Name: Genetischen und chemischen Kapsid Modifikationen der Gentransfer Adenovirus-basierte Vektoren kombiniert für Abschirmung und Targeting (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Erfahren Sie die chemische Modifikation von Adenovirus-Kapsiden für Gentherapie und onkolytische Anwendungen. Diese Methode ermöglicht präzise Veränderungen über 90 % der Kapsid-Monomere für therapeutische Vektoren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Hinweis: im folgenden wird ein Protokoll für Geneti-chemische Pegylierung einer Werbeanzeige Vektor zum Detail beschrieben wird. Um bestimmte Kopplung von PEG glyko-zu ermöglichen, wurde ein Ad5-Vektor vorher genetisch modifiziert durch die Einführung eines Cystein-Rückstands in der Hexon-Protein bei der hypervariablen Loop 5, wie in einer früheren Publikation36und eine Maleimide-aktivierte PEG beschrieben Verbindung wird als zusammengesetzte Kupplung verwendet.
1. Vorbereitung der Puffer für Vektor-Reinigung durch Schritt CsCL-Gradienten
<ol><li>Bereiten Sie 400 mL Adenovirus Puffer (Ad-Puffer) durch Zugabe von 50 mM HEPES (4,76 g/400 mL) und 150 mM NaCl (3,504 g/400 mL) mit bidestilliertem Wasser (DdH2O). 350 mL dieses Puffers ist erforderlich, um die folgenden drei Ad-Puffer Varianten vorzubereiten.<ol>
<li>Variante A: Stellen Sie 150 mL Ad-Puffer pH 7.6 mit NaOH.</li>
		<li>Variante B: 50 mL eine Endkonzentration von 10 mM DÄMMUND [tris(2-carboxyethyl)phosphine), 0,143 g] hinzu und passen Sie es auf pH 7,2 mit HCl.</li>
		<li>Variante C: 150 mL eine Endkonzentration von 0,5 mM DÄMMUND (0,022 g) hinzu und passen Sie es auf pH 7,2 mit HCl.</li>
		<li>Bereiten Sie die Puffer in DdH2O und analysenrein Chemikalien. 100 mL Variante A und Variante C verwenden, um die CsCl-Puffer vorzubereiten (siehe Schritte jeweils 1,2 und 1,3; 50 mL) für die CsCl-Gradienten Schritt notwendig (siehe Schritte 3.2.6. und 3.2.18).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung des CsCl Schritt Gradienten Puffers (ρCsCl = 1,41 g/cm3) Ad-Puffer Hinweis: Dieser Puffer wird in zwei verschiedenen Varianten erforderlich sein:<ol>
<li>Wiegen Sie zwei Aliquote genau 27,42 g CsCl in 50 mL Röhrchen.</li>
		<li>ΡCsCl = 1,41/DÄMMUND Puffer: CsCl in 40 mL Variante C des Ad-Puffer zu lösen.</li>
		<li>ΡCsCl = 1,41 Puffer: CsCl in 40 mL Variante A Ad-Puffers zu lösen.</li>
		<li>Überprüfen Sie, und passen Sie ggf. den pH-Wert mit HCl. Füllung bis zu genau 50 mL mit der entsprechenden Ad-Puffer-Variante. Um die besten Ergebnisse der Trennung zu erreichen, sind die genaue CsCl-Konzentration und pH-Wert entscheidend.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Dichte (CsCl Inhalt) durch Wägung jeder Farbverlauf Puffer 1 mL (1,41 g).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung des CsCl Schritt Gradienten Puffers (ρCsCl = 1,27 g/cm3) Ad-Puffer Hinweis: Dieser Puffer wird in zwei verschiedenen Varianten benötigt:<ol>
<li>Wiegen Sie zwei Aliquote genau 18,46 g CsCl in 50 mL-Tuben.</li>
		<li>ΡCsCl = 1,27/DÄMMUND Puffer: CsCl in 40 mL Variante C des Ad-Puffer zu lösen.</li>
		<li>ΡCsCl = 1,27 Puffer: CsCl in 40 mL Variante A Ad-Puffers zu lösen.</li>
		<li>Überprüfen Sie, und passen Sie ggf. den pH-Wert mit HCl. Zu guter Letzt füllen Sie bis genau 50 mL mit der entsprechenden Ad-Puffer-Variante. Um die besten Ergebnisse der Trennung zu erreichen, sind die genaue CsCl-Konzentration und pH-Wert entscheidend.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Dichte (CsCl Inhalt) durch Wägung jeder Farbverlauf Puffer 1 mL (1,27 g).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sterilisieren Sie alle Puffer (Ad-Puffer und CsCl Schritt gradient Puffer) durch Filtration (mit 0,45 µm Maschenweite Pore) in sterile Flaschen.</li>
	<li>Nach der Sterilisation, zur Vermeidung von Oxidation von DÄMMUND sättigen und überlagern die Puffer mit DÄMMUND mit Argon durch sparging die Puffer mit Argon-Gas für ca. 30 s. Achten Sie darauf, nur sterile Geräte verwenden (zB., sterilen pipette Tipps) bei der Anwendung der Argon-Gas und Nutzung Flaschen groß genug, um Argon Tran zu ermöglichen. Hinweis: Alle Puffer sollten bereit sein, frisch und vor Licht geschützt und können für mehrere Tage bei 4 ° C gelagert werden (vor allem die CsCl Schritt gradient Puffer, die nur für ein paar Tage aufbewahrt werden sollte).</li>
</ol>(2) Kupplung Moieties: Lagerung und Zubereitung
Hinweis: Moeities zur Ankopplung an Cysteine Thiol-reaktiven Gruppen tragen müssen. Maleimide-aktiviert Verbindungen bilden stabile Thioether Anleihen mit gentechnisch eingeführte Cysteine. Alternativ, ortho-Pyridyldisulfide (OPSS)-aktivierte Verbindungen eingesetzt werden, bilden Bioresponsive Disulfidbrücken zwischen dem Vektor Partikel und Kupplung glyko-. Lyophilisierten MalPEG-750 sowie die meisten anderen Kupplung Reagenzien sind empfindlich gegen Hydrolyse und sollte in Form von gefriergetrockneten Pulvern bei-80 ° c trocken gelagert werden
<ol><li>Um den Aufbau von kondensiert Wasser auf Ampullen Auftauen zu verhindern, speichern Sie die Fläschchen in größeren Rohren (zB., 50 mL Tuben) mit einem Kissen von Kieselgel Perlen gefüllt. Speichern Sie diese Rohre in einem angemessenen größere Behälter auch mit einem Kieselgel Perlen Kissen gefüllt.</li>
	<li>Bevor Sie dicht schließen jedes Rohr und Container, Austausch von Luft mit Argon-Gas. Dies kann erreicht werden, indem man die offenen Rohre und Behälter in den Exsikkator gestellt, gefolgt von entfernen und ersetzen die Luft mit Argon-Gas. Da Argon-Gas schwerer als Luft ist, Rohre und Behälter sind mit Argon-Gas gefüllt und können jetzt ineinander gelegt werden, mit jeder Deckel fest verschlossen.</li>
