Name: Isolierung des physiologisch aktiven Thylakoids und deren Einsatz in Energie-abhängige Protein Transport Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Lernen Sie die Isolierung physiologisch aktiver Thylakoide und deren Einsatz in energieabhängigen Proteintransport-Assays. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle der Transportbedingungen für Chloroplastenmembranen.

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Dieses Manuskript wurde mit finanzieller Unterstützung durch die Abteilung von Chemie, Geowissenschaften und Biosciences, 408 Büro der Grundlagenwissenschaften Energie an das US Department of Energy durch Grant DE-SC0017035 vorbereitet

1. erste Materialien
<ol><li>Ca. 55 g Erbsen für 3 Stunden in 400 mL destilliertem Wasser einweichen und dann säen in einem Plastikbehälter (35 cm x 20 cm x 6 cm) im Boden mit dünnen Schicht von Vermiculit bedeckt.</li>
	<li>Wachsen Sie das Tablett mit Erbsen bei 20 ° C unter 12/12 h hell/dunkel (50 µE/m2s)-Zyklus für 9 bis 15 Tage.</li>
	<li>Bereiten Sie Protein Substrat nach eine bevorzugte Methode. Hinweis: Haben wir Protein Substrate mit einer Vielzahl von Methoden, einschließlich 1) in-vitro- Transkription von gereinigte Plasmide gefolgt von Übersetzung mit WEIZENKEIM-Extrakte oder Kaninchen Retikulozytenzahl Lysates in Gegenwart von [3H]-Leucin oder [35S]-Methionin, 2) in-vitro- Übersetzung mit einem gekoppelten Transkription/Übersetzung-Kit wie die TnT-kits von Promega mit enzymatische wie oben beschrieben, und 3) Reinigung des überexprimieren Protein in E. Coli. Radioaktiven in-vitro- Übersetzung-Produkte sind in der Regel mit 50 mM kalt Aminosäure vor dem Gebrauch im Transport Reaktionen abgeschreckt. Jede dieser Methoden erfordert in der Regel einige Optimierungen für jedes neue Protein-Substrat. Ein Beispiel für eine gekoppelte in-Vitro -System finden Sie unter Ling und Jarvis (2016)9.</li>
</ol>(2) Chloroplasten Isolation und Quantifizierung
Hinweis: Der erste Schritt bei der Vorbereitung des Thylakoids ist die Isolierung der intakten Chloroplasten10. Alle Materialien sollten während der Zubereitung kühl gelagert werden. Wiederfreisetzung des Chloroplasten sollte schonend behandelt werden, da Bruch bei diesem Schritt anschließenden Thylakoidmembran Ertrag erheblich einschränken kann.
<ol><li>Bereiten Sie nach Lösungen im voraus.<ol>
<li>2 x Schleifen Puffer (2xGB): 100 mM K-HEPES pH 7.3, 660 mM Sorbit, 2 mM MgCl2, 2 mM MnCl2, 4 mM EDTA, 0,2 % BSA.</li>
		<li>2 x Importpuffer (2xIB): 100 mM K-Tricine oder K-HEPES pH 8.0, 660 mM Sorbit, 8 mM MgCl2. Hinweis: Ohne erkennbare Unterschiede wurden Konzentrationen von MgCl2 von 3 mM bis 10 mM verwendet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie eine kontinuierliche dichtegradient durch Zentrifugieren eine Mischung aus 15 mL Percoll und 15 mL 2xGB 30.900 g in einem festen Winkel-Rotor für 30 min bei 4 ° C mit der Bremse aus.</li>
	<li>Ca. 25 g 9-15 Tage alten Erbsen ernten und in 95 mL 1xGB zu homogenisieren. Entweder einen Mixer mit geschärften klingen oder ein Polytron wurden erfolgreich eingesetzt. Filtern Sie diese Mischung durch mindestens 2 Schichten von Miracloth in einem Trichter. Hinweis: Begrenzung der Höhe der Stammzellen Gewebe ist nicht notwendig aber erleichtern den Prozess der Homogenisierung, wodurch es Chloroplasten-Bruch, die mit längeren blending auftreten können.</li>
	<li>Pellet-3.000 g in eine schwingende Eimer Rotor für 5 min bei 4 ° C, und sanft in 1 mL 1xGB aufzuwirbeln. Ein Pinsel kann die sanfteste Wiederfreisetzung Technik sein.</li>
	<li>Sorgfältig Schicht die grüne Suspension auf die Percoll Farbverlauf und Zentrifuge bei 8.000 g in eine schwingende Eimer Rotor für 10 min bei 4 ° C mit der Bremse aus.</li>
	<li>Ernten Sie sorgfältig das untere grüne Band mit intakten Chloroplasten in ein frisches Gefäß. Drehen Sie die wiederhergestellten intakten Chloroplasten bei 1.800 g in eine schwingende Eimer Rotor für 5 min bei 4 ° C, verwerfen Sie den überstand und Aufschwemmen Sie sanft das Pellet in 1xIB. Wiederholen Sie diese Waschschritt noch einmal resuspending in 30 mL 1xIB jedes Mal mit der endgültigen Wiederfreisetzung in 1 mL 1xIB.</li>
	<li>Quantifizierung der Chlorophyllgehalt (Chl) mischen Sie 10 µL voll resuspendierte Chloroplasten mit 5 mL 80 % Aceton und Filter durch Filterpapier Whatman 1 (Nenndicke 180 µm). Aufnehmen der Extinktion bei 720 nm, 663 nm und 645 nm in einem Spektrophotometer und berechnen die Chl-Konzentration mit Hilfe der folgenden Formel11: [Chl] mg/mL = [40.2* (ein663 – ein720) + 101.4* (A645 – ein720)] * 0,1</li>
	<li>Chloroplasten, 1 mg/mL Chl Entsprechungen mit 1xIB anpassen.</li>
</ol>3. Isolierung des Thylakoids
Hinweis: Thylakoids sind durch hypotone Lyse der intakten Chloroplasten vorbereitet. Dies wird erreicht, indem man die Chloroplasten in eine Hypotonische Puffer fehlt Sorbit. Isolierte Thylakoids eignet sich für die Prüfung eines die Translokation Wege muss, Stromale Extrakt (SE) jedoch auch isoliert während dieser Vorbereitung sind entweder cpSec1 oder CpSRP Wege untersucht werden.
<ol><li>Bereiten Sie vor der Zeit die folgenden Lösungen.<ol>
<li>Hypotone Lysis Puffer: 50 mM K-Tricine oder K-HEPES pH 8.0, 8 mM MgCl2.</li>
