Name: 3-d-Zellkultursystem für die Invasion zu studieren und Bewertung Therapeutika bei Blasenkrebs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Lernen Sie ein 3D-Zellkultursystem zur Untersuchung von Blasenkrebs-Invasion mit Tumorsphäroiden. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Monitoring und die Bewertung therapeutischer Wirkstoffe.

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Die Autoren möchten das Labor von Dr. Howard Crawford (University of Michigan) für technische Unterstützung und Bereitstellung von Materialien und Ausrüstung für diese Studie und Alan Kelleher für den technischen Support zu danken.
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von der University of Michigan Rogel Cancer Center Core Grant CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01A1 (PLP), BCAN Jia (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS) finanziert.

(1) wachsenden Krebs Sphäroide
<ol><li>
Anbau von Zelllinien
	<ol>
<li>Kultur menschlichen Blase Krebszellen unter herkömmlichen Anhänger Zelle Kulturbedingungen und pflegen in einem 37 ° C Inkubator mit 5 % CO2geliefert. Halten Zellen an < 90 % Konfluenz. Hinweis: Kulturmedien verwendet ist Dulbeccos minimalen wesentlichen Medien (DMEM) mit 4,5 g/L D-Glucose, L-Glutamin, 110 mg/L Natrium Pyruvat, modifiziert und mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) in dieses Protokoll geliefert.</li>
		<li>Einen Tag vor Beginn des Experiments, trypsinize (mit 0,25 % Trypsin-EDTA) Zellen, Zellkonzentration zu quantifizieren und 1 x 106 Zellen in 3 mL Kulturmedien in jede Vertiefung eine 6-Well ultraniedriger Befestigungsplatte zu verteilen.</li>
		<li>Inkubieren Sie Zellen in niedrigen Anlage Bedingungen bei 37 ° C ≥16 h. Dies sollte ausreichend Zeit für die Zellen ermöglichen, Aggregat in Sphäroide für die meisten Blase Krebs-Zelllinien. Hinweis: Die Bildung der Sphäroide kann durch invertierte Hellfeld-Mikroskop beobachtet werden. Die optimale Größe und Anzahl der Sphäroide können auf einzelne Experimente abhängen, aber wir finden, dass Sphäroide mit Durchmessern von 50 µm bis 150 µm in der Regel für Zeitraffer-Bildgebung mit einem 20 X Objektiv geeignet sind.</li>
		<li>Weitere Zelltypen, wie z. B. Fibroblasten oder Immunzellen in die Sphäroide integrieren mischen die gewünschten Zellen mit Krebszellen im gewünschten Verhältnis (1:1, 01:10, etc..) in einer ultra-niedrigen Anlage Platte und Inkubation bei 37 ° C ≥16 h Bildung ermöglichen gemischte Zelle Typ Sphäroide.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Anbau von Primärtumoren Hinweis: Tumor Sphäroide auch primäre Blase Tumor abgeleitet werden können Quellen, wie z. B. Tumoren von karzinogen induzierten Blase Tumor Modelle8entwickelt. Zum Beispiel Blase Tumoren erzeugt von Mäusen gefüttert mit N-Butyl - N-(4-Hydroxybutyl) Nitrosaminen (BBN), können geerntet und in kleine Stücke (ca. 0,5 mm3) mit sterilen chirurgischen Instrumenten zerkleinert. Verdaut Primärproben menschliche Blase Krebs auch in diesem System studiert werden können.<ol>
<li>Sammeln und 0,5 mm3 Tumor Stücke in 5 mL eiskaltes Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) waschen. Zentrifugation bei 200 X g für 5 min bei 4 ° C. Wiederholen Sie waschen einmal.</li>
		<li>Sammeln Sie Tumor Stücke durch Zentrifugation bei 200 X g für 10 min bei 4 ° C. Entfernen den überstand und 5 mL DMEM mit 10 % FBS. Übertragen Sie Tumor Sphäroid/Medien Mischung auf eine 6-Well ultraniedriger Befestigungsplatte. Inkubation bei 37 ° C ≥16 h vor dem Einbetten in Kollagen-Matrix (siehe Punkt 2.3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung der 3-d-Kultur-Kammer
<ol><li>