	<li>Shop-Container bei-80 ° C.</li>
	<li>Beim Auftauen, legen Sie die Container auf Kieselsäure Perlen in den Exsikkator gestellt und langsam bis Raumtemperatur zu wärmen Sie, dann öffnen Sie den Container.</li>
	<li>Wenn Sie eine Kupplung Reaktion durchführen, frisch lösen Sie die Höhe der Kupplung Substrat in der geeigneten Lösungsmittel benötigt. Achten Sie darauf, nicht mehr als 10 % der Kupplung Lösung der letzten Kupplung Reaktion hinzufügen, vor allem wenn DMF oder DMSO als Lösungsmittel für die Kupplung Substrat verwendet wird.</li>
</ol>3. Verstärkung, Reinigung und chemische Modifikation von Ad Vektoren:
<ol><li>Verstärkung des Ad-Vektoren Hinweis: Die folgenden Schritte müssen mit einem Sicherheitsschrank nach lokalen biologische Sicherheitsregeln durchgeführt werden.<ol>
<li>Transfizieren Sie Replikation mangelhaft ∆E1 Ad Vektor mit einem (oder mehreren) genetisch eingeführten Cystein Residue(s) in HEK 293 Zellen wie Kratzer und Kreppel38beschrieben.</li>
		<li>Verstärken Sie nach dem Protokoll38den Vektor durch sequentielle Reinfektionen bis zu einer endgültigen präparative Infektion von 15-20 (15 cm) große Kultur Zellplatten (ca. 1-2 x 107 Zellen/Platte). Hinweis: Optimal, die letzten Reinfektion sollte zeitgesteuert werden damit Zellen voll zytopathischer Effekt (CPE) am Morgen des Reinigung und Änderung Leistung zeigen (siehe Abbildung 2).</li>
		<li>Nach dem letzten Verstärkung Schritt können Zellen in Ad Puffer + 10 mM DÄMMUND (Variante B) Nukleinsäuretablette bei-80 ° C eingefroren werden; jedoch empfiehlt sich für optimale Ausbeute an Vektor Teilchen, ein erster Schritt der Zelle Lysis und Vektor Reinigung und Änderung.</li>
	</ol></li>
	<li>Reinigung und chemische Modifikation von Ad Vektoren Hinweis: Reinigung von Vektoren wird nach dem Adenovirus-Reinigung-Protokoll beschrieben durchgeführt.38aber nicht oxidierenden Bedingungen. Handy-Ernte und Lyse sowie Reinigung und chemische Modifikation Vektor kann innerhalb eines Tages durchgeführt werden. Ernte und lösen Sie die infizierten Zellen nach dem zuvor beschriebenen Protokoll38.<ol><li>Sammeln Sie Zellen Schaben der Platten und des Überstands in 200-500 mL Zentrifugation Röhren.</li>
		<li>Drehen Sie die Zelle Lösung für 10 min bei 400 X g.</li>
		<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 4 mL Ad-Puffer + 10 mM DÄMMUND (pH 7,2) (Variante B) und Transfer zu einem sterilen 50 mL-Tube. Wenn Zellausbeute niedrig ist oder nur eine schwache CPE induziert wurde, in 2 mL aufzuwirbeln.</li>
		<li>Den Vektor von 3 Zyklen (in flüssigem Stickstoff) Einfrieren und Auftauen (im Wasserbad 37 ° C) zu retten.</li>
		<li>Spinnen Sie für 10 min bei 5.000 x g bei 4 ° C.</li>
		<li>Bereiten Sie beim Zentrifugieren zwei gleiche CsCl Schritt Gradienten:<ol>
<li>Fügen Sie zunächst als die untere Phase 3 mL 1,41 g/cm3 ρCsCl in Ad-Puffer + 0,5 mM DÄMMUND (pH 7,2, Variante C) in der Ultrazentrifuge Röhren. Markieren Sie die Ebene die untere Phase auf das Rohr vor dem Laden der oberen Phase.</li>
			<li>Stapeln Sie sorgfältig die obere Phase von 5 mL 1,27 g/cm3 ρCsCl in Ad-Puffer + 0,5 mM DÄMMUND (pH 7,2, Variante C) von 5 mL Volumen entlang der Wände des Rohres auf die untere Phase sehr langsam pipettieren. Hinweis: Seit während Kupplung eine hohe Konzentration von DÄMMUND könnte reagieren die Maleimide Rückstände des MalPEG-750 und führen zu reduzierten Kupplung Effizienz, Reinigung von CsCl Schritt Steigung bereits unter einer reduzierten DÄMMUND Konzentration durchgeführt werden muss.</li>
		</ol></li>
		<li>Laden den Überstand auf die CsCl-Gradienten [entweder gleichmäßig teilen den Überstand auf beiden Steigungen oder im Falle einer niedrigen Vektor-Ausbeute (siehe oben), laden den Überstand auf nur eine Spalte], und füllen Sie beide Gradienten gleich an die Spitze mit Ad Puffer + 10 mM DÄMMUND (pH 7 .2, Variante B).</li>
		<li>Stellen Sie das Gewicht der gegenüberliegenden Rohre zu einem 0,0 g Gewichtsunterschied.</li>
		<li>Ultrazentrifugen für 2 h bei 176.000 x g bei 4 ° C.</li>
		<li>Fixieren Sie mit einer Klammer Ultrazentrifugation Rohr zu einem Standplatz, verlassen das Gebiet um die untere Phase Markierung zugänglich. Legen Sie die Schwanenhals-Lampe über das Rohr. Rund um die Marke, an der Grenze zwischen den unteren und oberen Phasen sollte eine ausgeprägte Band (Vektor-Virionen) sichtbar (Abb. 3A-3 C).</li>
		<li>Sammeln Sie die Vektoren durch das Rohr mit einer Nadel punktieren und aufstrebende Vektor-Band in eine Spritze. Übertragen Sie gesammelten Vektor Virionen auf eine 15 mL-Tube. Hinweis: Schwächere Bands über die Ad-Vektor-Band unvollständig Vektor Partikel enthalten und für die Aspiration vermieden werden. Die Zellenrückstand und grün fluoreszierendes Protein (EGFP) EGFP exprimierenden Ad-Vektoren im oberen Teil der Ultrazentrifuge sammeln Rohr (siehe Abbildung 3A und 3 b). Dies und die folgenden Schritte bis zur Kupplung (Schritt 3.2.16.) sollte rasch durchgeführt werden, wie die Vektoren sind jetzt vernünftig zu Disulfid Bindung aufgrund der geringen Konzentration DÄMMUND.</li>
		<li>Zur Berechnung der Höhe der Kupplung Substrat benötigt für effiziente vollständige Bindung des Substrats an alle Cystein-Reste in der Vektor-Vorbereitung messen Sie OD260:<ol>
<li>Nach dem Protokoll von Kratzer und Kreppel38, Wirbel eine Mischung aus 10 µL der gesammelten Vektor Virionen und 89 µL Puffer Ad 1 µL 10 % SDS beschrieben. Als leere Sonde, Wirbel 99 µL Ad-Puffer und 1 µL 10 % SDS.</li>