		<li>2 x grobe Stroma-Puffer (für Konzentration der SE): 100 mM K-HEPES pH 8.0, 660 mM Sorbit, 8 mM MgCl2.</li>
		<li>Laemmli Probenpuffer (für SDS-PAGE, ergänzt mit EDTA): 125 mM Tris pH 6,8, 10 % SDS, 20 % Glycerin, 0,05 mg/mL Bromophenol blue, 10 % β-Mercaptoethanol, 10 mM EDTA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenn SE Wiederherstellung nicht erforderlich ist, Zentrifugieren der intakten Chloroplasten bei 1.000 g in eine schwingende Eimer Rotor für 6 min bei 4 ° C.<ol>
<li>Verwerfen Sie den überstand und Aufschwemmen Sie bis 1 mg/mL in hypotone Lysis Puffer. Inkubation auf Eis im Dunkeln für 10 min, mit gelegentlichen mischen.</li>
		<li>Thylakoids durch Zentrifugieren bei 3.200 g in schwingende Eimer Rotor für 8 min bei 4 ° c zu erholen Waschen Sie die Thylakoids zweimal, jeweils mit 1 bis 2 mL Lyse-Puffer resuspending. Mit 1 mL 1xIB aufschwemmen und requantify Chl als oben in den Chloroplasten-Isolierung-Protokoll.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Stromazellen Extrakt Erholung und Konzentration
<ol><li>Wenn SE Wiederherstellung erforderlich ist, teilen Sie die intakten Chloroplasten in 600 µL-Aliquots in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifugieren Sie jedes Rohr bei 1.000 g in schwingende Eimer Rotor für 6 min bei 4 ° c Hinweis: Dieser Band ist praktisch, wenn mit 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, die Störung des späteren Pellets für passives Membranen zu verhindern hilft.<ol>
<li>Bis 1 mg/mL Chl in hypotone Lysis Puffer Aufschwemmen Sie und inkubieren Sie auf Eis im Dunkeln für 10 min, wie in Schritt 3.2.1.</li>
		<li>Jedes Rohr bei 3.200 X g in schwingende Eimer Rotor für 8 min bei 4 ° C zentrifugiert und die hellen grünen oder gelben überstand folgende Chloroplasten Lyse zu einem neuen Microcentrifuge Schlauch mit ein gleiches Volumen von 2 x grobe Stroma Puffer übertragen.</li>
		<li>Thylakoids mit 2 Bände der Lyse Puffer (annähernd 0,5 mg/mL) waschen und sammle durch Zentrifugation bei 3.200 g in schwingende Eimer Rotor für 8 min bei 4 ° c Aufschwemmen Sie bis 1 mg/mL Chl in 1xIB auf Eis.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie grobe Stroma bei 42.000 g in einem festen Winkel-Rotor für 30 min bei 4 ° C, Reste Membranen zu entfernen. Immunoblotting für äußeren und inneren Umschlag Proteine kann verwendet werden, um die Reinheit des Überstands zu überprüfen.</li>
		<li>Sammeln Sie 95 % des Volumens aus jeder Tube, ohne zu stören die kleinen gelb-grün-Pellets. Beachten Sie das Volumen jedes Röhrchen entnommen.</li>
		<li>Zur Vorbereitung des konzentrierten Stromazellen Extraktes (SE) bündeln Sie die gesammelten Überstände und konzentrieren Sie fünffache mit einem 4 mL 30 kDa MWCO Konzentrator zu. Hinweis: SE vorbereitet auf diese Weise entspricht Stroma abgeleitet aus Chloroplasten bei 2,5 mg/mL CHL. Falls erforderlich, kann SE um das Zehnfache auf 5 mg/mL Chl äquivalente konzentriert sein. SE wird goldener Farbe und zähflüssig sein. Dies erfordert in den Lab Legende RT Zentrifuge mit schwingenden Eimer Rotor ca. 10 min pro mL konzentriert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. transport durch die CpTat Weg
Hinweis: Im Gegensatz zu den cpSec1 oder CpSRP, der CpTat Weg erfordert nicht lösliche Bestandteile oder exogen Energiequellen hinzugefügt; nur der lichtgetriebenen Proton Motor ist erforderlich3. Daher nur vereinzelte Thylakoids und Substrat Protein sind erforderlich für den Assay. Typische Substrate sind Übergangsformen von den 17 kDa (wie in Abbildung 1zu sehen) bzw. 23 kDa-Untereinheiten der Sauerstoff entwickelt komplexe, iOE17 und iOE23, aber Vorläufer Formen, prOE17 und prOE23, kann auch erfolgreich transportiert werden. Vorläufer-Formen haben die gesamte zweiseitige N-terminale targeting-Sequenz, während Zwischenformen nur die Thylakoidmembran targeting Sequenz.
<ol><li>Bereiten Sie CpTat Transport-Mix mit 0,33 mg/mL Chl Thylakoids, 5 mM ATP aus einem Lager in 1xIB und 8 mM Dithiothreitol (DTT) aus einem Lager in 1xIB, auf Eis zubereitet zubereitet. ATP ist nicht unbedingt erforderlich, für diese Reaktion, wenn unter Beleuchtung durchgeführt.</li>
	<li>Initiieren Transport durch die Einführung von 01:30 Volumen durch Volumen Substrat Protein in den Transport mischen. Wenn Substrat Protein in 1xIB nicht bereit ist, bereiten Sie eine 1:1 Verdünnung mit 2xIB zuerst, dann verwenden 01:30 Volumen von Volumen des verdünnten Substrates in den Transport-Mix. Hinweis: Konzentrationen des Substrates variiert je nach Art der Zubereitung. In der Regel werden in Vitro Vorbereitungen für nanomolaren mikromolaren Beträge ermöglichen, während Überexpression mikromolaren millimolaren Beträge ermöglichen wird. Nachweismethoden sind auch berücksichtigen, wie Autoradiographie und Fluorography empfindlicher als Immunoblotting sind.</li>
	<li>Beleuchten Sie die Aufhängung in 80-100 µE/m2s der photosynthetisch aktiven Strahlung (PAR) für 10 min bei Raumtemperatur. Wenn Transport Kinetik erforderlich sind, bereits equilibrate Thylakoids und Reaktion Mischung auf Raumtemperatur und für bis zu 30 min beleuchten.</li>
