nicht austrocknen.</li>
</ol>5. Abdeckung-Glas-Implantation
<ol><li>Tragen Sie ein 3 mm Borosilikat-Abdeckungsglas vorsichtig auf die freiliegende Schnur auf.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass Agarose auf 39 °C abgekühlt ist. Mit einem kleinen Spachtel warme 2% Agarose/aCSF auf den Rand des Deckglases auftragen und Kapillarwirkung unter die Oberfläche ziehen lassen. Hinweis: Bei Temperaturen unter 39 °C kann die Agarose gelieren. Wenn dies der Fall ist, sollten Sie mit einem Wasserbad oder einer Mikrowelle aufwärmen. Einige Betreiber ziehen es vor, zuerst einen Tropfen Agarose aufzutragen und das Deckglas darüber zu legen.</li>
	<li>Wenden Sie Gewebekleber auf die exponierten knöchernen Gelenkprozesse des intakten benachbarten Wirbels auf Thoraxebene 11 Wirbelwirbelsäule und Brustbruststufe 13 Wirbelwirbelsäule auf. Tragen Sie zusätzlichen Gewebekleber in einem Ring um die Laminektomie-Stelle, über die angrenzende Sehne und Querprozess. Hinweis: Gewebekleber ist für die ordnungsgemäße Haftung des Zahnzementes in den nachfolgenden Schritten erforderlich. Die Gelenkprozesse bilden einen natürlichen Sitz, auf dem die Rückwand stabil ruhen kann (Abbildung 3). Die Haftung an den Gelenkprozessen bildet die stärksten Befestigungspunkte.</li>
	<li>Zahnzement mit Beschleuniger in einem Porzellanmischtablett mischen. Verwenden Sie einen kleinen Spachtel, um Zahnzement auf die Gewebeklebeschicht zu übertragen. Verwenden Sie Dentalzement, um die Rückplatte auf dem chirurgischen Feld zu haften, zentriert über dem Fenster. Lassen Sie 10 Minuten für den Zahnzement zu heilen. Hinweis: Die feste Haftung der Rückplatte an den vorderen und hinteren Gelenkprozessen sorgt für die grundlegende strukturelle Stabilität des Implantats.</li>
	<li>Verwenden Sie zusätzlichen Zahnzement, um die innere Basis der Rückplatte und die Unterseite der Backplate zu füllen: Gewebeschnittstelle. Hinweis: Die zusätzliche Anwendung von Zahnzement verbessert die Haftung und reduziert das Risiko von Leckagen von Mikroskop objektiv tauchflüssigkeit (saline) aus dem Boden der Rückplatte.</li>
	<li>Bringen Sie den gabelten Rückplattenhalter in die entsprechende Position über das Fenster. Befestigen Sie die Rückplatte mit Schrauben in den Rückblechhalter. Hinweis: Dieses Protokoll verwendet einen benutzerdefinierten Backplate-Halter (Abbildung 2G- 2012H).</li>
	<li>Tragen Sie Kochsaline auf die Rückplatte auf, um auf Leckage zu testen. Wenn Flüssigkeit austritt, trocknen Sie den Bereich und tragen Sie mehr Zahnzement auf.</li>
</ol>6. Bildgebungsvorbereitung
<ol><li>Übertragen Sie das Tier auf der chirurgischen Plattform auf den optischen Tisch. Hinweis: Unsere chirurgische Plattform, Backplate Halter und Isoflurane Nasenkegelhalter kann zwischen chirurgischen und zwei-Photon-Bildgebungsstationen als eine Einheit transportiert werden, während kontinuierliche Isoflurananästhesie angewendet werden (Abbildung 2D,H). Ähnliche Einheiten können aus Haltegabeln, Balken und tragenden Säulenpfosten aus kommerziellen Quellen(z.B.. ThorLabs). Für die intravitale Mikroskopie sollte es mindestens 11 Zoll Abstand zwischen dem Mikroskopobjektiv und dem optischen Tisch geben, um die Höhe der chirurgischen Plattform aufzunehmen.</li>
	<li>Befestigen Sie die chirurgische Plattform mit einem Edelstahl-Montagepfosten und einer gegenbohrenden Spanngabel am optischen Tisch.</li>
	<li>Frische Kochwäsche in den Brunnen der Backplate auftragen. Senken Sie eine Wasser-Immersion-Linse in den Brunnen.</li>
	<li>Verwenden Sie übertragenes oder epifluoreszenzlicht, um den Interessenbereich und fokussierend zu identifizieren. Wechseln Sie in den Laser-Scanning-Modus und führen Sie in vivo-Bildgebung entsprechend der entsprechenden Zwei-Photonen-Laser-Erregungswellenlänge, Dichroics und Bandpassfilter für die im Gewebe6vorhandenen Fluorophore durch. </li>
</ol>

