Name: Induzierbaren und Reversible Dominant-Negative (DN) Protein Hemmung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Lernen Sie die induzierbare und reversible Dominant-Negative-Proteinhemmung zur bedingten Inaktivierung von Proteinen in Zellkultur und Mausmodellen. Diese Methode ermöglicht die partielle Abschaltung mit erhaltener endogener Aktivität.

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Die pCS2 + CB-Myc6 Vektor war ein Geschenk von Marshall Horwitz (University of Washington, Seattle, WA, USA). Die HEI-OC1 Zellen wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Fedrico Kalinec (David Geffen School of Medicine, UCLA, Los Angeles, CA, USA). Technischer Support sorgte die UNMC Maus Genom Engineering Core (c.b. Gurumurthy, Don Harms, Rolen Quadros) und der Creighton Universität integrierte Biomedical Imaging Facility (Richard Hallworth, John Billheimer). Gewähren Sie durch eine institutionelle Development Award (IDea) von der NIH/NIGMS UNMC Maus Genom Engineering unterstützt wurde, Nummer P20 GM103471. Die integrierte biomedizinische Bildgebung Anlage wurde von der Creighton University School of Medicine und Stipendien, GM103427 und GM110768 von der NIH/NIGMS unterstützt. Die Anlage wurde mit Unterstützung durch Zuschüsse aus dem National Center for Research Resources (RR016469) gebaut und die NIGMS (GM103427). Die Mauslinien erzeugt in dieser Studie wurden auf Creighton University Animal Ressource Facility, gehalten dessen Infrastruktur durch einen Zuschuss von NIH/NCRR G20RR024001 verbessert wurde. Diese Arbeit vorbei an Unterstützung durch ein NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE gewähren (Shelley D. Smith), NIH/ORIP R21OD019745-01A1 (S.M.R.-S.) und einer aufstrebenden Forschungsstipendium aus der Anhörung Health Foundation (zu S. Tarang) erhalten. Der Inhalt dieser Forschung ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

