Name: Katalytische Spülung der Anlage reaktive Sauerstoff Spezies In Vivo von anionischen Cerium-oxid-Nanopartikel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Erfahren Sie die Synthese und Charakterisierung von Ceriumoxid-Nanopartikeln zur katalytischen Elimination reaktiver Sauerstoffspezies in vivo bei Arabidopsis thaliana. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung pflanzlicher Stresssignale.

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Diese Arbeit wurde von der University of California, Riverside und USDA nationalen Institut für Lebensmittelwissenschaften und Landwirtschaft, Luke Projekt 1009710 JPG unterstützt. Dieses Material basiert auf Arbeit, unterstützt von der National Science Foundation unter Grant Nr. 1817363 zu JPG

1. A. Thaliana Pflanzen
<ol><li>Säen Sie A. Thaliana in 5 x 5 cm Einweg-Töpfe mit einheitserde Mischung gefüllt. 32 dieser Töpfe in ein Kunststoff-Tablett mit Wasser gefüllt genommen (~ 0,5 cm Tiefe) und die Kunststoff-Tablett mit den Pflanzen in einer Pflanze Wachstum Kammer übertragen.<ol>
<li>Einstellen des Wachstums Kammer wie folgt: 200 µmol/ms fotosynthetisch aktive Strahlung (PAR), 24 ± 1 ° C Tag und 21 ± 1 ° C Nacht 60 % Luftfeuchtigkeit und 14/10 h Tag/Nacht Licht Regime, beziehungsweise.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dünne jeden Topf um nur eine einzelne Pflanze nach einer Woche der Keimung zu verlassen. Beachten Sie die Sämlinge mit ähnlicher Größe in jeden Topf zu halten.</li>
	<li>Wasser die Töpfe von strömendem Wasser direkt an der Plastikschale einmal alle zwei Tage. Wachsen Sie die Pflanzen, für vier Wochen. A. Thaliana Pflanzen sind für die weitere Verwendung bereit.</li>
</ol>(2) Synthese und Charakterisierung von PNC
<ol><li>CER (III) Nitrat 1,08 g wiegen und in 2,5 mL Molekularbiologie Grade Wasser in einem 50 mL konische Röhrchen auflösen.</li>
	<li>Poly (Acryl) Säure 4,5 g wiegen und in 5 mL Molekularbiologie Grade Wasser in einem 50 mL konische Röhrchen auflösen.</li>
	<li>Mischen Sie diese beiden Lösungen gründlich auf 2.000 u/min für 15 min mit einem digitalen Vortex Mixer.</li>
	<li>Übertragen Sie 15 mL Ammonium Hydroxid-Lösung (7,2 M) auf ein 50-mL-Becherglas.</li>
	<li>Unter ständigem Rühren bei 500 u/min, die Mischung aus Schritt 2.3 tropfenweise das Ammonium Hydroxid Projektmappe hinzufügen und rühren bei 500 u/min bei Raumtemperatur für 24 Stunden in einer Dampfhaube.</li>
	<li>Decken Sie das Becherglas mit einem Stück Papier, um den erheblichen Verlust Lösung während der Nacht Reaktion zu vermeiden.</li>
	<li>Übertragen Sie nach 24 h die resultierende Lösung auf eine 50 mL konische Rohr und Zentrifugieren sie bei 3.900 x g für 1 h um mögliche Ablagerungen und große Agglomerate zu entfernen.</li>
	<li>Übertragen Sie diese 22,5 mL der überstehenden Lösung in drei 15 mL 10 kDa Filter und füllen Sie den Rest des Filters mit molekularen Grade Wasser zu einer totalen Verdünnung von 45 mL.</li>
	<li>Reinigen Sie die überstehende Lösung aus freien Polymeren und anderen Reagenzien mit einer Benchtop-Zentrifuge, indem Sie eine 15 mL 10 kDa Filter und Zentrifuge bei 3.900 x g für 15 min. Überstands hinzufügen wiederholen Sie diesen Schritt mindestens sechsmal.</li>
	<li>Messen Sie die Absorption der Eluent in jedem Zyklus mit einem UV-VIS Spektralphotometer von 220-700 nm, keine freie Polymere zu gewährleisten und andere Reagenzien in der endgültigen PNC-Lösung vorhanden sind.</li>
	<li>Nehmen Sie die gesammelten PNC-Lösung in 5 mL Spritze und gegen einen 20 nm Pore Größe Spritze Filter filtern. Sammeln Sie die gefilterten PNC-Lösung in einem 50 mL konische Röhrchen.</li>
	<li>Nehmen Sie eine verdünnte Lösung für endgültige PNC in Kunststoff Küvette und Messen Sie seine Absorption mit UV-VIS Spektralphotometer von 220-700 nm zu. PNC Extinktion Gipfel ist 271 nm.</li>
	<li>Seine Konzentration mit Bier-Lambert Gesetz berechnen: A = εCL. A ist die Extinktion der Peak-Wert für eine gegebene Probe, Mundarten ist die molare Absorptionskoeffizienten von PNC (cm-1 M-1), L ist die optische Weglänge (Küvette Breite, 1 cm in dieser Methode), und C ist die molare Konzentration der gemessenen Nanopartikel.</li>
	<li>Messen Sie die hydrodynamischen Durchmesser und Zeta-Potential des synthetisierten PNC mit einem Partikel Größe und Zeta potenzielle Analyzer (Abbildung 1).</li>
	<li>Die endgültige PNC-Lösung im Kühlschrank (4 ° C) bis zur weiteren Verwendung zu speichern. Hinweis: Siehe Wu Et Al. 8 weitere Protokoll-Informationen über PNC Charakterisierung.</li>
</ol>3. Kennzeichnung PNC mit DiI Fluoreszenzfarbstoff
<ol><li>0,4 mL 5 mm (58 mg/L) PNC mit 3,6 mL der Molekularbiologie Grade Wasser in ein 20 mL-Glasflasche verrühren Sie und bei 500 Umdrehungen pro Minute.</li>
	<li>Fügen Sie 24 µL 1, 1'-Dioctadecyl-3,3, 3', 3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorat Farbstofflösung (DiI, 2,5 mg/mL; verdünnter in DMSO) in 176 µL DMSO (Dimethyl Sulfoxid), die DiI Farbstofflösung zu machen.</li>
	<li>Die DiI-Farbstoff tropfenweise die PNC Projektmappe fügen Sie hinzu, rühren bei 1.000 u/min für 1 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Übertragen Sie dieses resultierende Mischung in einen 15 mL 10 kDa Filter und füllen Sie das Rohr an der Spitze mit Molekularbiologie Grade Wasser, damit die gesamte Verdünnung 15 mL.</li>