			<li>Um die Virionen zu denaturieren, inkubieren Sie sowohl bei 56 ° C für 10 min.</li>
			<li>OD260zu bestimmen.</li>
			<li>Die physische Vektor-Titer pro Mikroliter unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnen: OD260 x Faktor der Verdünnung x empirisch ermittelten Aussterben Koeffizient von Ad (1.1 x 109 Vektor Partikel = 1 OD260 Einheit/µL). Daher einen gemessenen OD260 von 1,36 eines Vektors 01:10 verdünnt, würde zu berechnen: 1,36 x 10 x 1,1 x 109 = ca. 1,5 x 1010 Vektor Partikel/µL. Hinweis: Dieser Titer ist nur eine grobe Schätzung; Es ist jedoch genau genug für die stöchiometrischen Berechnungen, die im folgenden beschrieben.</li>
		</ol></li>
		<li>Je nach das Protein verändert durch Einführung einer Cystein, bestimmen die Menge der Kupplung Substrat (in Gramm) für eine effiziente Kopplung Reaktion nach der folgenden allgemeinen Gleichung: Virustiter x Volumen x Anzahl der Cysteine x Überschreitung der Abstimmungsunterlagen X Molekularen Gewicht von glyko- / 6.022 x 1023 = Gramm Kupplung Substrat. Hinweis: In dieser Gleichung: (1) Virustiter ist der Titer/µL, durch OD260 bestimmt, wie beschrieben, 2) Volumen-Accounts für das Volume in µL des angestrebten Vektor in die Kupplung Reaktion verwendet, (3) die Anzahl der Cysteine ist die Zahl der Proteine in die die Cystein Rückstand wurde eingeführt, pro Vektor Partikel, 4) Überschreitung der Verbindungsgruppe ist der Faktor des Glyko-überschüssige notwendig für eine effiziente Kopplung Reaktion (50 X) und 5) das Molekulargewicht der Abstimmungsunterlagen muss Da (nicht kDa) eingeführt werden.</li>
		<li>Frisch lösen die Menge der Verbindung (oder möglich) in den geeigneten Lösungsmittel benötigt. Hinweis: Da die Höhe der Kupplung Substrat benötigt gering und schwer zu wiegen, aber teuer ist, wiegen Sie die minimale Menge an zusammengesetzten möglich und in einer entsprechenden Konzentration für die Anwendung auf die Kupplung Reaktion auflösen.</li>
		<li>Übertragen Sie die Vektor-Lösung auf eine geeignete Größe Rohr (z. B. 2 mL-Tube) und fügen Sie den berechneten Betrag der Kupplung zusammengesetzte Stammlösung auf den Vektor.</li>
		<li>Vorsichtig mischen der Lösung durch obenliegende Rotation für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Füllen Sie die Vektor-Lösung für 6 mL Gesamtvolumen mit Ad-Puffer (pH 7.6, Variante A). Hinweis: Dieser Schritt muss ausgeführt werden, bevor die Lösung, um den Farbverlauf Schritt angewendet wird um sicherzustellen, dass die Vektor-Lösung, die immer noch CsCl aus den ersten Schritt Farbverlauf enthält, eine Dichte unter 1,27 g/mL hat.</li>
		<li>In einem zweiten Schritt CsCl Streifenbildung Reinigen des Vektors aus der glyko-nicht umgesetztes Kupplung:<ol>
<li>Bereiten Sie zwei gleiche CsCl Schritt Gradienten durch Ausführen der folgenden Schritte für jede: (1) untere Phase: der untere Phase auf das Rohr vor dem Laden obere Phase, und (3) obere Ebene 3 mL 1,41 g/cm3 ρCsCl in Ad-Puffer (pH 7.6, Variante A), (2) markieren : 5 mL 1,27 g/cm3 ρCsCl in Ad-Puffer (pH 7.6, Variante A). Hinweis: Nach Kupplung stattgefunden hat, werden Puffer ohne DÄMMUND verwendet, da keine freien Thiol-Gruppen nun auf den Vektor Capsids vorhanden sein sollte.</li>
			<li>Laden Sie den Überstand auf die CsCl-Gradienten zu und füllen Sie beide Gradienten gleich an die Spitze mit Ad-Puffer (pH 7.6, Variante A).</li>
			<li>Passen Sie die Gewichte der gegenüberliegenden Rohre zu einem 0,0 g Gewichtsunterschied.</li>
		</ol></li>
		<li>Ultrazentrifugen für 2 h bei 176.000 x g bei 4 ° C.</li>
		<li>Kurz vor dem Ende der Ultrazentrifugation equilibrate eine PD-10 Spalte 5 Mal mit 5 mL Ad-Puffer (pH 7.6, Variante A).</li>
		<li>Wie in Schritt 3.2.10, beheben Sie die Ultrazentrifugation Röhre stehen, verlassen die Gegend um die untere Phase Markierung zugänglich. Legen Sie die Schwanenhals-Lampe über das Rohr. Rund um die Grenze zwischen den unteren und oberen Phasen sollte eine ausgeprägte Band (Vektor-Virionen) wiederum sichtbar (Abbildung 3).</li>
		<li>Sammeln Sie die Vektoren durch das Rohr mit einer Nadel punktieren und aufstrebende Vektor-Band in eine Spritze, und übertragen Sie den Vektor auf eine 15 mL-Tube. Achten Sie darauf, um die Virionen beider Gradienten Röhren zusammen als ein Gesamtvolumen von 2,5 mL oder weniger zu sammeln. Wenn ein kleineres Volumen gesammelt wird, füllen Sie, um ein Gesamtvolumen von 2,5 mL mit Ad-Puffer (Variante A) zu erhalten.</li>
		<li>Laden Sie die 2,5 mL auf die äquilibriert PD-Säule. Entsorgen Sie den Durchfluss.</li>
		<li>Fügen Sie 3 mL Ad Puffer (Variante A) auf die Säule und die Durchströmung (mit gereinigtem Vektor Virionen) sammeln.</li>
		<li>Fügen Sie Glycerin (333 µL) um eine Endkonzentration von 10 % erhalten und teilen Sie in geeigneten Aliquote (z. B. 400 µL jeder) und beinhalten Sie eine Aliquote von 20 µL für Titer-Bestimmung von OD260 Messung.</li>
		<li>Speichern Sie die Vektor-Lösung bei-80 ° C.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Titer des Vektors durch Messung der OD-260 20 µL Vektor-Lösung, 79 µL Ad-Puffer (Variante A) und 1 µL 10 % SDS wie in Schritt 3.2.12 beschrieben. Verwenden Sie als eine leere 79 µL Ad-Puffer (Variante A), 10 µL 10 % Glycerin und 1 µL 10 % SDS.</li>
		<li>Berechnen Sie den Vektor-Titer als: OD260 x Faktor der Verdünnung x 1.1 x 109 Vektor Partikel/µL. Da im Schritt 3.2.27. zubereitet, zu berechnen: OD260 X 5 x 1.1 x 109 Vektor Partikel/µL</li>
	</ol></li>