	<li>Stoppen Sie Transportreaktion mit einem 8-fold Verdünnung der eiskalte 1xIB zu und wieder Thylakoids durch Zentrifugation bei 3.200 g in Microcentrifuge für 5 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Entfernen Sie verbleibende Substrat, das nicht transportiert wurde, Aufschwemmen der Thylakoidmembran Pellet in 120 µL 1xIB und externen Protein zu verdauen, durch Zugabe von 6 µL von 2 mg/mL Thermolysin und 10 mM CaCl2 in 1xIB.</li>
	<li>Brüten Sie die Protease-Reaktion für 40 min auf Eis, und dann stillen Sie die Protease durch Verdoppelung mit 25 mM EDTA vorbereitet in 1xIB zu.</li>
	<li>Thylakoids durch Zentrifugieren bei 3.200 g in einem Microcentrifuge für 5 min bei 4 ° c zu erholen Waschen Sie wiederhergestellte Thylakoids in 120 μl 5 mm EDTA in 1xIB und Übertragung auf einen neuen Schlauch.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 3.200 g in einem Microcentrifuge für 5 min bei 4 ° C. In einem entsprechenden Volumen von Laemmli Probenpuffer ergänzt mit 10 mM EDTA aufzuwirbeln. Ein Volumen von 40 µL ist in der Regel genug zu erkennen Substrat auf einem SDS-PAGE-Gel und schont Probe für Wiederholung bei Bedarf Gele.</li>
	<li>Proben in ein kochendes Wasserbad für 10 min und Analysieren von SDS-PAGE. Autoradiographie, Fluorography oder westliche Beflecken von gebietsfremden oder Epitop-markierten Proteinen haben erfolgreich eingesetzt für die Erkennung von transportierten Proteine.</li>
</ol>6. transport durch den cpSec1 Weg
Hinweis: Transport durch die cpSec1-Translocon erfordert die Stromazellen Protein cpSecA112,13, beschafft durch Überexpression in E. Coli14,15 oder durch die Konzentration Stroma wiederhergestellt werden können während der Thylakoidmembran isoliert. Eine typische Substrat ist der 33 kDa-Untereinheit des Sauerstoffs entwickelt komplexe (prOE33), wie in Abbildung 2dargestellt.
<ol><li>Bereiten Sie den cpSec1-Transport-Mix mit 0,33 mg/mL Chl Thylakoids, 0,83 mg/mL Chl gleichwertige SE oder 1,5 μg rekombinantes cpSecA1 und 5 mM ATP auf Eis, und 10 min inkubieren. Eine typische Transport Reaktionsgemisch hier ist 72 μL von 60 μl aufgrund der SE Zusatz.<ol>
<li>Wenn rekombinante cpSecA1 statt SE genutzt werden, gereinigtes cpSecA1 mit einem gleichen Volumen des 2xIB anpassen, dann verdünnen zu einer bequemen Konzentration die Transport-Reaktionen (z. B. 0,75 µg/µL) hinzu. Hinweis: Für die langfristige Lagerung, cpSecA1 lagert auf Eis in einem kontrollierten, gekühlten Raum nach der Reinigung als Einfrieren schafft Aktivität.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Initiieren Transport durch die Einführung von 01:10 Volumen durch Volumen Substrat Protein für den Transport mischen. Wenn Substrat Protein in 1xIB nicht bereit ist, bereiten Sie eine 1:1 Verdünnung mit 2xIB und den Transport Mix fügen Sie 01:10 Volumen von Volumen des verdünnten Proteins hinzu.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für 10 min unter 80 – 100 µE/m2s PAR. Wiederum können längere Zeiten für Kinetik oder bestimmten Substraten erforderlich sein.</li>
	<li>Nach der Lichtbehandlung, verdünnen 8-fach mit eiskalten 1xIB und Zentrifuge Reaktionen bei 3200 g in Microcentrifuge für 5 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Thermolysin behandelt und mit EDTA als oben in Schritten 5,5 bis 5,7 ablöschen.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 3.200 g in Microcentrifuge für 5 min bei 4 ° C und das Pellet in einem entsprechenden Volumen von Laemmli Probenpuffer ergänzt mit 10 mM EDTA Aufschwemmen. Legen Sie im kochenden Wasserbad für 10 min vor der Verladung auf SDS-PAGE Gel.</li>
</ol>7. Aufnahme durch die CpSRP Weg
Hinweis: Die CpSRP-vermittelte Integration von Licht, die Ernte komplexe Proteine (LHCP) in Abbildung 3 zu sehen erfordert cpSRP54, cpSRP43 und CpFtsY16. Diese Komponenten sind die Transportreaktion durch konzentrierte Stromazellen Extrakt, für den cpSec1-Transport-Protokoll zur Verfügung gestellt.
<ol><li>Bereiten Sie die CpSRP Mix mit 0,33 mg/mL Chl Thylakoids, 0,83 mg/mL entspricht SE Chl und 5 mM ATP auf Eis zu transportieren und 10 min inkubieren.</li>
	<li>Initiieren Transport durch die Einführung von 01:10 Volumen durch Volumen Substrat Protein für den Transport mischen. Wenn Substrat Protein in 1xIB nicht bereit ist, bereiten Sie eine 1:1 Verdünnung mit 2xIB und den Transport Mix fügen Sie 01:10 Volumen von Volumen des verdünnten Proteins hinzu.</li>
	<li>Inkubieren Sie Reaktion bei Raumtemperatur für 10 min bei 80 – 100 µE/m2s PAR.</li>
	<li>Nach der Lichtbehandlung, verdünnen 8-fach mit eiskalten 1xIB und Zentrifuge Reaktionen bei 3.200 g in Microcentrifuge für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen und das Pellet in 120 µL 1xIB Aufschwemmen.</li>
	<li>Thermolysin als oben in den Abschnitten 5,5 bis 5,7 behandeln. Thermolysin Verdauung ist hier notwendig, erfolgreiche Membran Integration zu bewerten. Waschen Sie wiederhergestellte Thylakoids in 120 μl 5 mm EDTA in 1xIB und Übertragung auf einen neuen Schlauch.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 3.200 g in Microcentrifuge für 5 min bei 4 ° C und Aufschwemmen der Pellet wieder in einem entsprechenden Volumen von 2 X Laemmli-Puffer mit 10 mM EDTA ergänzt. Legen Sie im kochenden Wasserbad für 10 min vor der Analyse von SDS-PAGE. Hinweis: Die Integration von Reifen LHCP (mLHCP) bemisst sich durch das Auftreten von einer Protease-geschützte Abbauprodukt (mLHCP-D) ca. 1,5-2 kDa kleiner als die uncleaved mLHCP17.</li>
</ol>