	<li>Reinigen Sie die DiI PNC (DiI-PNC) Lösung von DMSO und jede mögliche freie DiI Farbstoff durch ein Benchtop-Zentrifugation mit 15 mL 10 kDa Filter bei 3.900 x g für 5 min beschriftet.<ol>
<li>Wiederholen Sie Schritt 3.5 mindestens fünfmal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Filtern Sie die endgültigen DiI-PNC-Lösungen durch einen 20 nm Pore Größe Spritze Filter.</li>
	<li>Messen Sie die Extinktion des endgültigen DiI-PNC durch UV-VIS-Spektrophotometrie und berechnen Sie die Konzentration nach Bier-Lambert Gesetz (Abbildung 2). Näheres hierzu finden Sie unter Schritt 2.13.</li>
	<li>Bewahren Sie es im Kühlschrank bei 4 ° C für die weitere Verwendung.</li>
</ol>(4) Infiltration der Pflanze Blätter mit PNC
<ol><li>Fügen Sie 0,1 mL der Infiltration Puffer (100 mM TES, 100 mM MgCl2, pH 7.5, durch HCl eingestellt) in 0,9 mL 0,5 mM PNC oder DiI-PNC-Lösung und Wirbel es. Verwenden Sie eine Lösung aus 10 mM TES Infiltration Puffer als Negativkontrolle.</li>
	<li>Übertragen Sie auf eine sterile nadellosen Spritze 1 mL 0,2 mL der PNC oder DiI-PNC Infiltration Lösung. Tippen Sie auf, um mögliche Luftblasen zu entfernen.</li>
	<li>Abrufen der Pflanzenschutzmittels aus der Wachstums-Kammer kurz vor Infiltration mit Nanopartikeln möglich Spaltöffnungen Schließung unter Zimmer Lichtverhältnissen zu vermeiden.</li>
	<li>Messen Sie vor Infiltration der Chlorophyllgehalt von A. Thaliana Blätter mit ähnlicher Größe mit einem Chlorophyll Meter. Messen Sie jedes Blatt mit drei Wiederholungen (jedes replizieren, bestehend aus mindestens drei Messungen)14. Wählen Sie A. Thaliana mit ähnlichen Chlorophyllgehalt für die Infiltration Experiment verlässt.</li>
	<li>Infiltrieren Sie die Blätter langsam mit der vor kurzem hergestellte PNC oder DiI-PNC Lösung durch leichtes drücken die Spitze der nadellosen Spritze gegen die Unterseite der Blatt-Lamina (abaxial Seite) und drücken Sie den Kolben(Abbildung 3).</li>
	<li>Vorsichtig wischen Sie die überschüssige Lösung, die auf der Oberfläche des Blattes Lamina (Abbildung 3B) mit einer heiklen Aufgabe Wischer (Abb. 3C) bleibt und beschriften Sie die Pflanze. Verwenden Sie neue heikle Aufgabe Tücher für jede Gruppe von Blättern.</li>
	<li>Halten Sie die infiltrierten A. Thaliana auf der Bank für Blatt Anpassung und Inkubation mit PNC oder DiI-PNC für 3 h Pflanzen. Hinweis: Infiltrierten A. Thaliana Pflanzen sind dann bereit für den weiteren Einsatz (Abbildung 3D).</li>
</ol>5. Vorbereitung des Blattproben für die konfokale Mikroskopie
<ol><li>Roll eine erbsengroße Menge der Beobachtung über einen Radius von 1 cm (Abb. 4A) gel und dann breitete sie bis 1 mm dünn auf einen Glasobjektträger (Abbildung 4B) ist.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Korken Borer (Durchmesser 0,3 cm) schneiden Sie einen kreisförmigen Querschnitt in der Mitte des Gels Beobachtung auf dem Objektträger (Abb. 4C).</li>
	<li>Füllen Sie den Schnitt auch komplett mit Perfluorodecalin (PFD) für tiefer und besser konfokale bildgebenden Auflösung im Blatt Gewebe.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Korken Borer (Durchmesser 0,2 cm) zum Blattscheiben von angepassten DiI-PNC zu sammeln infiltriert A. Thaliana Pflanzen (Abbildung 4D).</li>
	<li>Montieren Sie die Blatt-Scheibe in der PFD gut gefüllt; die infiltrierte (abaxial) Seite des Blattes aufgedeckt.</li>
	<li>Setzen Sie ein Quadrat Deckglas auf der Blatt-CD und drücken Sie vorsichtig auf die Folie Deckglas gleichmäßig, mit dem Brunnen der Beobachtung Gel versiegeln und sicherzustellen, dass keine Luftblasen eingeschlossen (Abbildung 4E) bleiben.</li>
</ol>6. Bildgebung DiI-PNC in Blatt Geweben durch konfokale Mikroskopie
<ol><li>Verwenden Sie eine 40 X Objektiv in einem invertierten Laserscanning confocal Mikroskop.</li>
	<li>Legen Sie zwei bis drei Tropfen DdH2O auf der Oberseite 40 X Objektiv.</li>
	<li>Legen Sie die vorbereitete DiI-PNC infiltriert Blatt Probe Folie auf der Oberseite der invertierten 40 X Objektiv Objektiv.<ol>
<li>Stellen Sie sicher, das Deckglas Seite aber nicht das Glas schieben Sie Kontakt direkt mit dem DdH2O auf der Linse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eine Region of Interest in der Probe unter dem Mikroskop mit Laserlicht oder Hellfeld zu finden.</li>
	<li>Starten Sie die Mikroskop-Software und schalten Sie die Argon-Laser (auf 20 % gesetzt).</li>
	<li>Festlegen der Lochkamera, eine optische Scheibe weniger als 2 µm und eine Linie Durchschnitt von 4 zu sammeln.</li>
	<li>Bild die Probe mit confocal Mikroskop Einstellungen: 514 nm Laseranregung (30 %); Z-Stapel Schnittdicke: 2 µm; PMT1: 550-615 nm (für DiI-PNC-Tomographie); PMT2: 700-800 nm (für die Chloroplasten Bildgebung).</li>
	<li>Nehmen Sie repräsentative konfokale Bilder von Blattproben von verschiedenen Individuen, ein Minimum von drei biologische repliziert.</li>
</ol>(7) imaging PNC in Vivo ROS Aufräumvorgang konfokalen Mikroskopie