</ol>4. Überprüfung der Kupplung durch SDS-PAGE:
Hinweis: Wenn Verbindungen mit ausreichend hoher Molekulargewichte für die Kopplung zu Ad Virionen verwendet werden, kann Kupplung durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) überprüft werden. Erfolgreiche Kopplung sollte dann eine Verschiebung der Protein-Band entsprechend modifizierten Ad Virion Proteins, im Vergleich mit dem Protein in der unveränderten Ad Virion führen (siehe Abbildung 4).
<ol><li>Entsprechend der berechneten Titer des Vektors (Schritt 3.2.28.) trennen Sie 1-2 x 1010 Vektor Partikel durch SDS-PAGE (8 %).</li>
	<li>Silber-Färbung der Gel39 , auch schwache Protein Bänder zu erkennen, um das Gel zu entwickeln:<ol>
<li>Bereiten Sie Puffer silberne Färbung (für 100 mL Puffer benötigten Mengen sind in Klammern angegeben):<ol>
<li>Bereiten Sie Puffer 1 durch Mischen 38 mL DdH2O, 50 % MeOH (50 mL 100 MeOH), 12 % AcOH (12 mL 100 % AcOH), und 0.0185 % HCHO (50 µL 37 % HCHO).</li>
			<li>Bereiten Sie Puffer 2 durch Zugabe von 50 % EtOH (50 mL 100 % EtOH) bis 50 mL DdH2O.</li>
			<li>Bereiten Sie Puffer 3 durch Zugabe von 0,127 g/L Na2S2O3 (12,744 mg) auf 100 mL DdH2O.</li>
			<li>Bereiten Sie Puffer 4 durch Zugabe von 2 g/L AgNO3 (0,2 g) und 0.0185 % HCHO (50 µL 37 % HCHO) auf 100 mL DdH2O.</li>
			<li>Bereiten Sie Puffer 5 durch Zugabe von 60 g/L Na2CO3 (6 g), 0.0185 % HCHO (50 µL 37 % HCHO), und 2,5 mg/L Na2S2O3 (0,256 mg) DdH2O zu einem Endvolumen von 100 mL zu erhalten.</li>
			<li>Bereiten Sie Puffer 6 durch Mischen 38 mL DdH2O, 50 % MeOH (50 mL 100 % MeOH), und 12 % AcOH (12 mL 100 % AcOH).</li>
			<li>Bereiten Sie Puffer 7 durch das Mischen von 60 mL DdH2O, 30 % MeOH (30 mL 100 % MeOH), und 10 % Glycerin (10 mL 100 % Glycerin).</li>
			<li>Bereiten Sie Puffer 8 durch 10 % Glycerin (10 mL 100 % Glycerin) mischen mit 90 mL DdH2O.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ausführung Silber Färbung<ol>
<li>Fixieren Sie das Gel im Puffer 1 für 30 min.</li>
		<li>Waschen Sie das Gel in Puffer 2 für 15 Minuten.</li>
		<li>Das Gel im Puffer 3 für 1 min vorbehandeln.</li>
		<li>Waschen Sie das Gel 3mal in DdH2O für 20 s.</li>
		<li>Imprägnieren Sie das Gel im Puffer 4 für 20 Minuten.</li>
		<li>Waschen Sie das Gel 2 Mal in DdH2O für 20 s.</li>
		<li>Das Gel im Puffer 5 zu entwickeln, bis die Bänder sichtbar werden (10 s, 10 min).</li>
		<li>Waschen Sie das Gel in DdH2O 2 min 2 Mal.</li>
		<li>Entwicklung im Puffer 6 für 5 min zu stoppen.</li>
		<li>Schonen Sie das Gel in Puffer 7 für 20 min.</li>
		<li>Speichern Sie das Gel im Puffer 8. Hinweis: Kupplung Effizienz kann durch densitometrische Quantifizierung der modifizierten und unmodifizierten Bands der gezielten Capsomere bestimmt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Benko, M., Harrach, B. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-662-05597-7_1">Molecular evolution of adenoviruses.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. , 3-35 (2003).</li>
<li>Davison, A. J., Benko, M., Harrach, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+content+and+evolution+of+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetic+Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic content and evolution of adenoviruses.</a> Journal of Genetic Virology. 84, 2895-2908 (2003).</li>
<li>Rowe, W. P., Huebner, R. J., Gilmore, L. K., Parrott, R. H., Ward, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+cytopathogenic+agent+from+human+adenoids+undergoing+spontaneous+degeneration+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 84, New York, N.Y. 570-573 (1953).</li>
<li>van Oostrum, J., Burnett, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+composition+of+the+adenovirus+type+2+virion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular composition of the adenovirus type 2 virion.</a> Journal of Virology. 56, 439-448 (1985).</li>
<li>Stewart, P. L., Fuller, S. D., Burnett, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difference+imaging+of+adenovirus%3A+bridging+the+resolution+gap+between+X-ray+crystallography+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22TheEMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Difference imaging of adenovirus: bridging the resolution gap between X-ray crystallography and electron microscopy.</a> TheEMBO Journal. 12, 2589-2599 (1993).</li>
<li>Stewart, P. L., Burnett, R. M., Cyrklaff, M., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+reconstruction+reveals+the+complex+molecular+organization+of+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Image reconstruction reveals the complex molecular organization of adenovirus.</a> Cell. 67, 145-154 (1991).</li>
<li>Meier, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+triggers+macropinocytosis+and+endosomal+leakage+together+with+its+clathrin-mediated+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Adenovirus triggers macropinocytosis and endosomal leakage together with its clathrin-mediated uptake.</a> Journal of Cellular Biology. 158, 1119-1131 (2002).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+factor+X+shields+adenovirus+type+5+from+attack+by+natural+antibodies+and+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement.</a> Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).</li>
<li>Qiu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+natural+IgM+concentration+on+gene+therapy+with+adenovirus+type+5+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Impact of natural IgM concentration on gene therapy with adenovirus type 5 vectors.</a> Journal of Virology. 89, 3412-3416 (2015).</li>