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<li>Frielingsdorf, S., Jakob, M., Klösgen, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stromal+pool+of+TatA+promotes+Tat-dependent+protein+transport+across+the+thylakoid+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A stromal pool of TatA promotes Tat-dependent protein transport across the thylakoid membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (49), 33838-33845 (2008).</li>
<li>Tu, C. -J., Schuenemann, D., Hoffman, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+FtsY%2C+chloroplast+signal+recognition+particle%2C+and+GTP+are+required+to+reconstitute+the+soluble+phase+of+light-harvesting+chlorophyll+protein+transport+into+thylakoid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chloroplast FtsY, chloroplast signal recognition particle, and GTP are required to reconstitute the soluble phase of light-harvesting chlorophyll protein transport into thylakoid membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (38), 27219-27224 (1999).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Chloroplasten und Thylakoidmembran isolation
Übermäßiger Bruch führt in armen Chloroplasten Isolierung und damit schlechte Thylakoidmembran nach Trennung im Verlauf ergeben. Es empfiehlt sich, die geerntete Gewebe sanft zu homogenisieren, indem sichergestellt wird, dass sämtliches Material eingetaucht ist, vor dem Mischen und pulsieren in 15 s Zyklen bis vollständig homogenisiert. Verwenden Sie ggf. mehrere kürzere Runden mit weniger Gewebe in jeder Runde.
Kühl-alle Ma...