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<li>Muthian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COX-2+inhibitors+modulate+IL-12+signaling+through+JAK-STAT+pathway+leading+to+Th1+response+in+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis.</a> Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht eine stabile Bildgebung des Rückenmarks bei Mäusen durch ein Glasfenster. Diese Methode wurde angewendet, um die BBB-Umgestaltung in transgenen eGFP:Claudin5+/- Mäusen zu bewerten, die ein fluoreszierendes BBB-Protein mit fester Verbindung ausdrücken, aber es könnte ebenso gut für Studien von fluoreszierenden Proteinen oder Zellen im Rückenmark angewendet werden.
Es wurden mehrere Methoden zur Laminektomie und Rückenmarksstabilisierung entwickelt. All...

Transgene Tiermodelle, die fluoreszierende Proteine exezieren, bieten in Kombination mit der intravitalen Mikroskopie eine leistungsstarke Plattform für die Auseinandersetzung mit Biologie und Pathophysiologie. Um diese Techniken auf das Rückenmark anzuwenden, sind spezielle Protokolle erforderlich, um das Rückenmark für die Bildgebung vorzubereiten. Eine solche Strategie ist die Durchführung einer Laminektomie und rückenmarksfensterimplantation. Zu den Hauptmerkmalen eines idealen Laminektomieprotokolls für die Mikroskopie gehören die Erhaltung der nativen Gewebestruktur und -funktion, die Stabilität des Bildgebungsfeldes, die schnelle Verarbeitungszeit und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Eine besondere Herausforderung besteht darin, das Bildgebungsfeld gegen die durch Atmung und Herzschlag induzierte Bewegung zu stabilisieren. Mehrere ex vivo und in vivo Strategien wurden berichtet, um diese Ziele zu erreichen1,2,3,4,5. Die meisten In-vivo-Methoden beinhalten das Spannen der Seiten der Wirbelsäule2,4 und wird oft durch die Implantation eines starren Metallapparates3,4 zur Stabilität während der Operation und nachgeschaltete Bildgebungsanwendungen. Das Spannen der Wirbelsäule kann den Blutfluss beeinträchtigen und eine Protein-Umgestaltung der Blut-Hirn-Schranke (BBB) induzieren.
Der Zweck dieser Methode ist es, das intakte Rückenmark für die optische Bildgebung in der lebenden Maus zur Verfügung zu stellen und gleichzeitig die Invasivität des Protokolls zu minimieren und die Ergebnisse zu verbessern. Wir beschreiben ein einziges Laminektomie- und Deckglas-Implantationsverfahren gepaart mit einer minimalinvasiven ovalen 3D-gedruckten 3D-gedruckten Rückplatte, die dennoch eine robuste mechanische Stabilität erreicht. Die Rückplatte wird direkt an den vorderen und hinteren Wirbeldornen mit Zahnzement aufgehalten. Die Rückwand ist mit seitlichen Verlängerungsarmen mit Schraublöchern ausgestattet, die über einen Metallarm fest an der Mikroskopbühne befestigt werden. Dadurch wird der intakte vordere und hintere Wirbel effektiv an der Mikroskopstufe verankert und bietet eine mechanische Beständigkeit gegen das Bewegungsartefakt, das sonst durch Atmung und Herzschlag eingeführt würde. Das Verfahren wurde für die Laminektomie eines einzelnen Wirbels auf Thoraxstufe 12 optimiert, wodurch die In-vivo-Bildgebung in alternativen Stabilitätsstrategien ausgelassen wird. Das Verfahren ist schnell und dauert ca. 30 min pro Maus.
Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Krankheitsmechanismen der BBB zu untersuchen. Das BBB ist ein dynamisches mikrovaskuläres System, das aus Endothelzellen, vaskulären glatten Muskeln, Pericyten und Astrozytenfußprozessen besteht, die eine hochselektive Umgebung für das zentrale Nervensystem (ZNS) bieten. Repräsentative Daten zeigen die Anwendung dieses Protokolls bei transgenen Mäusen, die entwickelt wurden, um verbessertes grünes fluoreszierendes Protein (eGFP) auszudrücken:Claudin-5, ein BBB-Protein mit fester Verbindung. Die mitgelieferten Backplate-Druckdateien können auch für alternative Anwendungen angepasst werden.