<li>Alemany, R., Suzuki, K., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+clearance+rates+of+adenovirus+type+5+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetic+Virology%22%5BJournal%5D)">Blood clearance rates of adenovirus type 5 in mice.</a> Journal of Genetic Virology. 81, 2605-2609 (2000).</li>
<li>Smith, J. S., Xu, Z., Tian, J., Stevenson, S. C., Byrnes, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+systemically+delivered+adenovirus+vectors+with+Kupffer+cells+in+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Interaction of systemically delivered adenovirus vectors with Kupffer cells in mouse liver.</a> Human Gene Therapy. 19, 547-554 (2008).</li>
<li>Schiedner, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hemodynamic+response+to+intravenous+adenovirus+vector+particles+is+caused+by+systemic+Kupffer+cell-mediated+activation+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">A hemodynamic response to intravenous adenovirus vector particles is caused by systemic Kupffer cell-mediated activation of endothelial cells.</a> Human Gene Therapy. 14, 1631-1641 (2003).</li>
<li>Xu, Z., Tian, J., Smith, J. S., Byrnes, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+adenovirus+by+Kupffer+cells+is+mediated+by+scavenger+receptors%2C+natural+antibodies%2C+and+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Clearance of adenovirus by Kupffer cells is mediated by scavenger receptors, natural antibodies, and complement.</a> Journal of Virology. 82, 11705-11713 (2008).</li>
<li>Khare, R., Reddy, V. S., Nemerow, G. R., Barry, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+adenovirus+serotype+5+hexon+regions+that+interact+with+scavenger+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of adenovirus serotype 5 hexon regions that interact with scavenger receptors.</a> Journal of Virology. 86, 2293-2301 (2012).</li>
<li>Piccolo, P., Annunziata, P., Mithbaokar, P., Brunetti-Pierri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SR-A+and+SREC-I+binding+peptides+increase+HDAd-mediated+liver+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">SR-A and SREC-I binding peptides increase HDAd-mediated liver transduction.</a> Gene Therapy. 21, 950-957 (2014).</li>
<li>Plüddemann, A., Neyen, C., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+scavenger+receptors+and+host-derived+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Macrophage scavenger receptors and host-derived ligands.</a> Methods (San Diego, Calif). 43, 207-217 (2007).</li>
<li>Ganesan, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+clearance+of+blood-borne+virus+by+liver+sinusoidal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient clearance of blood-borne virus by liver sinusoidal endothelium.</a> PLoS Pathogen. 7, e1002281(2011).</li>
<li>Cichon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titer+determination+of+Ad5+in+blood%3A+a+cautionary+note%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Titer determination of Ad5 in blood: a cautionary note.</a> Gene Therapy. 10, 1012-1017 (2003).</li>
<li>Carlisle, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+erythrocytes+bind+and+inactivate+type+5+adenovirus+by+presenting+Coxsackie+virus-adenovirus+receptor+and+complement+receptor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human erythrocytes bind and inactivate type 5 adenovirus by presenting Coxsackie virus-adenovirus receptor and complement receptor 1.</a> Blood. 113, 1909-1918 (2009).</li>
<li>Waddington, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+serotype+5+hexon+mediates+liver+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adenovirus serotype 5 hexon mediates liver gene transfer.</a> Cell. 132, 397-409 (2008).</li>
<li>Kalyuzhniy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+serotype+5+hexon+is+critical+for+virus+infection+of+hepatocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Adenovirus serotype 5 hexon is critical for virus infection of hepatocytes in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, 5483-5488 (2008).</li>
<li>Vigant, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1525001616322833">Substitution of hexon hypervariable region 5 of adenovirus serotype 5 abrogates blood factor binding and limits gene transfer to liver. Molecular Therapy.</a> The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1474-1480 (2008).</li>
<li>Jonsson, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+factors+IX+and+X+enhance+binding+and+infection+of+adenovirus+types+5+and+31+in+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Coagulation factors IX and X enhance binding and infection of adenovirus types 5 and 31 in human epithelial cells.</a> Journal of Virology. 83, 3816-3825 (2009).</li>
<li>Bradshaw, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+receptor+engagement+during+infection+by+adenovirus+complexed+with+blood+coagulation+factor+X%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Requirements for receptor engagement during infection by adenovirus complexed with blood coagulation factor X.</a> PLoS Pathogen. 6, e1001142(2010).</li>