Fast alle die proteinhaltige Maschinen verantwortlich für die ordnungsgemäße Chloroplasten Funktion muss aus dem Zytosol1umgesiedelt werden. Die Chloroplasten-Umschläge sind Protein Substrate durch das Translocon der äußeren Membran (TOC) und die Translocon der inneren Membran (TIC)2eingeführt. Weitere Ausrichtung auf die Thylakoidmembran erfolgt Membran und Lumen durch Twin Arginin Translokation (CpTat)3, die sekretorischen (cpSec1)4, Signal Anerkennung Teilchen (CpSRP)5, und die spontane Aufnahme Wege6 . Eine Methode für die High Yield Isolierung der physiologisch aktiven Chloroplasten und der Thylakoidmembran Membranen ist notwendig zur Messung der Energetik und Kinetik einer Translokation Veranstaltung, zu die vielfältigen Transportmechanismen in jeder Weg zu verstehen und zu lokalisieren eine bestimmtes Protein Substrat für eines der sechs verschiedene Fächer der Chloroplasten von Interesse.
Die Isolation der Membranen aus den Chloroplasten bietet bessere experimentelle Kontrolle über Umweltfaktoren (z. B. Salz und Substrat-Konzentrationen, die Anwesenheit von ATP/GTP und pH-Bedingungen), die die Messung der Transport Energetik zu beeinflussen und Kinetik. Dieser in-vitro- Umgebung eignet sich für die Erforschung der mechanistischen Details der Translokation aus den gleichen Gründen. Darüber hinaus während predictive Software für die Lokalisierung der Chloroplasten Proteine7,8verbessert hat, bieten in-vitro- Transport-Assays einer schnelleren Methode zur Bestätigung über Mikroskopie-basierte fluoreszierenden Proben, die erfordern Sie eine genetisch codierte fluoreszierende Tag, Pflanzentransformation und/oder spezifische Antikörper. Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle für Chloroplasten und Thylakoidmembran Isolationen von Erbsen (Pisum Sativum), sowie für Transport-Assays für jeden der die ENERGIEABHÄNGIGE Thylakoidmembran Translokation Wege optimiert.