Typ-1-Kollagen (abgeleitet von Rattenschwanz) in DMEM mit 10 % verdünnen FBS, eine Mischung von 2 mg/mL nach Herstellerangaben zu machen.
	<ol>
<li>Kurzum, Kollagen mit entsprechenden Menge 1 N NaOH-Lösung mischen und DMEM durch sanfte pipettieren basiert auf den Anweisungen des Herstellers, physiologischen pH-Wert zu erreichen.</li>
		<li>Nach dem Mischen Kollagen und DMEM schnell Beschichten der Brunnen von der Kammer-Folie (für die meisten Anwendungen, Kammer-Folien mit einem Deckglas Nummer 1.5 ist optimal) mit dem Kollagen-DMEM-Gemisch vor Erstarrung (200 µL/Well). Ermöglichen Sie die beschichteten Kammer Folie stationär bei Raumtemperatur 15 Minuten. Hinweis: Die Zusammensetzung des Kollagen-basierten Matrix kann geändert werden durch Zugabe von anderen extrazellulären Matrix Zutaten wie Fibronektin und Laminin, entsprechend im Sinne des Experiments.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sanft pipettieren 500 µL Medium mit Sphäroide (oder Tumor Stücke, wenn primäre tumorprobe verwendet wird) aus der 6-Well ultraniedriger Befestigungsplatte in eine leere 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Warten Sie 2 min der Sphäroide auf den Boden des Röhrchens abrechnen zu lassen.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig den überstand aus der Tube. Bereiten Sie eine andere Röhre von Typ-1-Kollagen (2 mg/mL) gemischt mit DMEM mit 10 % FBS und schnell die Sphäroide 500 µL dieser Mischung hinzufügen. Mischen Sie vorsichtig die Sphäroide und Kollagen durch langsame pipettieren.</li>
	<li>Geben Sie 250 µL Sphäroide/Kollagen-Mischung in eine Kammer Kollagen-Pre-beschichtete Folie. Lassen Sie die Kollagen-Matrix mit Sphäroide vollständig zu festigen (ca. 30 min bei 37 ° C).</li>
	<li>Nachdem die Kollagenmatrix erstarrt ist, fügen Sie 1 mL DMEM mit 10 % FBS in jede Vertiefung (Abbildung 1B). Inkubieren Sie die Kammer Folie in einem 37 ° C Inkubator bis bereit für die Bildgebung mit 5 % CO2 geliefert.</li>
</ol>(3) Zeitraffer live Cell Imaging
<ol><li>Schalten Sie das konfokale Mikroskop nach den Anweisungen des Herstellers und sicherzustellen Sie, dass der Klimakammer 37 ° C erreicht und wird mit 5 % CO2geliefert. Hinweis: Unser Mikroskop und Kammer erfordern in der Regel 1 h System Gleichgewicht zu erreichen.</li>
	<li>Sorgfältig übertragen der Kammer-Folie auf die Folie-Adapter am Mikroskop befestigt.</li>
	<li>Suchen Sie die Sphäroide mit einem low-Power-Ziel (z. B.5 X) und starten Sie Imaging mit dem Ziel, höhere Macht (in aktuellen Protokoll 20 X Objektiv wird verwendet für die meisten das live Cell Imaging für die bessere Bildqualität). Hinweis: Für primäre Blase tumorproben, können 5 X und 10 X Ziele benötigt werden um größere imaging-Bereich zu decken. Für unsere Zeitraffer-Aufnahmen der bildgebende Intervall wird als 30 min festgelegt und ein Z-Stapel wird verwendet, um das ganze Sphäroid Bild. In der Regel ist der Abstand zwischen Z-Scheiben bis 4 µm eingestellt für die 20 X Objektive und die Gesamtstrecke der Z-Achse ist rund 200 µm. Bilder mit DIC gewonnen werden können und mit Fluoreszenz wenn Gewebe bzw. Zellen fluoreszierende Protein Marker Hafen.</li>
	<li>Durchführen Sie Time-Lapse Bildgebung für 24-72 h. Hinweis: Die Dauer richtet sich nach dem Zelltyp und die Bedürfnisse des Experiments.</li>
</ol>4. Vorbereitung der Probenblock mit Krebs Sphäroide für gefrorenes Gewebe schneiden
<ol><li>Heben Sie vorsichtig den Block der Kollagen-Gel und Sphäroide aus der Kammer Folien mithilfe von kleinen Zange. Platzieren Sie den Kollagen Gel Block in einer Kunststoff-Histologie-Form.</li>
	<li>Spülen Sie das Kollagen-Gel mit 1 X PBS kurz, und dann fix it mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit PBS-Puffer für 30 min bei Raumtemperatur. Achtung: PFA potentiellen karzinogen und sollten mit Vorsicht behandelt werden.</li>