Generation der transgenen CBRb Maus und alle Tierpflege Experimente im Zusammenhang mit der Studie wurden genehmigt von der Creighton Universität institutionelle Tier Pflege und Nutzung Committee (IACUC) und durch ihre Richtlinien durchgeführt.
(1) transgenen CB-Myc6-Rb1 Konstrukt
Hinweis: Das Klonen von CBRb in einen Vektor pTet_Splice erfolgte in mehreren Schritten (Abb. 1A und 1 b).
<ol><li>
Führen Sie die erste Stufe Klonen in der pCS2 + CB-Myc6 Vektor.
	<ol>
<li>CBRb Transgen Konstrukt zu schaffen, zu verstärken 1583-bp lange Rb1 cDNA Fragment (528 Aminosäuren entsprechend der Aminosäure Region 369 – 896) des RB1 Proteins mit Hilfe des folgenden Primers festgelegt: für EcoRI +RB 1243F, verwenden GGGGAATTCA TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTC, und verwenden Sie für XbaI + EcoRV +RB 2826R, CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC.</li>
		<li>Klon des Fragments (1546-bp) zwischen EcoR1 und XbaI Restriktionsschnittstellen des pCS2 + CB-Myc6 Vektor als zuvor beschriebenen1,12erzeugt. Hinweis: 1012-bp-langen CB-Myc6 Konstrukt (337 Aminosäuren) auf das Rb1 -Fragment fusioniert resultierte in einem Protein ca. 865 Aminosäuren (etwa 108 kDa), die etwas kleiner als die endogene RB1-Protein (~ 110 kDa) ist (Abbildung 1 Ein), mit einem CB-Myc6 Tag am N-Terminus und Rb1 am C-Terminus.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Führen Sie die zweite Stufe subcloning in den pTet-Spleiß-Vektor.
	<ol>
<li>Die CB-RB-Myc6-Fusion-Fragment zu verstärken und die Tet-Förderer zu gewinnen, verstärken die Kassette, bestehend aus der CB-myc6-Rb1 mit Primer, enthält die EcoRV (XbaI + EcoRV + RB 2826R) und SalI Websites: für SalI +CBF Verwenden Sie CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTC.</li>
		<li>Subclone das Fragment erzeugt (2567 bp) in den pTet-Spleiß-Vektor zwischen SalI und EcoRV Restriktionsschnittstellen, so eine Art und Weise, die das gesamte TetO-DN-CB-myc6-Rb1 Transgen, einschließlich der SV40-Intron und der PolyA signalisieren, können durch einen einzigen Verdauung mit NotI (Abbildung 1B) isoliert werden. Hinweis: Das NotI-Fragment wurde verwendet, um die transgenen Geldgeber zu generieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) in vitro-Tests des Transgens TetO-DN-CB-myc6-Rb1
<ol><li>
DOX-Verordnung: NIH3T3 Zelllinie Hinweis: Sofern nicht anders angegeben, sind alle Volumes für eine 6-Well-Platte angepasst worden.<ol>
<li>Wachsen Sie NIH3T3 Zellen nach Vorgaben des Herstellers, unter Verwendung der empfohlenen Zellkulturmedien, enthält 10 % fötalen Rinderserum bei 37 ° C mit 10 % CO2.</li>
		<li>Cotransfect die Zellen mit pTet-Spleiß und pCMV-Tet3G Vektoren (aus Schritt 1) für 24 h die Schritte unten zum Cotransfection erwähnt.<ol>
<li>Mischen Sie 2 – 4 µL der Lipid-basierte Transfection Reagens/Brunnen und 1 mL der unvollständig (ohne Serum) Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) für 5 min bei Raumtemperatur. Für ein 12 oder 24-Well-Platte 250 oder 500 µL Kulturmedien, bzw. verwenden, und die Lautstärke Transfection Reagens entsprechend.</li>
			<li>Die Transfektion Reagenz-DMEM 2 – 3 µg von Plasmid DNA/Well hinzufügen und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
			<li>Fügen Sie die Mischung mit DNA und die Transfection Reagens in DMEM in jede Vertiefung. Fügen Sie nach 3 – 4 h Inkubation 1 mL der komplette Medien (so dass der letzte Band 2 mL/gut ist). Halten Sie Aliquote Dox Aktie (1 mg/mL) und fügen Sie 2 µL in jedem der Brunnen (+ Dox hinzu). Inkubation der Zellen bei 37 ° C mit 5 % CO2. Hinweis: Kontrollproben sollte bestehen aus cotransfected Zellen, die nicht mit Dox behandelt (-Dox), sowie NIH3T3 Zellen nur mit der Transaktivator pCMV-Tet3G Vektor transfiziert und 24 h lang mit Dox behandelt. Für pCMV-Tet3G, Konzentrationen von 0,1 – 1 µg/mL Dox sollte ausreichen, um die Expression des Transgens zu induzieren.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Testen Sie die Reversibilität des Konstrukts mit HEK293-Zelllinie.
	<ol>
<li>Test der Reversibilität des Transgens TetO-DN-CB-myc6-Rb1 Kultur HEK293 Zellen in Adlers Minimum wesentliches Medium (EMEM) nach Vorgaben des Herstellers und cotransfect mit pTet-Spleiß und pCMV-Tet3G Vektoren für 24 h, wie beschrieben oben (Schritt 2.1.2).</li>
		<li>Entfernen Sie für die Transgen-Inaktivierung das Dox-haltigen Medium nach 24 h, waschen Sie die Zellen 2 x-3 x mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und inkubieren sie im Dox-freie Medien für weitere 24 h. Hinweis: Bei Dox-entfernen sollte das Transgen Inaktivierung und regelmäßige Proteinexpression innerhalb dieser 24-Stunden-Frist wieder aufgenommen werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Um die Funktionalität des Konstrukts TetO-DN-CB-myc6-Rb1 in Förderung der ungeplante Zellproliferation zu beurteilen, führt die funktionelle Untersuchungen mit einer HEI-OC1 Zelllinie wie unten beschrieben.
	<ol>
<li>HEI-OC1 Zellkulturen in 10 % DMEM unter freizügigen Bedingungen (33 ° C mit 10 % CO2). Zählen Sie für Zell-Proliferation Studien die Zellen mit einer Zelle-Theke und Platte 10.000 HEI-OC1 Zellen auf einer 96-Well-Platte in einem Volumen von 200 µL. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht.</li>
		<li>Am folgenden Tag, führen Sie eine transiente Cotransfection pTet-Spleiß und pCMV-Tet3G Vektoren mit einem Lipid-basierte Transfection Reagens (siehe Schritte 2.1.2). Führen Sie in einem separaten gut PmR-ZsGreen1 Transfektion at2-µg mit Lipid-basierte Transfection Reagens (Schritte 2.1.2) zum Berechnen der Transfektion Rate. Verwenden Sie nicht transfizierten Zellen als Steuerelemente.</li>