<ol><li>Bereiten Sie 25 µM 2', 7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetat (H2DCFDA, ein Farbstoff zur Angabe einer allgemeinen ROS) und 10 µM Dihydroethidium (DHE, ein Farbstoff zur Anzeige von Superoxid-Anion) Farbstoffe in TES Infiltration Puffer (pH 7,5) in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen separat zu bestellen.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Korken Borer (Durchmesser 0,2 cm), um Blatt zu sammeln Scheiben aus den angepassten PNC infiltriert A. Thaliana Pflanzen.<ol>
<li>Verwenden Sie die scharfe Spitze der Zange um drei bis vier Löcher auf den Blattscheiben Farbstoff Ladevorgang zu beschleunigen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Übertragung der Leaf Scheiben für Mikrozentrifugenröhrchen mit H2DCFDA und DHE separat und inkubieren Sie für 30 min unter Dunkelheit.</li>
	<li>Nach der Inkubation gel spülen das Blatt mit DdH2O dreimal discs und montieren es ins Glas gleiten mit Beobachtung (siehe Protokoll Abschnitt 5).</li>
	<li>Setzen Sie die Folie auf das konfokale Mikroskop und manuell zu fokussieren Sie, zu einer Region des Mesophyll Blattzellen. Details siehe Protokoll Abschnitt 6.</li>
	<li>Setzen die Blattscheiben, die UV-A (405 nm) Laser für 3 min ROS zu generieren und die Signaländerung Intensität ROS in Zeitreihen ("Xyt") pro Blatt Disc aufzeichnen.</li>
	<li>Die Blatt-Scheibe mit confocal Mikroskop Einstellungen Bild: 40 X Wasser Ziel; 496 nm Laseranregung; PMT1: 500-600 nm (für DHE und DCFDA Farbstoff-Erkennung); PMT2: 700-800 nm (für Chloroplasten-Erkennung). Verwenden Sie eine Anlage mit nur Infiltration Pufferlösung als der Negativkontrolle infiltriert.</li>
</ol>(8) PNC Aufräumvorgang von H2O2in vitro
<ol><li>Die Katze (Katalase) mimetische Aktivität des synthetisierten PNC in Vitro zu führen, indem Sie die Methoden in früheren Publikationen3,8,15
</li>
	<li>Hinzufügen von 45,4 µL 1 X TES Infiltration-Puffer (10 mM TES, 10 mM MgCl2, pH 7.5, durch HCl eingestellt), PNC (60 nM, 3 µL), und H2O2 (2 µM, 1 µL) in einen Brunnen (weiße Rundboden 96-well-Platte), und mischen Sie es sanft durch pipettieren.</li>
	<li>Fügen Sie 10-Acetyl-3,7-Dihydroxyphenoxazine (arbeiten Konzentration 100 µM, 0,5 µL) und Meerrettich-Peroxidase (HRP; arbeiten Konzentration 0,2 U/mL, 0,1 µL) in den Brunnen sanft durch pipettieren mischen und 30 min. 10-Acetyl-3,7-Dihydroxyphenoxazine inkubieren reagiert mit H2O2 und in Resorufin in Anwesenheit von HRP umgewandelt wird.<ol>
<li>Wickeln Sie die Platte mit Aluminium-Folie, Licht während der Inkubation zu vermeiden.</li>
		<li>Bereiten Sie eine Negativkontrolle mit Reaktion Puffer oder Wasser, um H2O2zu ersetzen.</li>
		<li>Mit Ausnahme der Stammlösung bereiten Sie alle anderen Lösungen bei Umgebungstemperatur vor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nach der Inkubation mit einem Lesegerät Platte überwachen die Extinktion bei 560 nm, Resorufin zu verwenden, geben Sie die Höhe der H2O2. Zeitregime auf 0, 2, 5, 10, 20 und 30 min festgelegt.</li>
</ol>

<ol><li>Xu, C., Qu, X. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/am201388">Cerium oxide nanoparticle: A remarkably versatile rare earth nanomaterial for biological applications.</a> NPG Asia Materials. 6 (3), 90-116 (2014).</li>
<li>Nelson, B., Johnson, M., Walker, M., Riley, K., Sims, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant+cerium+oxide+nanoparticles+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants%22%5BJournal%5D)">Antioxidant cerium oxide nanoparticles in biology and medicine.</a> Antioxidants. 5 (2), 15(2016).</li>
<li>Gupta, A., Das, S., Neal, C. J., Seal, S. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2016/tb/c6tb00396f#!divAbstract">Controlling the surface chemistry of cerium oxide nanoparticles for biological applications.</a> Journal of Materials Chemistry B. 4 (19), 3195-3202 (2016).</li>
<li>Walkey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+properties+and+biomedical+applications+of+cerium+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.%3A+Nano%22%5BJournal%5D)">Catalytic properties and biomedical applications of cerium oxide nanoparticles.</a> Environ. Sci.: Nano. 2 (1), 33-53 (2015).</li>
<li>Pulido-Reyes, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untangling+the+biological+effects+of+cerium+oxide+nanoparticles%3A+the+role+of+surface+valence+states%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Untangling the biological effects of cerium oxide nanoparticles: the role of surface valence states.</a> Scientific reports. 5, 15613(2015).</li>
<li>Dutta, P., et al. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cm061580n">Concentration of Ce3+ and oxygen vacancies in cerium oxide nanoparticles.</a> Chemistry of Materials. 18 (21), 5144-5146 (2006).</li>
<li>Boghossian, A. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/259679554_Application_of_Nanoparticle_Antioxidants_to_Enable_Hyperstable_Chloroplasts_for_Solar_Energy_Harvesting">Application of nanoparticle antioxidants to enable hyperstable chloroplasts for solar energy harvesting.</a> Advanced Energy Materials. 3, 881-893 (2013).</li>