	<li>Waschen Sie dem Kollagen-Gel mit 1,5 mL 1 X PBS auf einen Shaker für 15 min. ersetzen die PBS und wiederholen Sie den vorherigen Waschschritt 3 X.</li>
	<li>Tragen Sie dünn auf (ca. 3 mm) der optimale Arbeitstemperatur (OCT) Verbindung unten eine neue Form der Kunststoff Histologie abdecken. Legen Sie die feste und Betten Sie Kollagen Gel oben auf das Office-Anpassungstool zusammengesetzte gewaschen ein, dann sorgfältig das ganze Gel durch das Ausfüllen der Formwerkzeugs mit zusammengesetzten unter Vermeidung der Bildung von Luftblasen im Office-Anpassungstool OCT.</li>
	<li>Lassen Sie die Form bei 4 ° C für 1 h.</li>
	<li>Legen Sie die Form mit der Probe und OCT Verbindung auf einer 100 mm Petrischale schwimmend auf flüssigem Stickstoff. Lassen Sie die Probe vollständig Schockfrosten.</li>
	<li>Die gefrorenen probenblock bei-80 ° C für eine spätere Verwendung zu speichern.</li>
</ol>5. Immunfluoreszenz Imaging für gefrorene geschnittenen Krebs Sphäroide
<ol><li>Übertragen Sie die gefrorenen probenblock von-80 ° C Gefrierschrank auf-20 ° C-Kammer von einem Kryostat.</li>
	<li>
Führen Sie konventionelle gefrorenes Schneiden durch Festlegen des Intervalls Abschnitt bis 7 µm. Lufteinschlüsse oder geschnittenen Proben an der Glas-Folie ohne Falten befestigen lassen.
	<ol>
<li>Speichern Sie die Folien bei-80 ° C vor der Durchführung weiterer Färbung. Hinweis: Verschiedene Intervalle können zur experimentellen Anforderungen anpassen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Folien für 1 h bei Raumtemperatur Lufttrocknen.</li>
	<li>Permeabilize die Proben mit PBS mit 0,5 % Triton x-100 für 15 Minuten.</li>
	<li>Wash Proben 3 X mit PBS für 10 min pro Waschgang.</li>
	<li>Umschließen Sie die Proben auf der Folie mit hydrophoben Barrieren mithilfe eine hydrophobe Barriere-Pen.</li>
	<li>Behandeln Sie die Proben mit blockierenden Lösung (1 X PBS mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA)), für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Jede Probe auf der Folie zuweisen Sie 40 µL der primäre Antikörper enthaltende Lösung (1 X PBS mit 5 % BSA mit 1: 100 Verdünnung der Primärantikörper).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Folien in der primären Antikörper bei 37 ° C für 1 h oder bei Raumtemperatur über Nacht (Inkubationszeit und Bedingungen variieren je nach Primärantikörper).</li>
	<li>Wash Proben 3 X mit PBS für 15 min (pro Waschgang).</li>
	<li>Jede Probe auf der Folie zuweisen Sie 40 µL sekundäre Antikörper enthaltende Lösung (1 X PBS mit 5 % BSA mit 1: 300 Sekundärantikörper Verdünnung).</li>
	<li>Wash Proben 3 X mit PBS für 15 min (pro Waschgang).</li>
	<li>Färben Sie die Proben mit Hoechst 33342 Lösung (1 µg/mL, verdünnt mit PBS-Puffer) bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Dann waschen Sie Proben mit PBS 5 min.</li>
	<li>Montieren Sie die Proben mit Eindeckmittel und bedecke sie mit entsprechend großen Deckel rutscht. Verlassen Sie die Folien im Dunkeln bei Raumtemperatur für 24 h zu, und führen Sie dann konfokalen Mikroskopie.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Hier beschreiben wir eine 3-d-Tumor-Sphäroid-Modell, die Echtzeit-Beobachtung der Blase Krebs Invasion ermöglicht die für Krebs Progression und Metastasierung von entscheidender Bedeutung ist. Dieses System ist offen für die Einbeziehung der verschiedenen Stromazellen und zellulären Komponenten erlauben Ermittler besser zusammenfassend Gewebe Mikroumgebung wo Blase Krebs Invasion stattfindet. Blase Krebs Sphäroide können aus verschiedenen Quellen wie Zell-Linien (einschließlich genetisch veränderter Zelllinien für die Pr...