		<li>Das Vorhandensein von grün fluoreszieren unter dem Fluoreszenzmikroskop (Erregung = 485 nm, Emission = 530 nm) für den transfizierten Zellen 24 h nach Transfektion. Zeichnen Sie das Vorhandensein oder Fehlen der grüne Fluoreszenz und berechnen Sie die Rate der Transfektion als die Gesamtzahl der GFP-positiven Zellen (transfizierten Zellen) über die Zellen mit DAPI (total Zellen) gekennzeichnet. Hinweis: Eine Transfektion Rate von ~ 70 % geschätzt.</li>
		<li>Um Transgene Ausdruck zu induzieren, hinzufügen 1 µg/mL Dox auf eine Teilmenge von transfizierten Zellen während der Verwendung der anderen Teilmenge als Kontrolle (-Dox). Verwenden Sie unbehandelte HEI-OC1 Zellen als zusätzliche Steuerelemente.</li>
		<li>Zur Beurteilung der Zellproliferation verwenden Sie eine Zelle Verbreitung Kit laut Protokoll des Herstellers.<ol>
<li>Kurz gesagt, 48 h nach Transfektion, entfernen das Zellkulturmedium und 100 µL 1 x Farbstoff-verbindliche Lösung in jede Vertiefung der Mikrotestplatte. 1 h bei 37 ° c inkubieren</li>
			<li>Danach messen der Fluoreszenzintensität jeder Probe mit einem Fluoreszenz Mikrotestplatte Reader (Erregung = 485 nm, Emission = 530 nm).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Um Zellproliferation mit Immunocytochemistry weiter zu bewerten, die HEI-OC1 Zellen auf einem Deckglas in einem 12-Well-Platte-Platte und über Nacht bei 37 ° c inkubieren<ol>
<li>Am nächsten Tag mit dem pTet-Spleiß und pCMV-Tet3G cotransfect und führen Sie die Dox Behandlung (+ Dox). Verwenden Sie untransfected Zellen als Steuerelemente. Am Prozess HEI-OC1 Zellen für die Kennzeichnung von Ki-67.</li>
			<li>Befestigen Sie die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit PBS-Puffer, pH 7,4, für 10 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen 3 X mit eiskaltem PBS und die Zellen in 0,25 % nicht-ionische Reinigungsmittel mit PBS-Puffer für 10 min inkubieren.</li>
			<li>Waschen Sie die Zellen wieder, 3 X mit PBS-Puffer für 5 min und Block mit 10 % Serum in eine feuchte Kammer für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
			<li>Die Zellen in 500 µL der Ki-67 Primärantikörper (Verdünnung 1: 200) für 3 h bei Raumtemperatur inkubieren oder über Nacht bei 4 ° C.</li>
			<li>Waschen Sie die Zellen 3 X 5 min. mit PBS. Danach Inkubation der Zellen mit dem sekundären Antikörper für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.</li>
			<li>Die sekundäre Antikörper-Lösung entfernen und Waschen der Zellen 3 X mit PBS für 5 min in der Dunkelheit.</li>
			<li>Brüten Sie für Phalloidin etikettieren die HEI-OC1 Zellen in 1: 200 Phalloidin für 30 min. Um den Kernen der Zellen zu beschriften, inkubieren Sie die Zellen mit 5 µg/mL DAPI für 10 min bei Raumtemperatur. Hinweis: Sicherstellen Sie, dass Phalloidin Farbstoff Konjugat Sekundärantikörpers konjugiert unterscheidet.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Generation der CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb) transgenen Mäusen und In Vivo Tests des DN-CBRb Ansatzes
<ol><li>Nach Bestätigung der wirksamen Dox-Regulierung des Transgens TetO-DN-CB-myc6-Rb1 reinigen das NotI-Fragment und microinject sie in Maus Zygoten, die später in Pseudo-trächtige Weibchen übertragen werden. Hinweis: Diese Verfahren wurden an der University of Nebraska Medical Center (UNMC) Maus Genom Engineering Core Facility durchgeführt.</li>
	<li>Nach der Geburt die Welpen mit einer Grundierung der CB-Rb1 Fusion Region bestimmten soll Genotyp: für CBRb F, verwenden Sie 3 von 5' CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG ' und für CBRB R, 3 ' 5 ' GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC. Hinweis: Die PCR-Produkt-Größe auf Agarosegel beobachtet ist 401 bp (60-bp CB Region + 341-bp Rb1 Region (Tabelle 1). Zehn unabhängige Gründer Linien wurden identifiziert, abhängig vom Vorhandensein des Transgens TetO-DN-CB-myc6-Rb1 . In fünf dieser Linien vererbt Nachkommen das Transgen, das die Keimbahn-Übertragung des Transgens bestätigt. Letztlich diente eines transgenen Linien schaffen und pflegen die Linie und Versuchstieren TetO-DN-CB-myc6-Rb1 für weitere Studien zu generieren.</li>
	<li>Züchten Sie Erwachsener TetO-DN-CB-myc6-Rb1 Mäuse auf die ROSA-CAG-RtTA Tetracyclin-Induktor Linie (Lager #006965) (Alternativ Zucht zu einer tTA Induktor Linie) um experimentelle DN-CBRb Mäuse zu erzeugen. Genotyp Nachkommen dieses Kreuz mit der folgenden Grundierung: verwenden Sie für RtTA-WT R, GGAGCGGGAGAAATGGATATG; Verwenden Sie für RtTA Mutant R GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC; und für gemeinsame RtTA, AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT. Die PCR-Produkt-Größen sind 340 bp (Mutanten), 340 bp und 650 bp (heterozygot) und 650 bp (Wildtyp).</li>
	<li>Erstellen einer Dosis-Wirkungs-Kurve des RB1 Proteins nach der Dox Behandlung zu bestimmen, die Zeit und Dauer der Dox Behandlung notwendig, einen Transgene Ausdruck zu entlocken. Hinweis: In diesem Experiment wurden western-Blot und qRT-PCR zur gewebespezifischen Transgene Aktivierung und RB1 Ausdruck zu bewerten.</li>
	<li>Führen Sie durch Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH), die genomische Einfügung des Transgens zu bestätigen. Hinweis: Dies wurde im Zentrum für angewandte Genomik des Spitals für kranke Kinder (Toronto, Kanada) durchgeführt. ELISA oder western Blot (mit Protein-spezifischen Antikörper) lässt sich die Transgen-Aktivierung, Gewebespezifität und Änderungen in den Ebenen des endogenen POI zu beurteilen. Für das DN-CB-myc6-Rb1 -Konstrukt haben wir einen Anti-RB1-Antikörper verwendet.</li>
</ol>