<li>Wu, H., Tito, N., Giraldo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anionic+cerium+oxide+nanoparticles+protect+plant+photosynthesis+from+abiotic+stress+by+scavenging+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Anionic cerium oxide nanoparticles protect plant photosynthesis from abiotic stress by scavenging reactive oxygen species.</a> ACS Nano. 11 (11), 11283-11297 (2017).</li>
<li>Giraldo, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+nanobionics+approach+to+augment+photosynthesis+and+biochemical+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Plant nanobionics approach to augment photosynthesis and biochemical sensing.</a> Nature Materials. 13 (4), 400-408 (2014).</li>
<li>Demidchik, V. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0098847214001750">Mechanisms of oxidative stress in plants: From classical chemistry to cell biology.</a> Environmental and Experimental Botany. 109, 212-228 (2015).</li>
<li>Rico, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerium+oxide+nanoparticles+impact+yield+and+modify+nutritional+parameters+in+wheat+%28Triticum+aestivum+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cerium oxide nanoparticles impact yield and modify nutritional parameters in wheat (Triticum aestivum L.).</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 62 (40), 9669-9675 (2014).</li>
<li>Rossi, L., Zhang, W., Lombardini, L., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+cerium+oxide+nanoparticles+on+the+salt+stress+responses+of+Brassica+napus+L%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">The impact of cerium oxide nanoparticles on the salt stress responses of Brassica napus L.</a> Environmental Pollution. 219, 28-36 (2016).</li>
<li>Xu, J., Duan, X., Yang, J., Beeching, J. R., Zhang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+reactive+oxygen+species+scavenging+by+overproduction+of+superoxide+dismutase+and+catalase+delays+postharvest+physiological+deterioration+of+cassava+storage+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Enhanced reactive oxygen species scavenging by overproduction of superoxide dismutase and catalase delays postharvest physiological deterioration of cassava storage roots.</a> Plant Physiology. 161 (3), 1517-1528 (2013).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+and+validating+a+high-throughput+assay+for+salinity+tissue+tolerance+in+wheat+and+barley%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Developing and validating a high-throughput assay for salinity tissue tolerance in wheat and barley.</a> Planta. , (2015).</li>
<li>Pirmohamed, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoceria+exhibit+redox+state-dependent+catalase+mimetic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+communications%22%5BJournal%5D)">Nanoceria exhibit redox state-dependent catalase mimetic activity.</a> Chemical communications. 46 (16), Cambridge, England. 2736-2738 (2010).</li>
<li>Asati, A., Santra, S., Kaittanis, C., Perez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-charge-dependent+cell+localization+and+cytotoxicity+of+cerium+oxide+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Surface-charge-dependent cell localization and cytotoxicity of cerium oxide nanoparticles.</a> ACS nano. 4, 5321-5331 (2010).</li>
<li>Li, J., Wu, H., Santana, I., Fahlgren, M., Giraldo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standoff+optical+glucose+sensing+in+photosynthetic+organisms+by+a+quantum+dot+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Standoff optical glucose sensing in photosynthetic organisms by a quantum dot fluorescent probe.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. , (2018).</li>
<li>Wu, H., Shabala, L., Shabala, S., Giraldo, J. P. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2018/en/c8en00323h#!divAbstract">Hydroxyl radical scavenging by cerium oxide nanoparticles improves Arabidopsis salinity tolerance by enhancing leaf mesophyll potassium retention.</a> Environmental Science: Nano. 5 (7), 1567-1583 (2018).</li>
<li>Merad-Boudia, M., Nicole, A., Santiard-Baron, D., Saillé, C., Ceballos-Picot, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+impairment+as+an+early+event+in+the+process+of+apoptosis+induced+by+glutathione+depletion+in+neuronal+cells%3A+Relevance+to+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial impairment as an early event in the process of apoptosis induced by glutathione depletion in neuronal cells: Relevance to Parkinson's disease.</a> Biochemical Pharmacology. 56 (5), 645-655 (1998).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+characterization+of+the+product+of+hydroethidine+and+intracellular+superoxide+by+HPLC+and+limitations+of+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Detection and characterization of the product of hydroethidine and intracellular superoxide by HPLC and limitations of fluorescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (16), 5727-5732 (2005).</li>
<li>Sun, C., Li, H., Chen, L. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2012/ee/c2ee22310d#!divAbstract">Nanostructured ceria-based materials: synthesis, properties, and applications.</a> Energy & Environmental Science. 5 (9), 8475(2012).</li>
