Erkennung von 3-Nitrotyrosine in atmosphärischen Umgebungen über eine High-Performance Liquid Chromatography-elektrochemischen Detektor-System
30. Januar 2019
Wir präsentieren Ihnen eine Methode, um 3 Nitrotyrosine chemische Veränderungen der atmosphärischen Proteine mit 6 mm Durchmesser runden Schnitt von Luft Sampler Tiefenfilter mit einem Hochleistungs-flüssige Chromatographie-elektrochemischen Detektor (HPLC-ECD) zu erkennen.
Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Umweltforschung über Nitrapyrin und 3-Nitrotyrosin zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es sich um eine einzigartige und hochempfindliche Methode zum Nachweis von 3-Nitrotyrosin auf Luftprobenfiltern handelt. Um scheineteilchen partikel- oder partikelmäßig mit einer Größe von weniger als sieben Mikrometern zu sammeln, wiegen Sie zunächst einen Bindemittel-3-Quarzfilter und sichern ihn an einem Luftprobennehmer mit hohem Volumen. Bedecken Sie den Filter mit einem Partikelgrößenwähler, um PM7 zu sammeln, oder lassen Sie den Filter unbedeckt, um die gesamten Schwebstoffpartikel zu sammeln. Führen Sie den Luftprobenehmer sieben Tage lang kontinuierlich mit 1000 Litern pro Minute aus. Laden Sie die Vorfilter in eine Größenklassifizierungseinheit und installieren Sie die Größenklassifizierungseinheit und einen Sicherungsfilter auf dem Luftsampler mit geringem Volumen. Führen Sie den Luftprobenehmer sieben Tage lang kontinuierlich mit 116 Würfen pro Minute aus, um PM2.5 auf dem Sicherungsfilter zu sammeln. Wenn die Probenahme abgeschlossen ist, wird das gesamte Durchflussvolumen erfasst. Wiegen Sie den Filter und berechnen Sie das Gewicht der gesammelten Partikel. Versiegeln Sie den Filter in einer Plastiktüte und lagern Sie ihn bei 30 Grad Celsius. Als nächstes 500 Mikroliter 6X unspezifischen Protease-Cocktail und Acetatpuffer vorbereiten und in eine Dalasismembran mit einem Molekulargewicht Cutoff von 5000 Daltonen legen. Tauchen Sie die gefüllte Membran in 1 L des Acetatpuffers ein und rühren Sie sie 24 bis 36 Stunden lang bei 4 Grad Celsius, indem Sie den Puffer alle 12 Stunden ersetzen, um indogenöses 3-Nitrotyrosin und Nitrit zu entfernen. Danach entfernen Sie einen Filter aus dem Gefrierschrank und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur erwärmen, während noch in der Tasche versiegelt. Dann stanzen Bis zu fünf 6 Millimeter breite Kreise aus dem Partikelbedeckten Bereich des Filters und legen Sie die Kreise in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr. Bereiten Sie 300 Mikroliter Acetatpuffer mit 50
Übersicht
Dieser Artikel stellt eine hochsensible Methode zur Detektion von 3-Nitrotyrosin-Modifikationen in atmosphärischen Proteinen unter Verwendung von Vorfilteln aus Luftprobenahmegeräten vor. Die Technik nutzt die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit elektrochemischer Detektion (HPLC-ECD) zur Analyse der gesammelten Proben.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Umweltforschung
- Analytische Chemie
- Atmosphärenwissenschaft
Hintergrund
- 3-Nitrotyrosin ist ein Marker für oxidativen Stress und Umweltschadstoffe.
- Die Nachweis dieser Modifikation kann Erkenntnisse über die Luftqualität und gesundheitliche Auswirkungen liefern.
- Aktuelle Methoden weisen möglicherweise eine unzureichende Empfindlichkeit oder Spezifität für atmosphärische Proben auf.
- Ziel dieser Studie ist es, die Nachweismethoden zur Verbesserung der Umweltüberwachung zu optimieren.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer empfindlichen Methode zum Nachweis von 3-Nitrotyrosin in Luftproben.
- Verbesserung des Verständnisses atmosphärischer Proteinmodifikationen.
- Beitrag zur Umweltforschung über Schadstoffe wie Nitrapyrin.
Verwendete Methoden
- Probenahme von Luftproben mithilfe von Hochvolumen-Luftprobenahmegeräten.
- Verwendung von Quarzfiltern zur Erfassung von Partikeln.
- Dialyse der Proben zur Entfernung störender Substanzen.
- Bestimmung der Proteinkonzentration mittels einer Bicinchoninsäure-Analyse.