<ol><li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+MyoD+homodimer+formation+demonstrated+by+a+general+method+of+dominant+negative+mutation+employing+fusion+with+a+lysosomal+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease.</a> Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Um die Grenzen verbunden mit traditionellen transgene Strategien zu umgehen, haben wir versucht, ein Mausmodell zu generieren, in denen eine endogene POI bedingt inaktiviert durch ein DN mutierte Form des es in gewissem Sinne raumzeitlichen überexprimiert. Um die Funktion des endogenen POIs abschaffen zu können, wurden mehrere Optionen vorgeschlagenen15,16,17. Durch die Kombination der Dox-abhängige transkriptionellen Systems, e...

Die meisten Ansätze mit dem Ziel der Gene und Proteine Ablationen setzen auf permanente Prozesse, die in der Regel zur vollständigen Beseitigung oder Kürzung des Gens, RNA-Sequenzen oder Protein von Interesse (POI) führen. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist ein rekombinantes Protein zur Abschaffung der endogenen, Wildtyp Protein-Funktion zu konstruieren. Wir haben neu aufgelegt und überarbeitet eine alternative Strategie1,2, die für die temporäre Ablation eines POI durch DN Hemmung ermöglicht. Diese Methode funktioniert für Multimeric und Monomeren Peptide aber eignet sich am besten für Proteine, die in einer Assembly Multimeric funktionieren.
Die Methode besteht darin, der Verschmelzung der lysosomalen Protease CB an eine Untereinheit von einem Multimeric POI (CB Fusion Komplex). Die resultierende komplexe CB-Fusion kann interagieren mit und proteolytisch das körpereigene Protein zu verdauen oder umleiten den Gesamtkomplex der CB-POI zu den Lysosomen abgebaut3sein. Darüber hinaus ermöglicht eine Kombination aus der komplexen CB-Fusion mit der induzierbaren Natur des Systems der Tetracyclin-gesteuerte transkriptionelle Aktivierung (TetO) einen induzierbaren und kontrollierte Expression des Transgens in einem reversiblen Mode2. Obwohl in vielen Fällen nützlich, führt die vollständige Löschung von Genen oder Proteinen in-vivo Letalität4,5,6. Ebenso gewebespezifischen, bedingte Löschung einiger Gene oder Proteine mit dem Cre/Lox-System einfach, möglicherweise nicht da es letztlich zu den dauerhaften Verlust von kritischen genomische Elemente7führt. Daher, je nach gen oder POI, keiner dieser Ansätze werden wirksam bei der Bereitstellung eines nützlichen Modells für nachfolgende Studien, besonders Gene oder Proteine funktionellen Studien in den späten postnatale und Erwachsenen Mäusen.
Zur Umgehung der Probleme im Zusammenhang mit solchen Ansätzen und Proof of Principle über die Wirksamkeit des vorgeschlagenen Verfahrens, möchten wir hier durch die Erzeugung einer bedingten DN-Version des Proteins Retinoblastom 1 (RB1) vorgestellte Methode zu testen. Mehrere Möglichkeiten wurden vorgeschlagenen8,9,10 , die Funktion des endogenen RB1 abzuschaffen; jedoch alle den gleichen Einschränkungen oben diskutierten konfrontiert: permanente Keimbahn Löschung von RB1 ist Hochkultur tödlich, und mit seinen Tumorsuppressor Rolle, permanente RB1 bedingte Löschung führt zu einer Vielzahl von Tumoren11. Obwohl eine DN-Version von RB1 nicht natürlich vorkommen scheint, sollte eine bessere Alternative zu den derzeit verfügbaren Strategien erlauben eine zeitlich gesteuerte Inaktivierung von endogenen RB1 und bieten einen alternativen Mechanismus schließlich wiederherstellen ihrer Funktion. Die Grundlage für ein solches Konstrukt wurde vor über zwei Jahrzehnten beschrieben1. Allerdings fehlte es aufgrund von technischen Einschränkungen, einen Mechanismus zur Kontrolle Transgen Aktivierung, Reaktion und Gewebespezifität. Diese Studie ist die erste verbinden die Eleganz der Doxycyclin (Dox)-abhängige transkriptionelle System mit ein veränderter transgenen Konstrukt der lysosomalen Protease CB und Rb1 Proteine. Die daraus resultierende CBRb-Maus-Modell ermöglicht eine vorübergehend geregelten Dox-vermittelten RB1 Verordnung2. Der Vorteil der Verwendung eines Proteom-basierten Ansatzes Genfunktion zu studieren ist, dass es für jedes Gen von Interesse, mit minimalen Informationen über seine Tätigkeit angenommen werden kann.
Die vorgeschlagene DN-Transgen-Strategie bietet viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Ansätzen. Erstens führt DN Protein Hemmung zu nur ein teilweiser Ablation Proteinaktivität, um ein passives endogenen Ausdruck. Ein solches Ergebnis ist höchst wünschenswert, in Situationen, wo eine vollständige Beseitigung der Proteinaktivität zu embryonalen Tödlichkeit führt, stark begrenzen jeder Untersuchung um Genfunktion in einer live Maus zu untersuchen. Zweitens ermöglicht die Präsenz des Systems der TetO Transgen Aktivierung nur in Anwesenheit eines Antibiotikums, die für eine effiziente und reversible Kontrolle der Transgen-Aktivität ermöglicht. So durch Beendigung der Antibiotika-Administration, die transgenen System kann deaktiviert werden, und ein normaler RB1 Ausdruck ist wieder an Ihrem Platz. Drittens kann der Veranstalter der Wahl die Spezifität des Transgens Ausdrucks abhängig. Während wir die allgegenwärtigen ROSA-CAG-Promoter für Proof of Principle gewählt haben, dürfte Platzierung des Transgens unter gewebespezifischen Promoter, Studien über die therapeutische Anwendung von diesem Transgen zu unerwünschten Transgene Ausdruck zu beschränken Methodik.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modifizierter Eagle's Medium, DMEM</td><td>GIBCO-BRL</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle, MEME&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M8042</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>F2442&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin&nbsp;</td><td>DharmaFECT</td><td>T-2010-03</td><td></td></tr><tr><td>Sal I</td><td>Roche</td><td>11745622</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>Roche</td><td>13090730</td><td></td></tr><tr><td>CaspaTag&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>APT523</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>CyQuant NF Zellproliferationskit&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C35007</td><td></td></tr><tr><td>Retinoblastoma 1 Antikörper</td><td>Abcam</td><td>Ab6075</td><td></td></tr><tr><td>c-Myc Antikörper</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M5546</td><td></td></tr><tr><td>b-Aktin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A5316</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67&nbsp;</td><td>Thermofisher scientific</td><td>MA5-14520</td><td></td></tr><tr><td>Phallodin</td><td>Thermofisher scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader</td><td>FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epifluoreszenzmikroskop&nbsp;</td><td>NikonEclipse80i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Die TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) Mauslinie ist im Jackson Laboratory als JAX#032011 erhältlich.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