<li>Duffy, M. R., Bradshaw, A. C., Parker, A. L., McVey, J. H., Baker, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cluster+of+basic+amino+acids+in+the+factor+X+serine+protease+mediates+surface+attachment+of+adenovirus%2FFX+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A cluster of basic amino acids in the factor X serine protease mediates surface attachment of adenovirus/FX complexes.</a> Journal of Virology. 85, 10914-10919 (2011).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+factor+X+shields+adenovirus+type+5+from+attack+by+natural+antibodies+and+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement.</a> Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).</li>
<li>Prill, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+of+adenovirus+hexon+allow+for+either+hepatocyte+detargeting+or+targeting+with+potential+evasion+from+Kupffer+cells.+Molecular+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy.</a> The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).</li>
<li>Zaiss, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+Heparan+Sulfate+Is+Required+for+Adeno-Associated+Virus+2+but+Dispensable+for+Adenovirus+5+Liver+Transduction+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte Heparan Sulfate Is Required for Adeno-Associated Virus 2 but Dispensable for Adenovirus 5 Liver Transduction In Vivo.</a> Journal of Virology. 90, 412-420 (2015).</li>
<li>Delgado, C., Francis, G. E., Fisher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uses+and+properties+of+PEG-linked+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Therapeutic+Drug+Carrier+Systems%22%5BJournal%5D)">The uses and properties of PEG-linked proteins.</a> Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems. 9, 249-304 (1992).</li>
<li>Parveen, S., Sahoo, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomedicine%3A+clinical+applications+of+polyethylene+glycol+conjugated+proteins+and+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Pharmacokinet%22%5BJournal%5D)">Nanomedicine: clinical applications of polyethylene glycol conjugated proteins and drugs.</a> Clin. Pharmacokinet. 45, 965-988 (2006).</li>
<li>O'Riordan, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEGylation+of+adenovirus+with+retention+of+infectivity+and+protection+from+neutralizing+antibody+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">PEGylation of adenovirus with retention of infectivity and protection from neutralizing antibody in vitro and in vivo.</a> Human Gene Therapy. 10, 1349-1358 (1999).</li>
<li>Subr, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coating+of+adenovirus+type+5+with+polymers+containing+quaternary+amines+prevents+binding+to+blood+components%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Coating of adenovirus type 5 with polymers containing quaternary amines prevents binding to blood components.</a> Journal of Controlled Release. 135, 152-158 (2009).</li>
<li>Kreppel, F., Gackowski, J., Schmidt, E., Kochanek, S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1525001605001012">Combined genetic and chemical capsid modifications enable flexible and efficient de- and retargeting of adenovirus vectors. Molecular Therapy.</a> The Journal of the American Society of Gene Therapy. 12, 107-117 (2005).</li>
<li>Corjon, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S152500161632679X">Targeting of adenovirus vectors to the LRP receptor family with the high-affinity ligand RAP via combined genetic and chemical modification of the pIX capsomere.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1813-1824 (2008).</li>
<li>Prill, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+of+adenovirus+hexon+allow+for+either+hepatocyte+detargeting+or+targeting+with+potential+evasion+from+Kupffer+cells.+Molecular+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy.</a> The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).</li>
<li>Krutzke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+blood+coagulation+factor+X-binding+to+Ad5+by+position-specific+PEGylation%3A+Preventing+vector+clearance+and+preserving+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Substitution of blood coagulation factor X-binding to Ad5 by position-specific PEGylation: Preventing vector clearance and preserving infectivity.</a> Journal of Controlled Release. 235, 379-392 (2016).</li>
<li>Prill, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceless+bioresponsive+shielding+of+adenovirus+hexon+with+HPMA+copolymers+maintains+transduction+capacity+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Traceless bioresponsive shielding of adenovirus hexon with HPMA copolymers maintains transduction capacity in vitro and in vivo.</a> PloS One. 9, e82716(2014).</li>
<li>Kratzer, R. F., Kreppel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+Purification%2C+and+Titration+of+First-Generation+Adenovirus+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Production, Purification, and Titration of First-Generation Adenovirus Vectors.</a> Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 377-388 (2017).</li>
<li>Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/elps.1150080203">Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels.</a> ELECTROPHORESIS. 8, 93-99 (1987).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Effizienz durch die gentechnisch eingeführte Cysteine chemisch verändert werden können ist in der Regel 80-99 %, und bestimmte Variablen beeinflussen diese Effizienz. Erstens ist es sehr wichtig, dass die gentechnisch eingeführte Cysteine nicht vorzeitige Oxidation unterzogen werden. Gut geschützt in der reduzierenden Umgebung der Produzent Zellen ist, es zwingend erforderlich, um eine nicht-oxidativen Umgebung zu bieten, nach der Veröffentlichung von Vektor-Partikel aus den Hersteller-Zellen und während chemische Mo...