<table><tbody><tr><td>Pisum sativum seeds</td><td>Seedway LLC, Hall, NY</td><td>8686 - Little Marvel</td><td></td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Calbiochem, Gibbstown, NJ</td><td>475855-1</td><td></td></tr><tr><td>80% Aceton</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>67-64-1</td><td></td></tr><tr><td>Mixer mit geschärften Klingen</td><td>Waring Commercial</td><td>BB155S</td><td></td></tr><tr><td>Polytron 10-35</td><td>Fischer Sci</td><td>13-874-617</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>GE17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Beckman J2-MC mit JA 20 Rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>8043-30-1180</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC-5B mit HB-4 Rotor</td><td>Sorvall</td><td>8327-30-1016</td><td></td></tr><tr><td>100 mM Dithiothreitol (DTT) in 1xIB</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>12/3/83</td><td>Kann in Aliquoten für die zukünftige Verwendung eingefroren werden</td></tr><tr><td>200 mM MgATP in 1xIB</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>74804-12-9</td><td>Kann für die zukünftige Verwendung in Aliquoten eingefroren werden</td></tr><tr><td>Thermolysin in 1xIB (2mg/ml)</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>9073-78-3</td><td>Kann für die zukünftige Verwendung in Aliquoten eingefroren werden</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>K-Tricine</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Sorbit</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>50-70-4</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Manganchlorid</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>13446-34-9</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>115-39-9</td><td></td></tr><tr><td>B-Mercaptoethanol</td><td>Sigma, Saint Louis, MO</td><td>60-24-2</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung des physiologisch aktiven thylakoids und deren einsatz in energie-abhängige protein transport assays

Isolation of Physiologically Active Thylakoids and Their Use in Energy-Dependent Protein Transport Assays

Chloroplasten sind die Organellen in grünen Pflanzen verantwortlich für zahlreiche wichtige Stoffwechselwege, die vor allem Photosynthese. Innerhalb der Chloroplasten der Thylakoidmembran-Membran-System beherbergt die photosynthetische Pigmente, Reaktion-Zentrum-komplexe und die meisten der Elektron-Träger, und ist verantwortlich für Licht-abhängige ATP-Synthese. Über 90 % der Chloroplasten Proteine sind im Zellkern codiert, übersetzt in die Zellflüssigkeit und anschließend in die Chloroplasten importiert. Protein-Weitertransport in oder über der Thylakoidmembran Membran nutzt eine der vier Translokation Wege. Hier beschreiben wir eine hochverzinsliche Methode zur Isolierung von Transport-kompetente Thylakoids aus Erbsen (Pisum Sativum), zusammen mit Transport-Assays durch drei Energie-abhängige CpTat, cpSec1 und CpSRP-vermittelten Signalwege. Diese Methoden ermöglichen Experimente bezüglich Thylakoidmembran Protein Lokalisierung, Transport-Energetik und die Mechanismen der Protein Translokation über biologische Membranen.