induzierbaren und reversible dominant-negative (dn) protein hemmung

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

Dominant-Negative (DN) Protein Hemmung ist eine leistungsfähige Methode, Proteinfunktion zu manipulieren und bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Genom-basierte Ansätze. Zum Beispiel obwohl Chimären und Cre-LoxP gezielte Strategien sind am meisten benutzt, die immanente Grenzen dieser Strategien (z. B. undichte Promotoraktivität, Mosaik Cre Ausdruck usw.) erheblich eingeschränkt haben ihre Anwendung. Darüber hinaus ist eine vollständige Löschung von vielen endogenen Genen Hochkultur tödlich, macht es unmöglich, die Genfunktion in postnatale Leben zu studieren. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir erhebliche Änderungen an einem frühen Gentechnik-Protokoll und kombiniert eine Kurzversion (transgene) das Rb1-gen mit einer lysosomalen Protease procathepsin B (CB), einem DN-Maus-Modell von Rb1 generieren (CBRb). Aufgrund des Vorhandenseins von lysosomalen Protease werden die gesamten CB-RB1-Fusionsprotein und seinen interagierenden Komplex für Proteasom-vermittelten Abbau weitergeleitet. Darüber hinaus ermöglicht das Vorhandensein von ein Tetracyclin-Induktor (RtTA) Element in der transgenen Konstrukt eine induzierbare und reversibel Regelung des das RB1-Protein. Das Vorhandensein eines allgegenwärtigen ROSA-CAG-Promotors im Mausmodell CBRb macht es ein nützliches Werkzeug, um vorübergehende und reversible Rb1-gen-Ablation durchführen und liefern Forscher eine Ressource für das Verständnis ihrer Tätigkeit in nahezu jedem Zelltyp wo RB1 zum Ausdruck.