Adenoviren (Ad), Mitglieder der Familie Adenoviridae, sind unbehüllte DNA-Viren, von denen mehr als 70 Arten bisher identifizierten (http://hadvwg.gmu.edu) gewesen sein. Je nach Hemaglutination Eigenschaften, Genom-Struktur und Sequenzierung Ergebnisse können sieben Arten (menschliche Adenoviren A bis G)1,270 n. Chr. Typen unterteilt werden. Das menschliche Genom Ad 38 kb groß ist und von einem ikosaedrischen Nukleokapsid3eingekapselt. Aufgrund ihrer Fülle sind das Kapsid Protein Hexon, Penton Basis und Faser alle großen Kapsid-Proteine genannt. Die häufigste und größte Kapsid Protein Hexon bildet 20 Kapsid Facetten, jeweils bestehend aus 12 Hexon Homotrimers4,5. Penton, befindet sich auf jeder ikosaedrischen Kante (Scheitelpunkt), besteht aus Pentamers aus einer Penton-Basis und stellt die Basis für den Scheitelpunkt Spike, der glykosylierten Faser Trimere5,6integriert ist. Die native Ad Zelleintrag besteht im Grunde aus zwei wesentliche Schritte. Erstens bindet der Faser-Regler an den primären Rezeptor. Dies ist in Anzeigentypen von Sorte A, C, E und F Coxsackie und Adenovirus-Rezeptor (Auto). Diese Interaktion bringt das Virion in räumlicher Nähe der Zelloberfläche, wodurch es Wechselwirkungen zwischen zellulären Integrine und RGD-Motiv in der Penton Basis und folglich induzieren zelluläre Reaktionen. Zweitens führen Änderungen in das Zellskelett, Internalisierung der Virion und des Verkehrs auf das Endosom-7. Bei teilweiser Demontage in das Endosom, das Virion freigegeben Und reist nach Zytoplasma letztlich auf den Kern für die Replikation.
Während Ad lokal zugestellt werden kann (zB., für genetische Impfung), systemische Lieferung durch den Blutstrom nach Bedarf für Onko-Virotherapie steht vor mehreren Hindernissen. Während in der Blutbahn zirkulierenden begegnen injizierte Virionen die Abwehrkräfte des Immunsystems des Wirts, führt zur schnellen Neutralisation der Virus-basierte Vektoren und rendering-Ad-basierte Vektoren in systemische Anwendungen äußerst ineffizient. Darüber hinaus die natürliche Hepatotropism des Ad stört systemische Lieferung und Ad in seine neue Zielzellen umleiten gelöst werden.
Keimbahn-codierte natürliche IgM-Antikörper des angeborenen Immunsystems schnell erkennen und binden stark repetitive Strukturen auf der Oberfläche des Virion8,9. Diese Immunkomplexe aktivieren dann die klassische und nicht-klassische Wege des Komplementsystems, führt zur schnellen Ergänzung-vermittelten Neutralisation eines großen Teils der Virionen8. Ein zweiten Weg, was große Entfernung von Ad Virionen ist durch Makrophagen10 vermittelt und akute toxische und hämodynamische Nebenwirkungen11,12zugeordnet. Im Falle von Ad insbesondere Beseitigung Kupffer Zellen mit Wohnsitz in der Leber binden und phagocytically nehmen die Ad Virionen über spezifische Scavenger-Rezeptoren, damit deren aus dem Blut13,14,15 . Spezifische Scavenger-Rezeptoren auch auf Leber sinusförmigen endothelial Zellen (LSE)16identifiziert worden, und LSE Zellen scheinen auch beitragen, Vektor Beseitigung17, sondern inwieweit noch der Klärung bedarf. Darüber hinaus sind einige Ad-Arten und ihre abgeleiteten Vektoren effizient durch menschliche Erythrozyten18 abgesondert, die sie per Auto oder Komplement-Rezeptor CR119binden. Der Hinweis Diese Kompensierung Mechanismus kann nicht in das Maus-Modell-System im Gegensatz zu menschlichen Erythrozyten untersucht, Maus Erythrozyten nicht ausdrücklich Auto.
Spezifische Anti-Ad-Antikörper erzeugt durch das adaptive Immunsystem nach Exposition gegenüber Ad entweder aufgrund von früheren Infektionen mit Ad oder nach der ersten Lieferung in systemische Anwendungen erhöhen eine weitere Barriere für effektive Verwendung von Ad-Vektoren, und sie sollten umgangen werden, in effiziente systemische Lieferung.
Schließlich behindert die starke Hepatotropism einiger Ad Arten (einschließlich Ad5) stark Anwendung von Ad in der systemischen Therapie. Dieses Ergebnis in Hepatozyten Transduktion Tropismus ist aufgrund der hohen Affinität des Ad Virion an Blutgerinnungsfaktor X (FX), vermittelt durch das Zusammenspiel von FX mit dem Ad Hexon Protein20,21,22. FX überbrückt das Virion zu Heparin Sulfat Glykoproteinen (HSPGs) auf der Oberfläche von Hepatozyten20,23,24,25. Ein entscheidender Faktor für diese Interaktion scheint den spezifischen Umfang von N und O-Sulfatierung von HSPGs in Leberzellen24, die unterscheidet sich von HSPGs auf andere Zelltypen. Neben dieser FX-vermittelten Weg deuten den letzten Studien weitere Wege noch nicht dazu führen, dass Ad Transduktion von Hepatozyten26,27,28identifiziert.
Vor kurzem hat sich gezeigt, dass FX sich nicht nur in Hepatozyten Transduktion von Ad engagiert, aber auch durch die Bindung, das Virion die Viruspartikel gegen Neutralisation schirmt von Ergänzung System26. Reduzierung der Hepatozyten Transduktion durch die Verhinderung FX Bindung, würde daher die unerwünschte Nebenwirkung der zunehmenden Ad Neutralisation über das angeborene Immunsystem erstellen.