<li>Hirano, M., Inagaki, M. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2000/jm/a907510k/unauth#!divAbstract">Preparation of monodispersed cerium(iv) oxide particles by thermal hydrolysis: influence of the presence of urea and Gd doping on their morphology and growth.</a> Journal of Materials Chemistry. 10 (2), 473-477 (2000).</li>
<li>Xi, D. M., Liu, W. S., Yang, G. D., Wu, C. A., Zheng, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed-specific+overexpression+of+antioxidant+genes+in+Arabidopsis+enhances+oxidative+stress+tolerance+during+germination+and+early+seedling+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Seed-specific overexpression of antioxidant genes in Arabidopsis enhances oxidative stress tolerance during germination and early seedling growth.</a> Plant Biotechnology Journal. 8 (7), 796-806 (2010).</li>
<li>Wu, H., Santana, I., Dansie, J., Vivo Giraldo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+delivery+of+nanoparticles+into+plant+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">In Vivo delivery of nanoparticles into plant leaves.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 9 (4), 269-284 (2017).</li>
<li>Fukushima, K., Hasebe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaxial-abaxial+polarity%3A+The+developmental+basis+of+leaf+shape+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Adaxial-abaxial polarity: The developmental basis of leaf shape diversity.</a> Genesis. 52 (1), 1-18 (2014).</li>
<li>Monda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+stomatal+conductance+by+a+spontaneous+Arabidopsis+tetraploid%2C+Me-o%2C+results+from+increased+stomatal+size+and+greater+stomatal+aperture%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+physiology%22%5BJournal%5D)">Enhanced stomatal conductance by a spontaneous Arabidopsis tetraploid, Me-o, results from increased stomatal size and greater stomatal aperture.</a> Plant physiology. 170 (3), 1435-1444 (2016).</li>
<li>Petrov, V., Hille, J., Mueller-Roeber, B., Gechev, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS-mediated+abiotic+stress-induced+programmed+cell+death+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">ROS-mediated abiotic stress-induced programmed cell death in plants.</a> Frontiers in Plant Science. 6, 1-16 (2015).</li>
<li>Chaves, M. M., Flexas, J., Pinheiro, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthesis+under+drought+and+salt+stress%3A+regulation+mechanisms+from+whole+plant+to+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Photosynthesis under drought and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell.</a> Annals of Botany. 103 (4), 551-560 (2009).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Protokoll beschreiben wir PNC Synthese, Charakterisierung, Fluoreszenzfarbstoff Kennzeichnung und konfokale Imaging der Nanopartikel im Mesophyll Pflanzenzellen ihre in Vivo ROS Aufräumvorgang Aktivität aufweisen. PNC werden aus einer Mischung von Cerium Nitrat und Ammonium Hydroxid-PAA Lösung synthetisiert. PNC zeichnen sich durch Absorption Spectrophotomery und die Konzentration über Bier-Lamberts Gesetz ermittelt. Zeta mögliche Messungen bestätigt die negativ geladene Oberfläche des PNC zur Verbesse...

Cerium-oxid-Nanopartikel (Nanoceria) sind in lebenden Organismen, von der Grundlagenforschung zur Biotechnologie, aufgrund ihrer unterschiedlichen katalytischen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) Aufräumvorgang Fähigkeit1,2,3verbreitet. Nanoceria haben ROS Aufräumvorgang Fähigkeiten aufgrund einer großen Anzahl von Oberfläche Sauerstoff stellen, die abwechselnd zwei Oxidation Staaten (Ce3 + und CE-4 +) 4,5,6. Die CE-3 + baumelnden Bindungen Aufräumen effektiv ROS während der Gitter-Stämme im Nanobereich die Regeneration dieser defekt Seiten über Redox fördern-Reaktionen7Radfahren. Nanoceria haben auch vor kurzem verwendet, für das Studium und Engineering Anlagenbau Funktion8,9. Pflanzen unter abiotischen Stress erleben Anhäufung von ROS, oxidativen Schäden an Lipiden, Proteinen und DNA-10. In A. Thaliana Pflanzen führt Nanoceria katalytische Aufräumvorgang von ROS in Vivo zu verbesserten pflanzlichen Photosynthese unter hohen Licht, Wärme und Kühlung betont8. Anwendung Nanoceria auch erhöht Shooting Biomasse und Korn-Ertrag von Weizen (Triticum Aestivum)11Boden; Raps (Brassica Napus) Pflanzen mit Nanoceria behandelt haben höhere pflanzlicher Biomasse unter salzstress12.
Nanoceria bieten Bioingenieure und Biologen eine Nanotechnologie-basierte Tool, um abiotischem Stress-Reaktionen zu verstehen und zu verbessern Pflanzenverträglichkeit abiotischem Stress zu Pflanzen. Nanoceria der in Vivo ROS Aufräumvorgang Fähigkeiten sind unabhängig von Pflanzenarten und einfache Lieferung ins Pflanzengewebe hat das Potenzial, breite Anwendung außerhalb von Modellorganismen zu ermöglichen. Im Gegensatz zu anderen Methoden genetisch bedingt Nanoceria erfordern keine Generierung von Pflanzenlinien mit der Überexpression von antioxidativen Enzymen für höhere ROS Aufräumvorgang Fähigkeit13. Blatt-Lamina Infiltration von Nanoceria Pflanzen ist ein praktischer Ansatz für die Labor-basierte Forschung.