Um erfolgreich transportiert Substratmenge einschätzen zu können, ist es sinnvoll, einen oder mehrere "prozentuale Eingabe" Bahnen gehören. Für die unten dargestellten Daten wurde 10 % des endgültigen Transportreaktion ohne Thylakoids verwendet. Diese "prozentuale Eingabe" hilft auch, um die Größe des Substrats Vorläufer zu visualisieren. Der Prozentsatz ist eine bekannte und definierte Menge an Substrat mit denen zu vergleichen, die transportiert Substrat gegen und kann skaliert werden o...

Wir präsentieren Protokolle hierin für High Yield Isolierung des physiologisch aktiven Thylakoids und Protein Transport Assays für die Chloroplasten Twin Arginin Translokation (CpTat), sekretorische (cpSec1) und Signalwege Anerkennung Teilchen (CpSRP).

Isolierung des physiologisch aktiven Thylakoids und deren Einsatz in Energie-abhängige Protein Transport Assays

Chloroplasts are the organelles in green plants responsible for carrying out numerous essential metabolic pathways, most notably photosynthesis. Within ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen bezüglich der Mechanismen und Energetik des Proteintransports über Chloroplastmembranen sowie die Lage von Proteinen in Plastiden zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik für Thylakoid-Protein-Targeting ist, dass es eine vollständige Kontrolle der Umgebung des Thylakoids während des Transports ermöglicht, einschließlich Temperatur, pH, ionische Bedingungen und Vorläuferkonzentrationen. Beginnen Sie mit dem Einweichen von etwa 55 Gramm Erbsen in 400 Milliliter destilliertes Wasser für drei Stunden.Die durchnässten Erbsen in einer Plastikschale im Boden säen, mit einer dünnen Schicht Vermiculit bedeckt, und wachsen für neun bis 15 Tage, wie im Textprotokoll beschrieben. Am Tag der Chloroplastenisolierung einen kontinuierlichen Dichtegradienten vorbereiten, indem Sie ein Gemisch aus 15 Milliliter Percoll und 15 Milliliter 2xGB Puffer in einem 15 Milliliter Polykarbonat-Hochgeschwindigkeitszentrifugenrohr bei 30, 900 g in einem festwinkeligen Rotor für 30 Minuten bei vier Grad Celsius mit abbremsendem Abstand zentrifugieren. Dann ernten Sie etwa 25 Gramm von neun bis 15 Tage alten Erbsentrieben.Fügen Sie sie zu 95 Milliliter kalten 1xGB Puffer in einem gekühlten Mixer, mit geschärften Klingen. Und homogenisieren. Filtern Sie diese Mischung durch mindestens zwei Schichten Käsetuch, in einem Trichter über einem gekühlten Becher gelegt.Zentrifugieren Sie das Filtrat mit einem 15 Milliliter Polycarbonat Zentrifugenrohr in einem schwingenden Schaufelrotor bei 3.000 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und verwenden Sie einen Pinsel, um das Pellet vorsichtig in einem Milliliter 1xGB wieder aufzuhängen. Danach verwenden Sie eine GlashaltungPipette, um die Bildschirmaufhängung vorsichtig auf dem Percoll-Gradienten zu schichten.Zentrifugieren Sie ihn in einem schwingenden Schaufelrotor bei 8 000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius mit abbremsender Bremse. Mit einer Haltungspipette wieder vorsichtig das untere grüne Band mit intakten Chloroplasten in ein frisches 50 Milliliter Polycarbonat-Rohr übertragen und 30 Milliliter 1xIB Puffer hinzufügen. Zentrifugieren Sie das Rohr in einem schwingenden Schaufelrotor bei 1 800 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Nach dem Wegwerfen des Überstandes das Pellet vorsichtig in einem Milliliter 1xIB mit einem Pinsel wieder aufsetzen. 30 Milliliter 1xIB und Zentrifuge unter den gleichen Bedingungen wieder einwaschen. Setzen Sie das Pellet nach der letzten Zentrifugation in einem Milliliter 1xIB wieder aus.Um die Chlorophyllkonzentration zu bestimmen, mischen Sie 10 Mikroliter vollständig resuspendierter Chloroplasten mit fünf Millilitern 80%Aceton. Filtern Sie ein 180 Mikrometer dickes Filterpapier mit 11 Mikrometer Porengröße und bestimmen Sie dann die Chlorophyllkonzentration per Spektralphotometer. Das Chloroplastengemisch mit kaltem 1xIB auf ein Milligramm pro Milliliter verdünnen.Um die Thylakoide zu isolieren, wenn stromalextrakt nicht notwendig ist, wie cpTat Transport, Zentrifuge intakte Chloroplasten in 1,5 Milliliter-Rohren in einem schwingenden Schaufelrotor bei 1.000 g bei vier Grad Celsius für sechs Minuten. Danach entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet im hypotonischen Lysepuffer wieder auf, um mit einer Mikropipette ein Milligramm pro Milliliter zu erreichen. Inkubieren Sie auf Eis im Dunkeln mit gelegentlichem Mischen für 10 Minuten.Um Thylokoide zu bergen, zentrieren Sie in einem schwingenden Schaufelrotor bei 3, 200 g bei vier Grad Celsius für acht Minuten. Waschen Sie die Thylokoide zweimal, indem Sie das Pellet mit einem bis zwei MilliliterLysepuffer wieder aufhängen und dann unter den gleichen Bedingungen zentrifugieren. Nach der letzten Zentrifugation das Pellet in einem Milliliter 1xIB-Puffer wieder aufsetzen und die Chlorophyllkonzentration in isolierten Thylokoiden mit einem Spektralphotometer bestimmen, wie zuvor gezeigt.Für Wege, die eine stromale Extraktrückgewinnung erfordern, wie CPSec1 und CPSRP, entsetzen 600 Mikroliter isolierter Chloroplasten in einem schwingenden Schaufelrotor und Zentrifuge bei 1.000 g für sechs Minuten bei vier Grad Celsius. Bei der Chloroplastenlyse setzen wir das Pellet mit 600 Mikroliter hypotonischen Lysepuffer aus. 10 Minuten lang im Dunkeln mit gelegentlichem Mischen auf Eis bebrüten.Dann zentrieren Sie die Rohre in einem schwingenden Schaufelrotor bei 3, 200 g für acht Minuten bei vier Grad Celsius. Um den Stroma zu speichern, übertragen Sie den hellgrünen auf gelben Überstand auf ein neues Mikrozentrifugenrohr und fügen Sie ein gleiches Volumen von 2x rohen Stromalpuffer hinzu. Um Thylokoide zu waschen, fügen Sie zwei Volumina Lysepuffer und Zentrifuge bei 3, 200 g für acht Minuten bei vier Grad Celsius hinzu.Setzen Sie das Pellet in 1xIB wieder auf, um eine Chlorophyllkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter zu erreichen, und legen Sie es für die spätere Verwendung in Transporttests auf Eis beiseite. Restmembranen aus Rohstroma entfernen, indem Sie den verdünnten Rohstroma in einem festen Winkelrotor bei 42 000 g 30 Minuten bei vier Grad Celsius zentrieren. Dann sammeln Sie 95% des Volumens aus jedem Rohr, um sicherzustellen, dass das kleine gelbe grüne Pellet nicht gestört wird, während Sie das Volumen aus jedem Rohr notieren.Um den konzentrierten Stromalextrakt vorzubereiten, bündeln Sie die gesammelten Überstande. Verwenden Sie dann einen vier Milliliter 30 Kilodalton Molekulargewichts-Cut-off-Konzentrator, um den Extrakt fünffach zu konzentrieren. Um den cpTat-Transport in einer 1,5-Milliliter-Röhre auf Eis zu prüfen, mischen Sie die isolierten Thylokoide zu einer endgültigen Chlorophyllkonzentration von 0,33 Milligramm pro Milliliter, fünf Millimolar ATP in 1xIB und acht Millimolaren DTT in 1xIB.Um den Transport zu initiieren, führen Sie Substratprotein in den Transportmix ein. Führen Sie die Reaktion durch Beleuchtung der Suspension mit 80 bis 100 Mikroeinsteinen pro Quadratmeter pro Sekunde photosynthetisch aktiver Strahlung für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Um die Transportreaktion zu stoppen, verdünnen Sie die Suspension achtfach mit eiskaltem 1xIB.Zentrifuge bei 3, 200 g in einer Mikrozentrifuge für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um Thylokoide zurückzugewinnen. Nach dem Wegwerfen des Überstandes das Pellet in 120 Mikrolitereiseis 1xIB wieder aufsetzen. Um die CPSec1- oder PSRP-Wege zu assayen, mischen Sie Folgendes in einer 1,5-Milliliter-Röhre auf Eis.Thylakoide auf eine endgültige Chlorophyllkonzentration von 0,33 Milligramm pro Milliliter, 0,83 Milligramm pro Milliliter Chlorophylläquivalente stromalen Extrakt und fünf Millimolar ATP in 1xIB hergestellt. Bringen Sie die Reaktion auf das gewünschte Volumen mit eiskaltem 1xIB und inkubieren Sie auf Eis für 10 Minuten. Um den Transport zu initiieren, führen Sie 10% Volumenvolumen von Substratprotein in diesen Transportmix ein.Beleuchten Sie mit 80 bis 100 Mikroeinsteinen pro Quadratmeter pro Sekunde photosynthetisch aktiver Strahlung 10 Minuten bei Raumtemperatur. Um die Reaktion zu stoppen, verdünnen Sie die Suspension achtfach mit eiskalt 1xIB. Zentrifuge bei 3, 200g in einer Mikrozentrifuge für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Nach dem Wegwerfen des Überstandes das Pellet in 120 Mikrolitereiseis 1xIB wieder aufsetzen. Um Restsubstrat zu entfernen, das nicht transportiert wurde, verdauen Sie externes Protein, indem Sie sechs Mikroliter mit zwei Milligramm pro Milliliter Thermolysin und 10 Millimolar Calciumchlorid in 1xIB hinzufügen. Inkubieren Sie diese Protease-Reaktion auf Eis für 40 Minuten.Quench die Protease durch Verdoppelung des Volumens mit 25 Millimolar EDTA in 1xIB. Zentrifuge bei 3, 200 g in einer Mikrozentrifuge für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um Thylokoide zurückzugewinnen. Nach dem Entfernen des Überstandes, wiederaufenthalten wiedergewonnene Thylokoide in 120 Mikroliter von fünf milimolaren EDTA in 1xIB, und übertragen sie auf eine neue 1,5 Milliliter-Röhre.Nach der zentrifugieren den Überstand wieder bei 3, 200 g in einer Mikrozentrifuge für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem entsprechenden Volumen laemmli Probenpuffer, ergänzt mit 10 Millimolar EDTA, wieder auf. Legen Sie die Proben 10 Minuten in ein kochendes Wasserbad. Analysieren Sie die Beispiele nach SDS-Seite.Der Transport von iOE17-Protein durch den cpTat-Weg führte zu einer Größenverschiebung von zwei bis drei Kilodaltonen zwischen dem eingeführten Substrat und der ausgereiften verarbeiteten Form. Dies ist auf die Spaltung des n-Klemmensignalpeptids zurückzuführen, das auf einen erfolgreichen cpTat-Transport hinweist. Die Thermolysinbehandlung hinterlässt nur das erfolgreich transportierte und damit proteusresistente reife Band.Der Transport des OE33-Vorläufers durch den CPSec1-Weg führte zu einer Größenverschiebung des ausgereiften Substrats und zum Proteusschutz des transportierten Substrats. Die Einfügung des LHCP-Vorläufers in die Thylokoid-Membran über den cpSRP-Signalweg, der durch Thermolysinverdauung ausgewertet wurde, führte zu einer Größenverschiebung von 1,5 bis zwei Kilodaltonen. Dies deutete auf eine erfolgreiche Membraneinfügung hin, da die Membran das Uncleaved des reifen LHCP-Abbauprodukts vor einer vollständigen Proteolyse schützt.Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Thylokoide isolieren und die Tranportivität durch die energieabhängigen cpTat-, cpSec 1- und cpSRP-Pfade isolieren können. Einmal gemeistert kann diese Technik in drei bis vier Stunden durchgeführt werden, wenn richtig durchgeführt. Obwohl in diesem Video nicht dargestellt, halten wir die Oberlichter im Labor in der Regel aus, wenn wir mit photosynthetisch aktiven Chloroplasten und Thylakoiden arbeiten.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, isolierte Chloroplasten und Thylakoide bei vier Grad Celsius zu halten. Denken Sie daran, Chloroplasten am Anfang sanft wieder auszusetzen. Vermeiden Sie es, den Procoll-Gradienten nach dem ersten Zentriumierungsschritt zu stören.Zusätzlich kann eine prozentuale Eingangsprobe parallel zu den Transportreaktionen vorbereitet werden und auf demselben Gel ausgeführt werden, um den Substrattransport abzuschätzen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit radioaktiven Substraten eine gewissenhafte Handhabung und eine ordnungsgemäße PSA erfordert. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Protein-Targeting, um die Energetik, Kinetik und einzigartige Mechanismen für den Proteintransport über Thylakoid-Membranen zu erforschen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Die beschriebenen Vergleichs, quantitative Proteomik-Ansatz zielt auf die Erlangung Einblicke in die Zusammensetzung von Multiproteinkomplexen unter verschiedenen Bedingungen und wird durch den Vergleich genetisch verschiedenen Stämmen nachgewiesen. Für die quantitative Analyse gleichen Volumina verschiedener Fraktionen aus einem Saccharose-Dichtegradienten durch Massenspektrometrie vermischt und analysiert.