Invasion ist ein wichtiger Schritt bei Tumorprogression, die Metastasen gefordert, und ist verbunden mit niedrigeren überleben und schlechter Prognose bei Patienten. In der menschlichen Blasenkrebs, am häufigsten Malignome der Harnwege verursacht etwa 165.000 Todesfälle pro Jahr weltweit, krebsstadium, Behandlung und Prognose direkt das Vorhandensein oder Fehlen von Invasion1beziehen sich auf. Rund 75 % der Fälle von Blasenkrebs werden nicht-Muskel invasive und sind mit lokalen Resektion verwaltet. Im Gegensatz dazu Muskel-invasive Blase Krebs (ca. 25 % aller Fälle) sind aggressive Tumoren mit hoher metastasierendem und werden mit aggressiven Multimodalität Therapie2,3behandelt. Daher ist es wichtig, um das Risiko der invasiven Progression besser charakterisieren und therapeutische Interventionen zu entwickeln, die invasive Fortschreiten verhindern können, Verständnis der molekularen Signalwege, die Invasion auslösen.
Invasive Tumorprogression tritt in einem komplexen Umfeld für dreidimensionale (3D) und beinhaltet Tumor Zelle Interaktion mit anderen Tumorzellen, Stroma, Basalmembran und andere Arten von Zellen wie Immunzellen, Fibroblasten, Muskelzellen und vaskuläre Endothelzellen. Durchlässige Unterstützung (z.B.Transwell) Assay-Systeme werden häufig eingesetzt, um Krebs Zelle Invasion4, aber diese Systeme quantitate sind begrenzt, weil sie nicht erlauben, mikroskopische Überwachung des Invasion in Echtzeit und die Entnahme von Proben für weitere Färbung und molekulare Analyse ist eine Herausforderung. Entwicklung eines 3-d-Blase Tumor Sphäroid Invasion zu studieren ist wünschenswert, weil dadurch die Aufnahme von definierten microenvironmental Komponenten mit dem Komfort einer in-vitro- Systeme.
In diesem Protokoll beschreiben wir ein System, um die invasiven Prozesse der menschlichen Blase Krebszellen mit einem 3-d-Sphäroid Invasion Assay mit Kollagen-basierten Gel Matrizen und konfokalen Mikroskopie damit Ermittler Zelle Motilität überwachen zu verhören und Invasion in Echtzeit (Abb. 1A). Dieses System ist vielseitig und kann geändert werden, um verschiedene Stromatumoren Tumor/Einstellungen zu befragen. Es kann die meisten Blase Krebs-Zell-Linien oder primäre Blase Tumoren und zusätzliche Stromazellen Zellen enthalten, wie z. B. Krebs Fibroblasten und Immunzellen5,6,7verbunden. Dieses Protokoll beschreibt eine Matrix, bestehend aus Kollagen Typ 1, aber kann geändert werden, um andere Moleküle wie FIBRONEKTIN, Laminin oder andere Proteine Kollagen zu integrieren. Invasive Verfahren können für 72 h oder länger je nach der Fähigkeit, das Mikroskop und das verwendete verfolgt werden. Fixierung und Immunfluoreszenz-Färbung des Tumors in der 3-d-Matrix eingebettet, vor, während und nach dem Einmarsch ermöglicht das Verhör von Proteinen hochreguliert in invasive Zellen, wodurch wichtige Informationen, die normalerweise nicht vorhanden oder schwierig zu sammeln Verwendung von anderen 3-d-Kultur-Modellen. Dieses System kann auch genutzt werden, zu Bildschirm-Verbindungen, die Invasion zu blockieren und Signalwege, die solche Verbindungen betroffen abzugrenzen.