Entwerfen einer DN Mutation erfordert in der Regel, eine beträchtliche Menge von Informationen über die Struktur und Funktion des POI. Im Gegensatz dazu ist die DN-Strategie hier vorgestellten besonders nützlich, wenn die strukturelle und funktionelle Informationen für die POI begrenzt ist. Wenn der POI ein Multimeric Protein ist, eine Verschmelzung von einer Untereinheit zu einer lysosomalen Protease kann dominant hemmen die montierten Multimer und unter Umständen andere Liganden durch e...

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine Dominant-negativen induzierbaren System zu entwickeln, in der kein Protein bedingt inaktiviert durch reversibel überexprimiert eine Dominant-negativen mutierte Version davon.

Induzierbaren und Reversible Dominant-Negative (DN) Protein Hemmung

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in einer Vielzahl von Bereichen zu beantworten, die eine bedingte und vorübergehende Inaktivierung eines Gens von Interesse erfordern, indem eine dominante negative Version umgekehrt über-ausdruckend ist. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie nur eine partielle Ablation in der Proteinaktivität zulässt, wodurch eine restliche endogene Expression erhalten bleibt. Obwohl wir hier die Zustandsinaktivierung von RB-Protein beschreiben, das in einer multimerischen Baugruppe funktioniert, kann diese Methode auch auf monomere Proteine angewendet werden.Umesh Pyakurel, unser Labortechniker und Co-Autor im Manuskript, wird die Verfahren demonstrieren. Zunächst können Sie NIH3T3-Zellen nach den Vorgaben des Herstellers bei 37 Grad Celsius mit 5% CO2 anbauen und dabei das empfohlene Zellkulturmedium verwenden, das 10% fetales Rinderserum enthält. Um die Zellen mit pTet-Splice- und pCMV-Tet3G-Vektoren zu kotranstranstranssektieren, mischen Sie zunächst zwei bis vier Mikroliter des lipidbasierten Transfektionsreageims pro Brunnen und einen Milliliter unvollständigen DMEM pro Brunnen in einer 15-Milliliter-Röhre und brüten fünf Minuten bei Raumtemperatur.Fügen Sie dem DMEM-Mix dieses Transfektionsreagenzs zwei bis drei Mikrogramm Plasma-DNA pro Brunnen hinzu. Mischen und inkubieren für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie einen Milliliter der Mischung, die DNA und das Transfektionsreagenz in DMEM enthält, zu jedem Brunnen der Sechs-Well-Platte mit NIH3T3-Zellen hinzu.Nach drei bis vier Stunden Inkubation bei 37 Grad Celsius bei 5% CO2, fügen Sie einen Milliliter komplettes Medium hinzu. Dann fügen Sie 2 Mikroliter Doxycyclin-Lager zu jedem Brunnen und markieren Sie die Platte als Plus-Doxycyclin. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5%CO2.Um die Funktionalität des TetO-DN-CB-myc6-Rb1-Konstrukts bei der Förderung der ungeplanten Zellproliferation zu bewerten, kulturen HEI-OC1-Zellen in DMEM, die 10%FBS enthalten, unter freizügigen Bedingungen. Für Zellproliferationsstudien zählen Sie die HEI-OC1-Zellen mit einem Zellzähler. Platte 10 000 HEI-OC1-Zellen pro Brunnen auf einer 96-Well-Platte in jeweils 200 Mikroliter Volumen.Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 33 Grad Celsius mit 5%CO2. Um die transgene Expression zu induzieren, fügen Sie einer Teilmenge der transfizierten HEI-OC1-Zellen ein Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin hinzu. Verwenden Sie die andere Teilmenge, die als Minusdoxycyclin gekennzeichnet ist, und die nicht transfizierten HEI-OC1-Zellen als Steuerelemente, und inkubieren Sie die Zellen als 33 Grad Celsius mit 10 % CO2.Um die Zellproliferation zu bewerten, 48 Stunden nach der Transfektion, entfernen Sie das Zellkulturmedium und fügen Sie 100 Mikroliter 1x 1x Farbstoffbindungslösung aus einem Zellproliferationskit zu jedem Brunnen der Mikroplatte hinzu. Folgen Sie dem Herstellerprotokoll und brüten Sie eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie einen Fluoreszenz-Mikroplattenleser, um die Fluoreszenzintensität jeder Probe zu messen.Um die Zellproliferation mittels Immunzytochemie weiter zu bewerten, verankern Sie die HEI-OC1-Zellen auf einem Deckglas, das in jedem Brunnen einer 12-Well-Platte in DMEM platziert ist. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 33 Grad Celsius. Am folgenden Tag kotransfieren Sie die Zellen in zwei Brunnen mit den pTet-Splice- und pCMV-Tet3G-Vektoren und führen Sie dann die Doxycyclin-Behandlung an einer gut wie mit den NIH3T3-Zellen durchgeführt.Verwenden Sie eine untransfizierte gut als Steuerung. Um die Zellen für die Ki-67-Etikettierung zu verarbeiten, fixieren Sie sie mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Danach dreimal mit eiskaltem PBS für jeweils fünf Minuten waschen.0,25% nichtionisches Reinigungsmittel in PBS hinzufügen und 10 Minuten brüten. Wiederholen Sie die Wäsche dreimal in PBS für jeweils fünf Minuten. Verwenden Sie 10%serum, um die Zellen zu blockieren.In einer befeuchteten Kammer für eine Stunde bei Raumtemperatur. Fügen Sie 500 Mikroliter Ki-67 Primärantikörper hinzu und brüten über Nacht bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen dreimal in PBS für jeweils fünf Minuten.Fügen Sie einen Milliliter des sekundären Antikörpers hinzu und inkubieren Sie die Zellen für eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach dem Entfernen der sekundären Antikörperlösung die Zellen im Dunkeln dreimal für fünf Minuten in PBS waschen. Um die HEI-OC1-Zellen mit Phalloidin zu kennzeichnen, inkubieren Sie sie in 1:200 Phalloidin für 30 Minuten bei Raumtemperatur.Um die Zellkerne zu beschriften, inkubieren Sie die Zellen mit fünf Mikrogramm pro Milliliter DAPI für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Lieferung der transgenen Mäuse, Genotyp die Welpen mit einem Primer-Set spezifisch für die CBRb1-Fusionsregion, wie in der Handschrift beschrieben. Züchten Sie erwachsene TetO-DN-CB-myc6-Rb1-Mäuse an die ROSA-CAG-rtTA und Tetrecyclin-Induktorlinie, um experimentelle DN-CBRb-Mäuse zu erzeugen, und genotypieren Sie ihre Nachkommen, wie im Manuskript beschrieben.NIH3T3 exprimiert kein endogenes RB1-Protein, daher ist die robuste RB1-Expression, die hier zu sehen ist, auf die Transgeninduktion in Gegenwart von Dox zurückzuführen, jedoch nicht in seiner Abwesenheit, was die effiziente Aktivierung des TetO-DN-CB-myc6-Rb1-Mix-RB1-Konstrukts bestätigt. Im Gegensatz dazu haben HEK293-Zellen eine endogene RB1-Expression. Die Zugabe von Doxycyclin führte zur TetO-DN-CB-myc6-Rb1-Aktivierung und RB1-Down-Regulierung.Der RB1-Ausdruck wurde 21 Stunden nach der Entfernung von Doxycyclin aus den Medien wieder aufgenommen. HEI-OC1-Zellen, die mit den gleichen Vektoren kotransfiziert wurden, zeigten eine bescheidene, aber signifikante Zunahme der Zellzahl nach der Doxycyclin-Behandlung im Vergleich zu transfizierten Zellen, die nicht mit Doxycyclin behandelt wurden, und den untransfizierten Zellen. Fluoreszierende In-situ-Hybridisierung bestätigte die genomische Insertion von TetO-DN-CB-myc6-RB1-Transgen bei Mäusen.Es gab einen anfänglichen Anstieg der gesamten RB1-Proteinexpression in Cochlea der transgenen Mäuse, die drei Tage lang mit Doxycyclin behandelt wurden, im Vergleich zur Kontrollgruppe. In Gruppen, die sieben und zehn Tage lang mit Doxocyclin behandelt wurden, wurde jedoch eine signifikante Verringerung der RB1-Expression beobachtet. Unabhängig vom analysierten Gewebe wurde eine signifikante Reduktion des RB1-Proteins bei transgenen Mäusen beobachtet, die mit Doxocyclin behandelt wurden, jedoch nicht in der Kontrollgruppe, was die Effizienz des TetO-DN-CB-myc6-RB1-Konstrukts bestätigte.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, zu überprüfen, ob jedes der Kodierungselemente des Transgens im Rahmen miteinander ist. Wenn die in diesem Bericht beschriebenen Kodierungsregionen Kathepsin B und Retinoblastom zufällig ablätsgemäß miteinander verbunden wären, würde dies nicht das beabsichtigte Fusionsprotein ergeben. Daher muss die DNA-Sequenzverifizierung durchgeführt werden, bevor das Transgen in einzellige Mausembryonen injiziert wird.Nach diesem Verfahren kann der allgegenwärtige CAG-Promotor durch spezifische Promotoren ersetzt werden, um die Genfunktion auf spezifische Weise zu untersuchen.

inducible-and-reversible-dominant-negative-dn-protein-inhibition

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Eine schnelle und einfache Art und Weise die menschliche Zelllinien mit induzierbarer und reversible cDNA Überexpression oder shRNA-vermittelte Knock-down des Gens von Interesse zu erzeugen. Diese Methode ermöglicht es Forschern, zuverlässig und hoch reproduzierbar zu manipulieren Zelllinien, die nur schwer durch transiente Transfektion Methoden oder konventionellen knockdown / Knockout-Strategien zu verändern sind.