<table><tbody><tr><td>3D-Drucker</td><td>Raise3D</td><td>Pro2</td><td>Zum Drucken von Rückplatten</td></tr><tr><td>PLA 3D-Druckfilament</td><td>Inland</td><td>PLA+-175-B</td><td>3D-Druckmaterial aus schwarzem Kunststoff</td></tr><tr><td>3D-CAD-Software</td><td>Dassault Systèmes</td><td>Solidworks-Software</td><td>zum Entwerfen von 3D-Formen</td></tr><tr><td>3D-Druckersoftware</td><td>Raise3D</td><td>Ideamaker-Softwaresoftware</td><td>zur Schnittstelle mit dem 3D-Drucker</td></tr><tr><td>3D-gedruckte ovale Rückplatte</td><td>kundenspezifisch</td><td></td><td>Stabilisierendes Bildgebungsfeld</td></tr><tr><td>Chirurgisches Präpariermikroskop</td><td>Leica</td><td>M205 C</td><td>Ausgestattet mit Leica FusionOptics, Planapo 0,63x Objektiv der M-Serie und Gleittisch</td></tr><tr><td>Mikroskopkamera</td><td>Leica</td><td>MC170</td><td>HD-Farbkamera zur Visualisierung des Operationsfeldes</td></tr><tr><td>Gleittisch</td><td>Leica</td><td>10446301</td><td>Die Gleitstufe besteht aus zwei Metallplatten. Die Grundplatte ist fixiert. Die obere Platte gleitet auf einer gefetteten Schnittstelle, um eine rotierende und lineare Bewegung zu ermöglichen.</td></tr><tr><td>Chirurgische Station und Stabilisierungsgabel</td><td>Whale Manufactoring</td><td>kundenspezifische</td><td>Laminektomie</td></tr><tr><td>SomnoSuite Low-Flow-Isofluran-Verabreichungseinheit</td><td>Kent Scientific</td><td>SS-01</td><td>Chirurgische Anästhesieverabreichung mit integriertem digitalem Verdampfer</td></tr><tr><td>1,5-Zoll-Montagepfosten aus Edelstahl</td><td>ThorLabs</td><td>P50/M</td><td>Zur Montage der Operationsstation auf einem optischen Tisch für die Zwei-Photonen-Bildgebung</td></tr><tr><td>Senkung der Klemmgabel für 1,5" Montage Pfosten</td><td>ThorLabs</td><td>PF175</td><td>Zur Stabilisierung der chirurgischen Station Montage auf optischem Tisch für die Zwei-Photonen-Bildgebung</td></tr><tr><td>Idealer Knochen-Mikrobohrer</td><td>Harvard-Gerät</td><td>72-6065</td><td>Ausdünnung des Knochens für die Laminektomie</td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-10</td><td>Wärmende Kochsalzlösung</td></tr><tr><td>Kauterpistole</td><td>FST</td><td>18010-00</td><td>Kauterisieren minor bleeds</td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>Benchmark</td><td>BF11222</td><td>1,9" x 4,5" Silikonheizung mit 20" Teflonleitungen, 10 W, 5 V,</td></tr><tr><td>thermogekoppelte rektale Sonde vom Typ K</td><td>Physitemp</td><td>RET3</td><td>Messung der Körpertemperatur der Maus</td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Sigma</td><td>8009-03-8</td><td>Rektumsonde zur Schmierung</td></tr><tr><td>Feedback-geregelter