Hauptergebnisse
- Die Methode weist 3-Nitrotyrosin mit hoher Empfindlichkeit erfolgreich nach.
- Die Ergebnisse zeigen signifikante Konzentrationen von 3-Nitrotyrosin in atmosphärischen Proben an.
- Die Technik ist reproduzierbar und zuverlässig für die Umweltüberwachung.
- Die Befunde unterstützen weitere Untersuchungen zu den Auswirkungen von Luftschadstoffen.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode stellt ein wertvolles Werkzeug für Umweltforscher dar.
- Sie kann dabei helfen, die Auswirkungen der Luftqualität auf die Gesundheit zu bewerten.
- Zukünftige Studien könnten die Bedeutung der 3-Nitrotyrosin-Detektion weiter ausbauen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht den empfindlichen Nachweis von 3-Nitrotyrosin, einem Biomarker für oxidativen Proteinschaden, in atmosphärischen Feinstaubpartikeln. Sie unterstützt die Umweltgesundheitsforschung, indem sie die Luftqualität mit molekularen Biomarkern für Entzündungen und allergenes Potenzial verknüpft. Der Assay liefert quantitative Daten, die für die mechanistische Risikominimierung in pulmonalen und immunotoxikologischen Studien nützlich sind.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von Oxidativstresswegen in Modellen, die Bioaerosolen ausgesetzt sind.
- Operativer Wert: Liefert einen Biomarker-Output für die Proteinnitrierung in komplexen Umweltgemischen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die quantitative Messung von 3-NT mittels HPLC-ECD mit einer Empfindlichkeit von pg/m³.
- Operationeller Wert: Verwendet standardisierte Filterproben und Proteaseverdauung für eine reproduzierbare Probenvorbereitung.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet die Exposition gegenüber umgebungsbedingtem PM mit nachweisbaren Proteinmodifikationen in für die Lunge relevanten Modellen.
- Operativer Wert: Unterstützt den vergleichenden Ansatz zwischen Studien hinsichtlich der oxidativen Belastung über verschiedene Partikelgrößenfraktionen hinweg.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode passt in frühe Entdeckungsworkflows, bei denen Umweltfaktoren hinsichtlich ihrer mechanistischen Relevanz für Atemwegs- oder Immunwege bewertet werden.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung bezüglich ozon- und NO2-getriebener Proteinnitrierung in Lungenmodellen.
- Screening: Ermöglicht die Gewinnung von analysenfertigen Proben aus PM2,5-Sammelfiltern für Biomarker-Screenings.
- Analytik: Bietet chromatographische Trennung und elektrochemische Detektion zur spezifischen Quantifizierung von 3-NT.
- Translationale Forschung: Verbindet Daten zu atmosphärischer Exposition mit molekularen Initiierungsevents in oxidativen Stresswegen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Die HPLC-ECD-Plattform kann für andere posttranslationale Modifikationen in Umweltproben angepasst werden.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Mechanistische Entlastung durch biomarkerunterstützte kausale Zusammenhänge zwischen Luftschadstoffen und Proteinschäden.
- Operativer Wert: Hohe Empfindlichkeit (1,13 pg/m³) ermöglicht den Nachweis in Umweltproben mit geringer Konzentration.
- Strategischer Wert: Unterstützt die Risikobewertung durch Quantifizierung einer spezifischen oxidativen Modifikation in komplexen Gemischen.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen in Programmen, die auf umweltbedingte Atemwegserkrankungen abzielen.
Durchführungsaspekte
- Kenntnisse in der Proteolyse, Dialyse und Bedienung der HPLC-ECD.
- Zugang zu Luftprobenahmesystemen mit geringem Probenvolumen, Größenklassifizierern und Protease-Digestionssystemen.
- Standardisierung der Filterprobengröße, Pufferbedingungen und Dauer der Dialyse.
- Überlegungen zur Anpassung an unterschiedliche Partikelgrößen und Proteingehalte.
- Praktische Einschränkung: Erfordert die Entfernung endogenen 3-NT und Nitrits durch verlängerte Dialyse.
Biopharma-Häufige Fragen
Chapters in this video
0:04
Title
0:28
Collection and Hydrolysis of Proteins in Particulate Matter (PM)
3:59
Determination of 3-Nitrotyrosine (3-NT) Content via a High-Performance Liquid Chromatography and Electrochemical Detection (HPLC-ECD) System
6:06
Results: Detection of 3-NT in PM2.5, PM7, and Total Suspended Particle (TSP) Samples Using HPLC-ECD
7:19
Conclusion