<table><tbody><tr><td>Humane Blasenkrebs-Zelllinien UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM-Zellkulturmedium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 26140079</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 15240062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%), Phenolrot</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6-Well-Cluster mit ultral-niedrigem Aufsatz&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>Konventionelles inverses Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td>491206-0001-000</td><td>Allgemeine Verwendung zur Zellkultur und Überprüfung von Sphäroiden</td></tr><tr><td>Kollagen Typ 1 aus Rattenschwanz, hohe Konzentration</td><td>Corning</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>155382</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td> mit Deckglas<td>Carl Zeiss</td><td>LSM800</td><td>Ein konfokales Miskoskop mit Klimakammer, Multi-Location-Imaging und Z-Stack-Scanfunktion&nbsp;</td></tr><tr><td>Kryostat Mikromtome</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Zen 2 Bildverarbeitungssoftware&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd-Lösung</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge Hydrophobe Barriere PAP Pen</td><td>Vector Laboratories&nbsp;</td><td>H4000</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.-Mischung&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23730571</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 Lösung&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ATDC (Trim29) Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA020053</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cytokeratin 14 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab7800</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Vimentin Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab24525</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond</td><td></td><td></td><td>Einbettmedium</td></tr></tbody></table>

3-d-zellkultursystem für die invasion zu studieren und bewertung therapeutika bei blasenkrebs

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

Blasenkrebs ist eine erhebliche gesundheitliche Problem. Es wird geschätzt, dass mehr als 16.000 Menschen in diesem Jahr in den Vereinigten Staaten von Blasenkrebs sterben. Während 75 % der Krebserkrankungen der Blase sind nicht-invasiv und unwahrscheinlich zu metastasieren, Fortschritte machen etwa 25 % ein invasives Wachstum Muster. Bis zur Hälfte der Patienten mit invasiven Krebsarten entwickeln tödliche Metastasen Rückfall. Daher ist es entscheidend, Vorhersagen, Behandlungsergebnisse zu vermeiden tödliche Metastasen, Verständnis des Mechanismus der invasiven Progression bei Blasenkrebs. In diesem Artikel präsentieren wir ein dreidimensionales Krebs Invasion Modell, das ermöglicht die Einbindung von Tumorzellen und Stromazellen Komponenten, in Vivo Bedingungen, die in der Blase Tumor Mikroumgebung zu imitieren. Dieses Modell bietet die Möglichkeit, den invasiven Prozess mit Zeitraffer Bildgebung in Echtzeit beobachten, befragen die molekulare Bahnen beteiligt mit konfokale immunofluorescent Bildgebung und Bildschirm-Verbindungen mit dem Potenzial, Block-Invasion. Während dieses Protokoll auf Blasenkrebs konzentriert, ist es wahrscheinlich, dass ähnliche Methoden zur Untersuchung von Invasion und Motilität in sowie andere Tumorarten eingesetzt werden könnte.

Erfolgreiche Gestaltung von invasiven Blase Krebs Tumor Sphäroid erfordert die Bildung von geeigneter Größe Tumor Sphäroide aus Zell-Linien oder Primärtumoren. Abbildung 2 A zeigt entsprechend dimensionierte Sphäroide aus vier menschliche Blase Krebszelllinien (UM-UC9, UM UC13, UM UC14, 253J und UM UC18) entwickelt. Abbildung 2 B zeigt ein Tumor Sphäroid von einem BBN generiert Maus Blase Tumor i...

Die Prozesse für die Blase Krebs Invasion darstellen Biomarker und therapeutische Entwicklungsmöglichkeiten. Hier präsentieren wir eine Blase Krebs Invasion Modell mit 3-d-Kultur der Tumor Sphäroide, Time-Lapse Bildgebung und konfokalen Mikroskopie. Diese Technik ist nützlich für die Definition der Merkmale des invasiven Verfahrens und für das screening von Therapeutika.

3-d-Zellkultursystem für die Invasion zu studieren und Bewertung Therapeutika bei Blasenkrebs