thermischer Regler</td><td>kundenspezifisch</td><td>NA</td><td>Zu den kommerziell erhältlichen Alternativen gehört die Physitemp TCAT-Serie</td></tr><tr><td>PVA Chirurgische Augenspeere</td><td>Beaver-visitec international</td><td>40400-8</td><td>Blut absorbieren</td></tr><tr><td>Elektrischer Trimmer</td><td>Wahl</td><td>41590-0438</td><td>Trimmen von Mausfellklingen</td></tr>, <tr><td>#11</td><td>FST</td><td>14002-14</td><td>Chirurgisches Werkzeug</td></tr><tr><td>Pinzette, #5</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td>Chirurgisches Werkzeug</td></tr><tr><td>Pinzette, #4</td><td>FST</td><td>14002-14</td><td>Chirurgisches Werkzeug</td></tr><tr><td>Titatnium Zahnzange</td><td>WPI</td><td>555047FT</td><td>Chirurgisches Werkzeug</td></tr><tr><td>Titan-Iris-Schere</td><td>WPI</td><td>555562S</td><td>Chirurgisches Werkzeug</td></tr><tr><td>Vetbond Gewebekleber</td><td>3M</td><td>084-1469SB</td><td>Vorbereitung der Gewebeoberfläche für dentales</td></tr><tr><td>Acryl Keramikmischtablett</td><td>Jack Richeson</td><td>420716</td><td>Mischen von zahnärztlichem Acrylmittel mit Beschleuniger</td></tr><tr><td>Orthojet dentales Acryl</td><td>Lang Dental</td><td>1520BLK, 1503BLK</td><td>Dauerhafte Bindung der Rückplatte an das Gewebe</td></tr><tr><td>Kleines rundes Deckglas, #1 Dicke, 3 mm</td><td>Harvard-Gerät</td><td>64-0720</td><td>optisches Fenster</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td>Für aCSF</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7447-40-7</td><td>Für aCSF</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-99-7</td><td>Für aCSF</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>Für aCSF</td></tr><tr><td>MgCl2& Mittelpunkt; 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>7791-18-6</td><td>Für aCSF</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>10035-04-8</td><td>Für aCSF</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Rimadyl</td><td>QM01AE91</td><td>Analgesie</td></tr><tr><td>Bakteriostatisches Wasser</td><td>Henry Schein</td><td>2587428</td><td>Verdünnungsmittel für Carprofen</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6776-2</td><td>Anästhesie</td></tr><tr><td>Laktierte Ringerlösung</td><td>Baxter</td><td>0338-0117-04</td><td>Flüssigkeitszufuhr für Maus</td></tr><tr><td>Agarose High EEO</td><td>Sigma</td><td>A9793</td><td>Gelpunkt 34-37 Grad C</td></tr><tr><td>Augenfeuchte Salbe</td><td>Akwa Tears</td><td>68788-0697</td><td>Verhindern Sie das Austrocknen der Hornhaut</td></tr><tr><td>MOM Zwei-Photonen-Mikroskop</td><td>Sutter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