Generierung von stabilen menschlichen Zelllinien mit Tetracyclin-induzierbarer (Tet-on) shRNA oder cDNA Expression

Die hier beschriebene Methode wird verwendet, um die apoptotische Signalkaskade in definierten Schritten zu induzieren, um die Aktivität eines anti-apoptotischen bakteriellen Effektorproteins zu entschlüsseln. Diese Methode kann auch zur induzierbaren Expression von pro-apoptotischen oder toxischen Proteinen oder zur Störung von Interferenzen mit anderen Signalwegen verwendet werden.

Anlegen eines induzierbaren Expression System zu Störungen der bakteriellen Virulenzfaktoren mit Intrazelluläre Signal Studieren

Wir beschreiben hier ein System, das einen ortsspezifischen, reversiblen in vivo Proteinblock verwendet, um Replikationsgabeln in Escherichia coli zu blockieren und zu kollabieren. Die Etablierung des Replikationsblocks wird durch Fluoreszenzmikroskopie evaluiert und die neutral-neutrale 2-dimensionale Agarose-Gelelektrophorese wird zur Visualisierung von Replikationszwischenprodukten verwendet.

Induzierung einer Site Specific Replikation Verstopfungen in<i&gt; E. coli</i&gt; Ein fluoreszierendes Repressor Operator System verwenden

Dieses Protokoll dient eine Regelung für die Einrichtung eines funktionalen Tet-ON Systems in Krebszelllinien und seine spätere Verwendung, insbesondere für die Untersuchung der Rolle der Tumor Zelle abgeleitet Proteine bei der Rekrutierung von Monozyten/Makrophagen, den Tumor Mikroumgebung.

Bedingte Knockdown von Genexpression in Krebs-Zell-Linien, die Rekrutierung von Monozyten/Makrophagen, den Tumor Mikroumgebung zu studieren

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte erforderlich, um ein Modellsystem, in dem die Transkription des endogenen Gens von Interesse bedingt gesteuert werden kann, in lebenden Tieren oder Zellen mit verstärkten Lac Repressor und/oder Tet Aktivator Systeme generieren.

In-vivo Anwendung der REMOTE-Steuerung für die Manipulation von endogenen Genexpression

Gezielte DNA Epigenom Bearbeitung stellt eine leistungsstarke Therapieansatz. Dieses Protokoll beschreibt die Produktion, Reinigung und Konzentration der all-in-One Lentivirale Vektoren beherbergen das CRISPR-dCas9-DNMT3A Transgen für Epigenom-editing-Anwendungen in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSC)-Neuronen abgeleitet.

Lentivirale Vektor-Plattform für die effiziente Bereitstellung von Epigenom-editing-Tools in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Krankheitsmodelle

Hier beschreiben wir ein Genom-Editing-Tool, das auf der zeitlichen und bedingten Stabilisierung des geclusterten, regelmäßig interspaced short palindromic repeat- (CRISPR-) assoziierten Proteins 9 (Cas9) unter dem kleinen Molekül Shield-1 basiert. Die Methode kann für kultivierte Zellen und Tiermodelle verwendet werden.

Ein neues Toolkit zur Bewertung von Genfunktionen mit bedingter Cas9-Stabilisierung

Die Wechselwirkung eines ATP-abhängigen Chromatin-Remodelers mit einem DNA-Liganden wird mittels CD-Spektroskopie beschrieben. Die induzierten Konformationsänderungen an einem Genpromotor, die durch die erzeugten Peaks analysiert werden, können verwendet werden, um den Mechanismus der transkriptionellen Regulation zu verstehen.

CD-Spektroskopie zur Untersuchung von DNA-Protein-Wechselwirkungen

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die in vitro Selektion von technisch hergestellten Transkriptionsrepressoren (ETRs) mit hoher, langfristiger, stabiler On-Target-Silencing-Effizienz und geringer genomweiter Off-Target-Aktivität vor. Dieser Arbeitsablauf ermöglicht es, ein anfängliches, komplexes Repertoire von ETR-Kandidaten auf eine kurze Liste zu reduzieren, die für die weitere Evaluierung in therapeutisch relevanten Umgebungen geeignet ist.

In vitro Auswahl von modifizierten Transkriptionsrepressoren für gezieltes epigenetisches Silencing

Diese Studie beschreibt Methoden für die T7-vermittelte Co-Expression von mehreren Genen aus einem einzigen Plasmid in Escherichia coli unter Verwendung des pMGX-Plasmidsystems.

Induzierbares T7-RNA-Polymerase-vermitteltes Multigen-Expressionssystem, pMGX

Lernen Sie die induzierbare und reversible Dominant-Negative-Proteinhemmung zur bedingten Inaktivierung von Proteinen in Zellkultur und Mausmodellen. Diese Methode ermöglicht die partielle Abschaltung mit erhaltener endogener Aktivität.

Induzierbaren und Reversible Dominant-Negative (DN) Protein Hemmung

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