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Die invasive Progression ist eine entscheidende Determinante für das klinische Ergebnis bei Patienten mit Blasenkrebs. Im Folgenden wird eine einfache in vitro Methode beschrieben, bei der Tumorsphäroide, die aus Zelllinien oder Primärtumoren erzeugt wurden, zur Untersuchung der Invasion verwendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir in der Lage sind, den Prozess der Krebsinvasion in Echtzeit zu überwachen und die Proben am Ende des Experiments auch mit Immunfluoreszenzfärbung zu befragen.Diese Technik kann so angepasst werden, dass sie andere Zelltypen wie Fibroblasten- oder Immunzellen einbezieht. Es kann auch verwendet werden, um Verbindungen zu testen, die nützlich sein könnten, um die Invasion zu blockieren. Zu den kritischen Faktoren für den Erfolg gehören die Optimierung der Sphäroidbildung des Tumors und die Einbettung in das Kollagen, die Verwendung einer geeigneten Mikroskopie mit korrektem Arbeitsabstand und geeigneter Immunfärbeverfahren.Um mit der Erzeugung von Sphäroiden aus Zelllinien zu beginnen, werden menschliche Blasenkrebszellen unter herkömmlichen Adhärenz-Zellkulturbedingungen kultiviert. Einen Tag vor dem Experiment trypsinisieren Sie die Zellen und verteilen Sie 1.000.000 Zellen in drei Millilitern Zellkulturmedien auf jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen anschließend mindestens 16 Stunden lang bei niedrigen Anhaftungsbedingungen bei 37 Grad Celsius.Um Sphäroide aus Primärtumoren zu erzeugen, sammeln und waschen Sie 0,5 Millimeter kubisierte Tumorstücke in fünf Millilitern eiskaltem PBS. Zentrifugieren Sie die Tumorstücke bei 200-facher G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Danach entnehmen Sie die Tumorstücke durch Zentrifugation bei 200 mal G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.Entfernen Sie dann den Überstand und fügen Sie fünf Milliliter DMEM hinzu, ergänzt mit 10 % FBS. Übertragen Sie das Tumor-Sphäroid-Mediengemisch auf eine Sechs-Well-Platte mit extrem niedrigem Attachment. Inkubieren Sie die Platte dann mindestens 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius.Verdünnen Sie zunächst Typ-1-Kollagen in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, um eine Mischung von zwei Milligramm pro Milliliter herzustellen. Dann bestreichen Sie die Vertiefungen eines Kammerobjektträgers schnell mit der Mischung. Halten Sie den Kammerschieber 15 Minuten lang bei Raumtemperatur stationär.Pipettieren Sie danach vorsichtig 500 Mikroliter Sphäroidmedium von der extrem niedrigen Aufsatzplatte in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Lassen Sie dann die Sphäroide zwei Minuten lang am Boden des Röhrchens absetzen. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand aus dem Röhrchen.Geben Sie dann schnell 500 Milliliter frische Kollagen-DMEM-Mischung zu den Sphäroiden. Pipettieren Sie auf und ab, um die Sphäroide und das Kollagen vorsichtig zu mischen. Geben Sie als nächstes 250 Mikroliter der sphäroiden Kollagenmischung in die Vertiefungen des mit Kollagen beschichteten Kammerobjektträgers.Lassen Sie die Kollagenmatrix, die das Sphäroid enthält, vollständig verfestigen. Nachdem sich die Kollagenmatrix verfestigt hat, geben Sie einen Milliliter DMEM, ergänzt mit FBS, in jede Vertiefung der Kammerobjektträger. Dann inkubieren Sie den Kammerobjektträger bei 37 Grad Celsius mit 5% CO2.Bereiten Sie das Konfokalmikroskop gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und stellen Sie sicher, dass die Klimakammer 37 Grad Celsius erreicht und mit 5% CO2 versorgt wird. Übertragen Sie dann den Kammerobjektträger auf den Objektträgeradapter. Lokalisieren Sie mit einem Objektiv mit geringer Leistung die interessierenden Sphäroide, beginnen Sie dann mit der Bildgebung mit einem Hochleistungsobjektiv und führen Sie eine Zeitrafferbildgebung für 24 bis 72 Stunden durch.Heben Sie zunächst mit einer kleinen Pinzette den Block aus Kollagengel und Sphäroiden vom Kammerschieber an. Legen Sie dann den Kollagen-Gel-Block in eine Histologie-Kunststoffform. Spülen Sie den Kollagen-Gel-Block mit 1x PBS kurz aus.Und fixieren Sie es mit 4% PFA und PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie danach den Kollagen-Gel-Block mit 1,5 Millilitern 1x PBS auf einem Shaker für 15 Minuten. Tragen Sie eine dünne Schicht OTC-Verbindung auf den Boden einer neuen Histologieform aus Kunststoff auf.Legen Sie dann den fixierten und gewaschenen Kollagengelblock auf die OTC-Verbindung, bevor Sie den Rest der Form vorsichtig mit OTC-Verbindung füllen. Halten Sie die Form eine Stunde lang bei vier Grad Celsius. Danach frieren Sie die Form auf einer 100 Millimeter großen Petrischale, die auf flüssigem Stickstoff schwimmt, ein und lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius.Bringen Sie den gefrorenen Probenblock in die minus 20 Grad Celsius Kammer eines Kryostaten. Führen Sie dann den konventionellen Tiefkühlschnitt mit einem Schnittintervall von sieben Mikrometern durch. Danach trocknen Sie die Objektträger eine Stunde lang bei Raumtemperatur an der Luft.Dann permeabilisieren Sie die Proben 15 Minuten lang mit PBS mit 0,5 % Triton X-100. Waschen Sie anschließend die Proben dreimal für jeweils 10 Minuten mit PBS. Umkreisen Sie dann die Proben mit einem hydrophoben Barrierestift.Behandeln Sie die Proben eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit Blocklösung. Tragen Sie dann 40 Mikroliter der mit einem Primärantikörper haltigen Lösung auf jede Probe auf. Inkubieren Sie die Objektträger eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.Waschen Sie die Probe danach dreimal 15 Minuten lang pro Waschgang mit PBS. Tragen Sie anschließend 40 Mikroliter Sekundärantikörper, die Lösung enthalten, auf jede Probe auf. Waschen Sie die Proben dann dreimal mit PBS für 15 Minuten pro Waschgang.Die Probe wird 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit der Lösung Hoechst 33342 gefärbt. Waschen Sie dann die Proben fünf Minuten lang mit PBS. Montieren Sie die Proben mit Eindeckmedium und decken Sie sie mit Deckgläsern ab.Lassen Sie die Objektträger schließlich 24 Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln, bevor Sie die konfokale Mikroskopie durchführen. In diesem Protokoll wurden invasive Blasenkrebstumor-Sphäroide aus Zelllinien und Primärtumoren gebildet. Ein repräsentatives Zeitraffervideo zeigt die Invasion von Blasenkrebstumoren in die Kollagenmatrix.Ein repräsentatives Zeitraffervideo zeigt das invasive Verhalten von GFP-markierten Blasenkrebstumor-Sphäroiden allein oder in Co-Kultur mit RFP-markierten Fibroblasten. Um die Machbarkeit der Immunfluoreszenzfärbung von Proteinmarkern zu demonstrieren, wurden die Sphäroide fixiert, geschnitten und nach 24 oder 72 Stunden gefärbt. Die Ansicht der UM-UC-14-Sphäroide mit höherer Vergrößerung zeigt eine filamentöse Färbung für Ataxia-Teleangiektasie-assoziiertes Protein der Gruppe D.Die hochinvasiven Zellen, die nach 24 Stunden Invasion aus UM-UC-18-Sphäroiden disseminiert wurden, exprimieren einen hohen Spiegel an Vimentin, einem Marker für den Übergang von Epithel zu Mesenchym. Dieser Assay ist nützlich für begrenzte Screenings von pharmakologischen Inhibitoren der Blasenkrebsinvasion. Cytochalasin D wird hier verwendet, um die pharmakologische Hemmung der Invasion darzustellen.Hier beschreiben wir ein Modell, das eine Echtzeit-Beobachtung der Invasion von Blasenkrebs ermöglicht. Dieses System ist für den Einbau verschiedener stromaler und zellulärer Komponenten geeignet, was es den Forschern ermöglicht, die Mikroumgebung des Gewebes, in der die Blasenkrebsinvasion stattfindet, besser zu rekapitulieren. Dieses System bietet nicht nur ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung der Invasion in einer 3D-Umgebung, sondern eignet sich auch für ein begrenztes Screening von pharmalogischen Verbindungen, die das Potenzial haben, die Invasion von Krebszellen zu blockieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Interstitielle Fluidstrom wird in soliden Tumoren erhöht und modulieren kann Tumorzellinvasion. Hier beschreiben wir eine Technik, um interstitielle Flüssigkeit fließen, um Zellen in einer Matrix eingebettet zu bringen und dann die seine Auswirkungen auf Zellinvasion. Diese Technik kann leicht angepasst werden, um andere Systeme zu studieren.