laminektomie und rückenmarksfenster-implantation in der maus

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Rückenmarkslaminektomie und Glasfensterimplantation zur In-vivo-Bildgebung des Mausrückenmarks. Ein integrierter digitaler Verdampfer wird verwendet, um eine stabile Anästhesieebene bei einer niedrigen Durchflussrate von Isofluran zu erreichen. Eine einzelne Wirbelsäule wird entfernt und ein handelsübliches Deckglas auf einem dünnen Agarosebett überlagert. Anschließend wird eine 3D-gedruckte Kunststoff-Rückplatte mit Gewebekleber und Zahnzement an den angrenzenden Wirbeldornen befestigt. Eine Stabilisierungsplattform wird verwendet, um Bewegungsartefakte durch Atmung und Herzschlag zu reduzieren. Diese schnelle und klemmfreie Methode eignet sich gut für die akute Multiphotonenfluoreszenzmikroskopie. Repräsentative Daten sind für eine Anwendung dieser Technik auf die Zwei-Photonen-Mikroskopie der Rückenmarksvaskulatur bei transgenen Mäusen enthalten, die eGFP:Claudin-5 exzessiv exzessiv exzessither exemiten: ein enges Knotenprotein.

Implantierte Glasfenster und die intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie sind ein nützliches Werkzeug zur Beurteilung dynamischer Veränderungen in ZNS-Proteinen. Die funktionelle Integrität des BBB wird durch die Expression, subzelluläre Lokalisierung und Fluktuationsraten von engen Knotenproteinenbeeinflusst 7. Frühere Studien haben gezeigt, dass enge Knotenproteine schnell und dynamisch im stationären Zustand8umgebaut werden. Die derzeit bes...

Dieses Protokoll beschreibt die Implantation eines Glasfensters auf das Rückenmark einer Maus, um die Visualisierung durch intravitale Mikroskopie zu erleichtern.

Laminektomie und Rückenmarksfenster-Implantation in der Maus

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Proteindynamik in vivo innerhalb des intakten Zentralnervensystems, um Fragen in der Neurowissenschaft und Immunologie zu beantworten. Die Hauptvorteile dieses Verfahrens sind eine ausgezeichnete Bewegungsstabilität für die Bildaufnahme, kurze chirurgische Zeit, reduzierte Bedienerexposition gegenüber gasförmiger Anästhesie und kostengünstige anpassbare Backplates. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da es schwierig ist, den Knochen zu entfernen, ohne das eng darunter liegende Gewebe des Nervensystems während der Laminektomieschritte des Verfahrens zu beschädigen.Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, verwenden Sie die vom 3D-Computer unterstützte Entwurfssoftware, um ein Modell für die angegebenen Dimensionen zu erstellen. Wir haben also ein Objekt, das das dreidimensionale Objekt ist, mit dem wir beginnen können. Was ich dann tun kann, ist, dass wir Einstellungen für die Druckversion setzen können.Wenn ich also dies bearbeiten öffne, gehe in Erweitert, öffne ein Fenster, in dem ich alle diese Einstellungen anzeigen kann. Stellen Sie die Düsentemperatur auf 205 Grad Celsius, die Betttemperatur auf 45 Grad Celsius und die Druckgeschwindigkeit auf 45 Millimeter pro Sekunde auf einem 3D-Drucker ein. Verwenden Sie eine 0,4 Millimeter heiße Düse und eine Schichthöhe von 0,2 Millimetern, um die hinteren Platten zu drucken.Bewerten Sie dann die bedruckten Rückplatten visuell auf ihre strukturelle Integrität. Grobe Strukturelle Fehler deuten auf Druckfehler hin. Wenn die Hinterplatten fertig sind, legen Sie den Kopf einer acht bis zwölf Wochen alten anästhesierten Maus auf ein Heatpad zwischen den Ohrstangen eines chirurgischen Restrainers und tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf.Nach der Bestätigung eines Mangels an Reaktion auf Zehenkneifung, verwenden Sie eine Nummer 11 Klinge, um eine 1,5 Zentimeter rostrale zu kaudalen Mittellinie Schnitt über die untere Thorax-Oberlumkörper-Bereich zu machen und trennen Sie die Haut von der Peritoneum. Verwenden Sie Zangen, um das verbleibende transparente Bindegewebe unter der Haut zurückzuziehen, um die oberflächliche Muskulatur freizulegen. Verdrängen Sie die Muskeln mit einem Schaum chirurgischen Speer zusammen mit der