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, (1) die Synthese und Charakterisierung von negativ geladenen Poly (Acryl) Säure Nanoceria (PNC), (2) die Lieferung und Verfolgung von PNC im gesamten Blattzellen und (3) die Kontrolle der PNC-fähigen ROS Aufräumvorgang beschreiben Vivo. In diesem Protokoll sind negativ geladenen Poly (Acryl) Säure Nanoceria (PNC) synthetisiert und charakterisiert durch ihr Absorptionsspektrum, hydrodynamische Durchmesser und Zetapotenzial. Wir beschreiben eine einfache Blatt Lamina Infiltration-Methode um PNC in Pflanze Blatt Gewebe liefern. Für die in-Vivo Bildgebung der Verteilung der Nanopartikel im Mesophyll Zellen wurde ein Fluoreszenzfarbstoff (DiI) zur PNC (DiI-PNC) beschriften und beobachten die Nanopartikel über konfokale Fluoreszenzmikroskopie. Schließlich erklären wir, wie in Vivo PNC ROS Abfangen durch konfokale Mikroskopie zu überwachen.

<table><tbody><tr><td>Cer(III)-nitrat-Hexahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238538-100G</td><td></td></tr><tr><td>Wasser in molekularbiologischer Qualität, Corning</td><td>VWR</td><td>45001-044&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL konische Zentrifugenröhrchen</td><td>VWR</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>Poly (Acrylsäure) 1.800 mW</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>323667-100G</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Digital Vortex Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Digital Vortex Mixer Zubehör, Einsatzhalter</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-391</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Digital Vortex Mixer Zubehör: Schaumstoffeinlagen-Set</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-395</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxid-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05002-1L</td><td></td></tr><tr><td>PYREX Griffin Becher, graduiert, Corning</td><td>VWR</td><td>13912-149&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RCT basic</td><td>IKA</td><td>3810001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Mikrozentrifuge 5424</td><td>VWR</td><td>80094-126</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheiten</td><td>Millipore-Sigma</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-30 Serie Tischzentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>B06314</td><td></td></tr><tr><td>UV-2600 Sptecrophotometer</td><td>Shimadzu</td><td>UV-2600 120V</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Anotop 10 Spritzenfilter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA68091102</td><td></td></tr><tr><td>BD Einwegspritzen mit Luer-Lok Spitzen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano S</td><td>Malvern Panalytical</td><td>Zen 1600</td><td></td></tr><tr><td>1,1&prime;-Dioctadecyl-3,3,3&prime;,3&prime;-Tetramethylindocarbocyaninperchlorat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42364-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid, ACS</td><td>VWR</td><td>BDH1115-1LP</td><td></td></tr><tr><td>Sunshine Mix #1 LC1</td><td>Green Island Distributors, Inc</td><td>5212601.CFL080P</td><td></td></tr><tr><td>Adaptis 1000</td><td>Conviron</td><td>A1000</td><td></td></tr><tr><td>TES, >99% (Titration</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1375-100G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Air-Tite Vollkunststoff-Norm-Ject-Spritze</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-25</td><td></td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task</td><td>Wipers Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Carolina Observation Gel</td><td>Carolina</td><td>132700</td><td></td></tr><tr><td>Corning Objektträger, einseitig mattiert, ein Ende</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS294875X25-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Korkbohrer Sets mit Griffen</td><td>Fisher Scientific</td><td>S50166A</td><td></td></tr><tr><td>Perfluordecalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9900-25G</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover Glasses, Square, No. 1</td><td>VWR</td><td>48366-045</td><td></td></tr><tr><td>Leica Laser Scanning Konfokalmikroskop TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>2&prime;,7&prime;-Dichlorfluorescindiacetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6883-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Dihydroethidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7008-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Premium Mikrozentrifugenröhrchen: 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Uvette Küvetten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z605050-80EA</td><td></td></tr><tr><td>Chlorophyllmessgerät</td><td>Konica Minolta</td><td>SPAD-502</td><td></td></tr></tbody></table>

katalytische spülung der anlage reaktive sauerstoff spezies in vivo von anionischen cerium-oxid-nanopartikel

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Reaktive Sauerstoff-Spezies (ROS)-Ansammlung ist ein Markenzeichen der Pflanze abiotischen Stress-Reaktion. ROS spielen eine Doppelrolle in Pflanzen als Signalmoleküle auf einem niedrigen Niveau und Moleküle auf einem hohen Niveau zu beschädigen. Anhäufung von ROS in gestresste Pflanzen kann Stoffwechselprodukte, Enzyme, Lipide und DNA, was zu einer Reduzierung des Pflanzenwachstums und der Ertrag beschädigen. Die Fähigkeit der Cerium-oxid-Nanopartikel (Nanoceria), katalytisch ROS in Vivo Aufräumen bietet ein einzigartiges Werkzeug zu verstehen und Biotechnologe Pflanzenverträglichkeit abiotischem Stress. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu synthetisieren und Poly (Acryl) Säure beschichteten Nanoceria (PNC) zu charakterisieren, Schnittstelle die Nanopartikel mit Pflanzen über Blatt-Lamina-Infiltration und Überwachung ihrer Verteilung und ROS Aufräumvorgang in Vivo konfokale mit Mikroskopie. Aktuelle Molekulare Werkzeuge zur Manipulation der ROS-Akkumulation in Pflanzen sind nur die Modell-Arten und mühsamer Wandel Methoden erfordern. Dieses Protokoll für in Vivo ROS Aufräumvorgang hat das Potenzial, zu Wildtyp-Pflanzen mit breiten Blättern und Blattstruktur wie Arabidopsis Thalianaangewendet werden.