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Da Mitochondrien nur ein kleiner Prozentsatz der Pflanzenzelle sind, benötigen sie für eine Reihe von Studien gereinigt werden. Mitochondrien können aus einer Vielzahl von Pflanzenorganen durch Homogenisierung, gefolgt von Differential und Dichte Gradienten Zentrifugation zu einem hochgereinigten mitochondriale Bruchteil isoliert werden.

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Hier präsentieren wir ein Protokoll zur solubilisiert Thylakoidmembran komplexe durch Native grün Gelelektrophorese getrennt. Grüne Gel Bänder zeichnen sich danach durch Zeit korreliert Single Photon Counting (TCSPC) und grundlegenden Schritte für die Datenanalyse werden zur Verfügung gestellt.

Trennung von Spinat Thylakoidmembran Proteinkomplexe durch Native grün Gelelektrophorese und Band Charakterisierung mittels Time-Correlated Single Photon Counting

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Vorbereitung der Chloroplasten Sub Fächer von Arabidopsis für die Analyse von Protein-Lokalisierung durch Immunoblotting oder Proteomics

Wir präsentieren ein zweistufiges Protokoll für die qualitativ hochwertige Isolierung von Mitochondrien, das mit der Entdeckung und Quantifizierung von Proteinen auf Proteomebene kompatibel ist. Unser Protokoll kommt ohne Gentechnik aus und eignet sich daher für die Untersuchung von Mitochondrien aus allen primären Zellen und Geweben.

Zweistufige tag-freie Isolierung von Mitochondrien für eine verbesserte Proteinentdeckung und -quantifizierung

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Lernen Sie die Isolierung physiologisch aktiver Thylakoide und deren Einsatz in energieabhängigen Proteintransport-Assays. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle der Transportbedingungen für Chloroplastenmembranen.

Isolierung des physiologisch aktiven Thylakoids und deren Einsatz in Energie-abhängige Protein Transport Assays

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