verbleibenden tieferen Muskulatur des Zielwirbels.Um einen Sitz für die Rückenplatte zu schaffen, löschen Sie den Muskel vom hinteren Aspekt der Brust 11 und dem vorderen Aspekt von Thorax 13. Mit Zangen, um den verbleibenden Muskel von den Sehnen zu entfernen, wenn nötig. Wenn der gesamte Muskel entfernt wurde, schneiden Sie die Sehnen vorsichtig mit Zangen, bis genügend Platz für die Visualisierung und Manipulation des Rückenmarks erreicht ist.Bestätigen Sie, dass die Dura mater des Intervertebral-Raums, der halbtransparente laminare Knochen, das zentrale oberflächliche Blutgefäß unter dem Knochen und die anterior estrahlende Arterie deutlich sichtbar sind. Befeuchten Sie den Bereich mit warmer künstlicher zerebraler Rückenmarksflüssigkeit und verwenden Sie einen Mikrobohrer, um den laminaren Knochen mit geraden Strichen parallel zur langen Achse des Rückenmarks zu verdünnen. Sanft den oberflächlichen Spinnprozess mit Zangen erfassen, den Wirbel heben.Der Knochen sollte leicht wegheben. Verwenden Sie Nummer vier Zangen, um alle Knochenscherben zu entfernen, jede Blutung mit einem chirurgischen Speer und sanften stetigen Druck bei Bedarf zu kontrollieren. Dann spülen Sie das Gewebe mit warmer künstlicher zerebraler Rückenmarksflüssigkeit ab.Für die Abdeckung Glasimplantation, tragen Sie vorsichtig eine drei Millimeter Borosilikat Abdeckung Glas auf die freiliegende Schnur. Verwenden Sie einen kleinen Spachtel, um 39 Grad Celsius erwärmt 2%Agarose an den Rand des Glases auftragen und Kapillarwirkung erlauben, um die Agarose unter die Abdeckung Glasoberfläche zu ziehen. Gewebekleber auf die exponierten knöchernen Gelenkprozesse des intakten benachbarten Wirbels auf der Brustebene 11 und 13 Wirbeldornen auftragen.Tragen Sie zusätzlichen Gewebekleber in einem Ring um die Laminektomie-Stelle über die angrenzende Sehne und den Querprozess auf. Als nächstes verwenden Sie einen neuen Spachtel, um Zahnzement mit Beschleuniger gemischt auf die Gewebeklebeschicht aufzutragen und legen Sie eine Rückplatte auf das chirurgische Feld zentriert über dem Abdeckungsglasfenster. Das Auftragen mehrerer dünner Schichten von Zahnzement führt zu einer stärkeren Rückplattenhaftung, aber achten Sie darauf, die Hinterplatte schnell zu platzieren, bevor der Zahnzement zu trocknen beginnt.Nachdem Sie den Zahnzement für 10 Minuten aushärten lassen, füllen Sie die Innenbasis und die Unterseite des hinteren Platzes mit zusätzlichem Klebstoff. Das Auftragen des Zahnzements in dünnen Schichten kann dazu beitragen, das Risiko einer Zementausbreitung auf das Deckglas und die Agarose zu reduzieren, was das gesamte Protokoll gefährden kann. Wenn der Zahnzement getrocknet ist, einen gegabelten Rückblechhalter an die entsprechende Position über dem Fenster auftragen und die Rückplatte in den hinteren Plattenhalter schrauben.Dann tragen Sie Kochsaline auf die Hinterplatte auf, um auf Leckage zu testen. Das Tier und die Operationsplattform können dann auf den optischen Tisch eines zwei Photonenmikroskops zur Bildgebung durch das Deckglasfenster übertragen werden. In diesem repräsentativen Experiment wurde EGFP-positives Claudin-5 innerhalb der fluoreszierend dichten Knoten in einem Gefäßplexus visualisiert.Die klare Abgrenzung der engen Anschlussstrukturen in der Z-Projektion zeigt an, dass nach einer erfolgreichen Laminektomie, Fensterplatzierung und Rückplattenimplantation eine minimale XY-Bildverschiebung entsteht. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass diese Mikrochirurgie schwierig ist und einige Zeit in Anspruch nehmen kann. Nach der Beherrschung kann diese Operation jedoch in ca. 30 Minuten durchgeführt werden.Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie zwei Photonenmikroskopie und In-vivo-Bildgebung, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über neurovaskuläre Remodellierung und andere Krankheitsprozesse mit dem Rückenmark zu beantworten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Ein minimal-invasiven Protokoll, um die Maus Wirbelsäule zu stabilisieren und sich...