PNC-Synthese und Charakterisierung . PNC wurden synthetisiert, gereinigt und zeichnet sich im folgenden die Protokoll Abschnitt 2 beschrieben. Abbildung 1 A zeigt die Färbung der Cerium Nitrat, PAA, die Mischung aus Cerium Nitrat und PAA und PNC-Lösungen. Ein Farbwechsel von weiß bis hellgelb ist gesehen, nachdem PNC synthetisiert wird. Nach der Reinigung mit einem 10 kDa-Filter PNC zeichneten sic...

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Synthese und Charakterisierung von Cerium-oxid-Nanopartikel (Nanoceria) für ROS (reaktive Sauerstoffspezies) in Vivo, Nanoceria im Pflanzengewebe durch konfokale Mikroskopie und in-Vivo imaging Aufräumvorgang Überwachung des Nanoceria ROS Aufräumvorgang konfokalen Mikroskopie.

Katalytische Spülung der Anlage reaktive Sauerstoff Spezies In Vivo von anionischen Cerium-oxid-Nanopartikel

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling ...

Die Fähigkeit von Ceroxid-Nanopartikeln, reaktive Sauerstoffspezies in vivo katalytisch abzufangen, bietet ein einzigartiges Werkzeug, um die Mechanismen der pflanzlichen Signalübertragung und Stresstoleranz zu verstehen und zu entwickeln. Reaktive Sauerstoffspezies spielen in Pflanzen eine Schlüsselrolle, indem sie in niedrigen Konzentrationen als Signalmoleküle fungieren und in hohen Konzentrationen Moleküle schädigen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie auf verschiedene Wildtyp-Pflanzenarten mit breiter Blatt- und Blattstruktur wie Arabidopsis thaliana angewendet werden kann.Nach dem Anbau der Arabidopsis thaliana-Pflanzen Wiegen Sie 1,08 Gramm Cernitrat ab und lösen Sie es in 2,5 Millilitern biologischem Wasser in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen auf. Wiegen Sie 4,5 Gramm Polysäure ab und lösen Sie sie in fünf Millilitern Wasser in biologischer Qualität in einem anderen konischen 50-Milliliter-Röhrchen auf. Kombinieren Sie diese beiden Lösungen und mischen Sie sie dann mit einem digitalen Vortex-Mischer 15 Minuten lang bei 2.000 U/min gründlich.In einem Abzug werden 15 Milliliter einer 7,2-molaren Ammoniumhydroxidlösung in ein 50-Milliliter-Glasbecherglas umgefüllt. Beginnen Sie mit dem Rühren bei 500 U/min und bei Raumtemperatur. Die Mischung aus Cernitrat und Polysäure tropfenweise hinzufügen.Decken Sie das Becherglas mit einem Blatt Papier ab, um einen erheblichen Verlust der Lösung zu vermeiden, und lassen Sie es 24 Stunden lang rühren. Übertragen Sie danach die resultierende Lösung in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Eine Stunde lang bei 3.900 g zentrifugieren, um Ablagerungen oder große Agglomerate zu entfernen.Übertragen Sie dann den Überstand in drei 50-Milliliter-Filter mit einem Fassungsvermögen von 10 Kilodalton. Füllen Sie den Rest jedes Filters mit Wasser in Molekularqualität, was zu einer Gesamtverdünnung von 45 Millilitern führt. Zentrifugieren Sie bei 3.900 g für 15 Minuten.Wiederholen Sie diesen Vorgang mindestens sechsmal. Messen Sie mit einem UV-Vis-Spektralphotometer die Absorption jedes Eluenten von 220 Nanometern bis 700 Nanometern, um sicherzustellen, dass keine freien Polymere oder andere Reagenzien in der PNC-vorhanden sind. Verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze, um die gesammelte PNC-Lösung aufzunehmen.Filtrieren Sie anschließend die Lösung gegen einen 20 Nanometer großen Spritzenvorsatzfilter und sammeln Sie die gefilterte Lösung in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Übertragen Sie eine verdünnte PNC-in eine Kunststoffküvette und messen Sie ihre Extinktion von 220 Nanometern bis 700 Nanometern. Messen Sie mit einem Partikelgrößenmessgerät den hydrodynamischen Durchmesser des synthetisierten PNC und lagern Sie die endgültige PNC-Lösung bis zur Verwendung in einem Kühlschrank bei vier Grad Celsius.Nach der Markierung des PNC mit dem DiI-Fluoreszenzfarbstoff werden 0,9 Milliliter einer Lösung, die 0,5 Millimolar der PNC-Lösung oder der DiI-PNC-Lösung enthält, in ein Röhrchen überführt. 0,1 Milliliter Infiltrationspuffer zugeben und durch Vortexen mischen. Bereiten Sie einen 10-millimolaren TES-Infiltrationspuffer als Negativkontrolle vor.