Dreidimensionale Zellkultur-Modell zur Messung der Auswirkungen der interstitiellen Flüssigkeit Flow auf Tumorzellinvasion

Dieses Video bietet eine detaillierte Methodik zur Züchtung von Brustkrebszellen in einer 3D-Basalmembran-Proteinmatrix, die das Potenzial der 3D-Kultur bei der Beurteilung der Zellinvasion in die Umgebung veranschaulicht.

3D-Kultur-Basalmembran-Assay: Kultivierung von Krebszellen auf einer 3D-Basalmembran-Proteinmatrix zur Untersuchung der Zellinvasion

Dieser Artikel enthält detaillierte Methoden für die Verwendung von dreidimensionalen (3D-) Assays auf Brustkrebszellinvasion zu quantifizieren. Insbesondere diskutieren wir die Verfahren erforderlich, um solche Tests einrichten, Quantifizierung und Datenanalyse, sowie Methoden, um den Verlust der Membranintegrität, die bei Zellen eindringen tritt zu untersuchen.

Quantifizierung der Brustkrebs-Zelle Invasivität Mit einem Drei-dimensionale (3D) Modell

Die Invasion des umgebenden normalen Gewebes ist ein definierendes Merkmal von bösartigen Tumoren. Wir stellen hier einen einfachen, halbautomatischen Mikroplatten-Assay der Invasion in eine natürliche 3D-Biomatrix zur Verfügung, der mit einer Reihe von Modellen fortgeschrittener menschlicher Krebsarten veranschaulicht wurde.

Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay

Diese Methode bewertet die Invasion von Krebszellen von Sphäroiden in eine umgebende 3D-Matrix.  Sphäroide werden über die Methode der hängenden Tropfenkultur erzeugt und dann in eine Matrix eingebettet, die aus Basalmembranmaterialien und Kollagen vom Typ I besteht.  Die Invasion aus den Sphäroiden wird anschließend überwacht.

Eine Krebszelle Spheroid Assay zur Invasion in einem 3D-Rahmen Beurteilen

Krebszellen werden in ein Kollagengel eingebettet und dann in ein azelluläres Fibringel eingebettet, um ein 3D-Kultursystem zu erzeugen, in dem die Invasivität und Bildung von Satellitentumoren überwacht werden kann.

Dreidimensionale Kulturtest auf Krebszelle Invasivität und Satelliten Tumorbildung erkunden

Dieses Protokoll enthält detaillierte experimentelle Schritte zur Etablierung einer dreidimensionalen In-vitro-Kultur von Blasentumororganoiden, die aus krebserregendem murinen Blasenkrebs gewonnen werden. Kulturmethoden wie Passaging, Gentechnik und orthotopische Transplantation von Tumororganoiden werden beschrieben.

Kultur, Manipulation und orthotopische Transplantation von Mausblase Tumororganoiden

Der vorgestellte Ansatz bewertet gleichzeitig die Krebszellinvasion in 3D-Sphäroid-Assays und t-Zell-Zytotoxizität. Sphäroide werden in einem gerüstfreien Agarose-Multi-Mikrowell-Guss erzeugt. Co-Kultur und Einbettung in Typ I Kollagenmatrix werden innerhalb des gleichen Geräts durchgeführt, das Krebszellinvasion und T-Zell vermittelte Zytotoxizität zu überwachen ermöglicht.

Überwachung der Krebszellinvasion und T-Zell-Zytotoxizität in der 3D-Kultur

Patientenabgeleitete Organoide (PDOs) sind ein leistungsfähiges Werkzeug in der translationalen Krebsforschung, das sowohl die genetische als auch die phänotypische Heterogenität der Krankheit und das Ansprechen auf personalisierte Krebstherapien widerspiegelt. Hier wird ein konsolidiertes Protokoll zur Erzeugung von PDOs für primären Blasenkrebs beim Menschen in Vorbereitung auf die Bewertung von phänotypischen Analysen und Arzneimittelreaktionen detailliert beschrieben.

Kultur von Blasenkrebs-Organoiden als Werkzeuge der Präzisionsmedizin

Wir beschreiben einen Ansatz zum Nachweis und zur Erfassung invasiver Zellsubpopulationen in Echtzeit. Das experimentelle Design verwendet die Echtzeit-Zellanalyse, indem Änderungen in der elektrischen Impedanz von Zellen überwacht werden. Invasive Krebs-, Immun-, Endothel- oder Stromazellen in komplexen Geweben können eingefangen und die Auswirkungen von Kokulturen beurteilt werden.

Echtzeit-Detektion und Erfassung invasiver Zellsubpopulationen aus Co-Kulturen

Die Invasion ist ein wichtiges biologisches Phänomen bei der Entstehung und dem Fortschreiten von Krebs. Dieser Prozess wird durch nicht-neoplastische Zellen und Bestandteile der Tumormikroumgebung beeinflusst. Das Ziel dieser Arbeit ist es, eine alternative Methode zur Analyse der Tumorzellinvasion in vitro mit Hilfe von dreidimensionalen (3D) Kulturen zu beschreiben.

Alternative Strategie zur Analyse der in vitro Zellinvasion von 3D-Kulturen

Lernen Sie ein 3D-Zellkultursystem zur Untersuchung von Blasenkrebs-Invasion mit Tumorsphäroiden. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Monitoring und die Bewertung therapeutischer Wirkstoffe.

3-d-Zellkultursystem für die Invasion zu studieren und Bewertung Therapeutika bei Blasenkrebs

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