In-vivo-Imaging von der Maus Spinal Cord mit Zwei-Photonen-Mikroskopie

Die Transplantation von Maus neurale Stammzellen (NSCs) in das Rückenmark von Mäusen mit etablierten Demyelinisierung ist detailliert. Die Vorbereitung der NSCs, die Laminektomie der Brustwirbel 9 (T9), und die Transplantation von NSCs zusammen mit dem Pre-und post-operative Betreuung der Mäuse dargestellt.

Chirurgische Transplantation von Maus Neural Stem Cells in den Rückenmark von Mäusen mit neurotropen Maus Hepatitis Virus infiziert

Dieses Video zeigt ein chirurgisches Verfahren zur Implantation eines Schädelfensters in einem Mausmodell, um einen stabilen optischen Zugang zu verschiedenen Regionen des Gehirns zu ermöglichen.

Implantation eines kranialen Bildgebungsfensters im Mausmodell: Ein chirurgisches Verfahren zur Implantation eines glasbasierten Deckglases für einen stabilen optischen Zugang zu Regionen des Mausgehirns

Dieses Video zeigt die Aufzeichnung der neuronalen Aktivität des Gehirns durch ein optisches Fenster in transgenen Mäusen. Die Mäuse exprimieren ein fluoreszierendes Protein, das den Nachweis neuronaler Aktivitäten ermöglicht. Ein kleiner Teil des Schädels wird vorsichtig entfernt, um ein optisches Fenster zu installieren, und der Schädel wird dann mit schwarzem Zement bedeckt, um das Licht vor der Bildgebung zu blockieren.

Installation von optischen Fenstern im Gehirn transgener Mäuse zur Abbildung neuronaler Aktivitäten

Quelle: Pietruczyk, E. A., et al. Laminektomie und Implantation eines Rückenmarksfensters bei der Maus. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt die Implantation eines Rückenmarksfensters in eine anästhesierte Maus für die in vivo Bildgebung. Das Protokoll stabilisiert das freiliegende Rückenmark mit einem Borosilikat-Deckglas und einer 3D-gedruckten Rückplatte. Diese Methode ermöglicht die hochauflösende Zwei-Photonen-Mikroskopie, um die Dynamik der Blut-Hirn-Schranke und neurovaskuläre...

Implantation eines Rückenmarksfensters in einer Maus für die In-vivo-Bildgebung

Virale Vektoren können für gezielte Genmanipulation. Wir demonstrieren, ein Verfahren zur bedingten Genexpression oder Ablation im Rückenmark der Maus, stereotaktische Injektion unter Verwendung eines viralen Vektors in der dorsalen Horn, ein bekannter Ort der synaptischen Kontakt zwischen primären somatosensorischen Afferenzen und Neuronen des zentralen Nervensystems.

Stereotaktische Injektion eines viralen Vektors für Conditional Gene Manipulation im Maus-Rückenmark

Wir beschreiben eine Methode zur Implantation und Aufrechterhaltung von Glasfenstern über dem freiliegenden Rückenmark erwachsener Mäuse zur Untersuchung der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis. Diese Fenster bieten einen chronischen optischen Zugang zum Rückenmark zur Überwachung der Zelldynamik auf subzellulärer Ebene bei lebenden Tieren mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Implantation von gläsernen Rückenmarksfenstern bei erwachsenen Mäusen mit experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis

Verletzungen des Rückenmarks ist eine traumatische Erkrankung, die schwere Morbidität und hoher Sterblichkeit führt. In dieser Arbeit beschreiben wir im Detail eine Quetschung Modell der Verletzung des Rückenmarks in Mäusen, gefolgt von einer Transplantation von neuralen Stammzellen.

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Gequetscht Modell von Rückenmarksverletzungen

In diesem Video, beschreiben wir ein Verfahren zum Implantieren einer chronischen optischen Abbildungskammer über der dorsalen Rückenmark von einer Live-Maus. Die Kammer, chirurgischen Eingriff und chronische Bildgebung werden überprüft und demonstriert.

Ein Verfahren für die Implantation eines Spinal Kammer für Längs In-vivo- Imaging der Maus Spinal Cord

Dieses Protokoll beschreibt, wie eine präzise Laminektomie für die Induktion von stabilen Querbandverletzungen im Mausmodell mit minimalen Kollateralschäden für die Rückenmarksverletzungsforschung erstellt wird.

Induktion von vollständiger Transektion-Typ Rückenmarksverletzung bei Mäusen

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Entwicklung eines reproduzierbaren Mausmodells des Rückenmarksglioms durch Injektion von Tumorzellen in den Zwischenwirbelraum und bietet damit einen effektiveren und weniger invasiven Ansatz für die Forschung und therapeutische Entwicklung.

Chirurgische Transplantation von Tumorzellen in das Rückenmark von Mäusen

Lernen Sie die Implantation eines Glasfensters auf das Rückenmark der Maus für intravitalmikroskopische Bildgebung. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Proteindynamiken im intakten Zentralnervensystem.

Laminektomie und Rückenmarksfenster-Implantation in der Maus

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