Übertragen Sie anschließend 0,2 Milliliter der Proben- und Puffermischung in eine sterile nadellose Ein-Milliliter-Spritze. Tippen Sie auf, um mögliche Luftblasen zu entfernen. Kurz vor der Infiltration solltest Du die Pflanze aus der Wachstumskammer holen.Messen Sie mit einem Chlorophyllmessgerät den Chlorophyllgehalt in den Blättern von A.thaliana. Messen Sie jedes Blatt mit drei Replikaten, wie im Textprotokoll beschrieben. Wählen Sie Blätter mit ähnlichem Chlorophyllgehalt.Drücken Sie die Spitze der nadellosen Spritze vorsichtig gegen den Boden der Blattlamina und drücken Sie den Kolben, um die Blätter zu infiltrieren. Wischen Sie mit einem feinen Wischer vorsichtig alle überschüssigen Lösungen ab, die auf der Oberfläche der Blattlamina verbleiben, und beschriften Sie dann die Pflanze. Lassen Sie die infiltrierten Pflanzen drei Stunden lang auf der Bank inkubieren.Geben Sie zunächst eine erbsengroße Menge Beobachtungsgel auf einen Objektträger, rollen Sie das Gel aus und verteilen Sie es, bis es einen Durchmesser von etwa zwei Zentimetern und eine Dicke von einem Millimeter hat. Schneiden Sie mit einem Korkbohrer mit einem Durchmesser von 0,3 Zentimetern einen kreisförmigen Abschnitt in der Mitte des Gels aus, um eine Vertiefung zu erzeugen. Füllen Sie die Vertiefung vollständig mit PFD, was eine tiefere und bessere Auflösung der konfokalen Bildgebung ermöglicht.Verwenden Sie dann einen Korkbohrer mit einem Durchmesser von 0,2 Zentimetern, um Blattscheiben von den zuvor infiltrierten A.thaliana-Pflanzen zu sammeln. Montieren Sie jede Blattscheibe mit der infiltrierten Seite nach oben in einer mit Schwimmweste gefüllten Vertiefung. Legen Sie danach einen quadratischen Deckzettel auf die Blattscheibe.Drücken Sie vorsichtig und gleichmäßig auf den Deckglas, um ihn mit der Vertiefung des Beobachtungsgels zu versiegeln und sicherzustellen, dass keine Luftblasen eingeschlossen bleiben. Bereiten Sie zunächst 25 Mikromolar H2DCFDA Farbstoff und 10 Mikromolar DHE-Farbstoff in TES-Infiltrationspuffer in separaten 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen vor. Sammeln Sie mit einem Korkbohrer mit einem Durchmesser von 0,2 Zentimetern Blattscheiben von den angepassten PNC-infiltrierten A.thaliana-Pflanzen.Verwende die scharfe Spitze der Pinzette, um drei bis vier Löcher in jede Blattscheibe zu bohren, um den Prozess der Farbzufuhr zu beschleunigen. Laden Sie als Nächstes die gleiche Anzahl Blattscheiben in jede Färbetube. 30 Minuten in der Dunkelheit inkubieren.Spülen Sie danach die Blattscheiben dreimal mit doppelt destilliertem Wasser ab. Verwenden Sie Beobachtungsgel, um jedes Blatt wie zuvor beschrieben an einem Objektträger zu befestigen. Laden Sie den Objektträger auf ein konfokales Mikroskop und fokussieren Sie manuell auf eine Region von Blattmesophyllzellen, wie im Textprotokoll beschrieben, und belichten Sie dann die Blattscheiben drei Minuten lang einem UVA-Laser bei 405 Nanometern, um ROS zu erzeugen.Zeichnen Sie die Intensitätsänderung des ROS-Signals in Zeitreihen pro Blattscheibe auf. Nehmen Sie die Blattscheibe mit einem 40-fachen Wasserobjektiv und den hier gezeigten konfokalen Mikroskopeinstellungen ab. Verwenden Sie eine Pflanze, die nur mit Infiltrationspufferlösung infiltriert ist, als Negativkontrolle.Nach der Aufreinigung wird das synthetisierte PNC mit einem UV-Vis-Spektralphotometer charakterisiert und weist einen Absorptionspeak bei 271 Nanometern auf. Der Reinigungsprozess wird durch Messung des endgültigen Eluenten bestätigt. PNC-Proben werden dann mit einem fluoreszierenden DiI-Farbstoff markiert, um die Verteilung der Nanopartikel in vivo zu bestimmen.Für den DiI-markierten PNC werden drei Peaks beobachtet, während eine Messung des endgültigen Eluenten bestätigt, dass die nicht umgesetzten Chemikalien während der Reinigung ausgewaschen werden. Die Verteilung von DiI-PNC in Blattmesophylzellen wird mittels konfokaler Bildgebung bestimmt. Während in den Kontrollproben keine DiI-Farbstoffsignale nachgewiesen werden, wird das DiI-PNC in den infiltrierten Blättern co-lokalisiert mit Chloroplasten beobachtet.In vivo wird das durch PNC ermöglichte ROS-Scavenging in der Blattscheibe überwacht, indem die Änderungen der Fluoreszenzintensität in den DHE- und DCF-Farbstoffen gemessen werden. Nach drei Minuten UV-Stress zeigen die PNC-infiltrierten Blätter für beide Farbstofftypen eine signifikant geringere Intensität im Vergleich zur Pufferkontrolle ohne Nanopartikel. Ein CAT-Assay der mimetischen Aktivität zeigt eine Abnahme des Resorufin-Spiegels in dem Gemisch, das PNC enthält.Dieser Gehalt ist ein Hinweis auf den Wasserstoffperoxid-Gehalt, der daher ebenfalls abnimmt, und bestätigt die CAT-mimetische Aktivität des synthetisierten PNC. Dieses Protokoll zur Synthese von Nanocerien ist ein einfaches, schrittweises Verfahren, das Ceroxid-Nanopartikel mit kontrollierter Größe, Ladung und ROS-Abfangfähigkeiten erzeugt. Methoden zur pflanzengenetischen Modifikation zur ROS-Manipulation in vivo sind derzeit auf Pflanzenmodellarten beschränkt.Im Gegensatz dazu hat das Nanoceria-ROS-Scavenging das Potenzial, sowohl im Labor als auch im Feld auf verschiedene Wildtyp-Pflanzenarten angewendet zu werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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