Ein profundes Wissen um die komplexen Wechselwirkungen zwischen Vektoren und Wirtsorganismen ist daher notwendig, eine effizientere Vektoren für systemische Anwendungen zu entwickeln, die die Hindernisse auferlegt durch den Wirtsorganismus zu umgehen.
Eine Strategie, die ursprünglich für therapeutische Proteine verwendet wurde wurde angepasst für Ad-Vektoren, zumindest teilweise die oben beschriebenen Barrieren zu überwinden. Antigenität und Immunogenität der therapeutischen Eiweißverbindungen konnte durch Kopplung an Polyethylenglykol (PEG)29,30reduziert werden. Daher die kovalente Kopplung von Polymeren wie PEG oder Poly [N-(2-Hydroxypropyl) Methacrylamid] (pHPMA), das Kapsid Oberfläche schützt den Vektor von unerwünschten Vektor-Wirt Interaktionen. Allgemein, Zielgruppen Polymer Kupplung ε-Amin aus Lysin Seite Rückstände, die nach dem Zufallsprinzip auf der Kapsid Oberfläche verteilt sind. Vektor-Partikel in Lösung sind, aufgrund der hydrophilen Natur der beigefügten Polymere, eine stabile Wasserhülle umgeben, die reduziert das Risiko von Immunzellen Anerkennung oder enzymatischen Abbau. Darüber hinaus zeigten die pegylierten Ad Vektoren Neutralisation von Anti-Hexon Antikörper in-vitro- und in Pre-immunisierten Mäusen in Vivo31entziehen. Im Gegensatz zu genetischen Kapsid Modifikationen erfolgt die chemische Kopplung von Polymeren nach Produktion und Reinigung, so dass nicht nur für die Verwendung von konventionellen Hersteller Zellen und Produktion hohe Titer Vektor Bestände, sondern auch für die gleichzeitige Änderung von Tausenden von Aminosäuren auf der Oberfläche Kapsid. Jedoch erfolgt unter der Regie von Amin Abschirmung nach dem Zufallsprinzip während der ganze Kapsid Oberfläche, was zu hohen Heterogenitäten und nicht zulassend Änderung des spezifischen Capsomers. Darüber hinaus beeinträchtigen der großen Polymer Moieties für wohltuende Wirkung erforderlichen Virus Bioaktivität32.
Zur Überwindung dieser Einschränkungen, Kreppel Et Al. 33 ein Geneti-chemischen Konzept für Vektor Rück- und de-targeting eingeführt. Cysteine wurden genetisch in die Virus-Kapsid an Lösungsmittel-exponierten Positionen wie Faser HI-Schleife33, Protein IX34und Hexon35,36eingeführt. Obwohl nicht natürlich vorkommenden, Cystein tragenden Ad Vektoren zu hohe Titer in den normalen Produzent Zellen erzeugt werden können. Wichtig ist, ermöglicht Einfügen von Cysteine in bestimmten Capsomers und in verschiedenen Positionen innerhalb eines einzigen Capsomer für hoch spezifische Änderungen der Thiol-Gruppe-reaktive Moieties. Dieser Geneti-chemischen Ansatz hat sich gezeigt, Ad-Vektor-Design zahlreiche Hindernisse zu überwinden. Die Kombination von Amin-basierte Pegylierung für Umfang und Thiol-basierte Kopplung von Transferrin, die Faser-Knopf, die, den Hi-Schleife bewährt hat, erfolgreich neu ausrichten Ad Vektoren auf Auto-defizienten Zellen33geändert. Da meist unerwünschte Wechselwirkungen (neutralisierenden Antikörpern, Blutgerinnungsfaktor FX) Hexon beteiligt ist, waren Thiol-basierte Modifikation Strategien auch auf Hexon angewendet. Kupplung kleine PEG Moieties an den HVR5 der Hexon verhindert Ad Vektor Partikel um transduzieren SKOV-3 Zellen in Anwesenheit von FX, während große PEG Moieties Hepatozyten Transduktion14,35erhöht. N. Chr. Vektor Partikel tragen Mutationen in der Faser-Knopf Hemmung Auto Bindung und HVR7 hemmende Bindung von FX (und Lager eingefügt Cysteine in HVR1 für Position-spezifischen Pegylierung) erwiesen sich als Antikörper und Komplement-vermittelten Neutralisation zu entziehen, ebenso wie Scavenger Rezeptor-vermittelte Aufnahme ohne Verlust der Infektiosität. Interessant ist, trotz eines Mangels an natürlichen FX Schutzschild verbessert Pegylierung nochmals Transduktion von Hepatozyten als Funktion der PEG Größe36. Jedoch zeigte sich, dass kovalente Abschirmung auf intrazelluläre Menschenhandel Prozesse auswirken. Prill Et Al. gegenüber irreversiblen versus Bioresponsive Schilde basierend auf pHPMA und gezeigt, dass weder die Art der Abschirmung noch Co-Polymer kostenlos Zelleintrag beeinflusste aber auf Partikel des Menschenhandels in den Zellkern. Mit einem Bioresponsive Schild mit positiv geladenen pHPMA Copolymere erlaubt für Partikel des Menschenhandels in den Zellkern, Aufrechterhaltung der hohen Transduktion Wirkungsgrade von Ad Vektoren in Vitro und in Vivo37.
Zusammenfassend lässt sich sagen zeigen diese Daten, dass selbst unter der Annahme, dass alle Vektor-Wirt-Interaktionen bekannt und angesehen wurden, übermäßige Kapsid Oberflächenmodifikationen notwendig, die mit systemischen Vektor Lieferung verbundenen Hürden zu überwinden sind.
Hier bieten wir ein Protokoll, um ortsspezifische chemische Modifikationen des Adenovirus-Vektor-Capsids für Abschirmung und/oder retargeting Adenovirus-Vektor-Partikel und Adenovirus-basierte onkolytische Viren durchführen. Das Konzept dieser Technologie ist in Abbildung 1dargestellt. Es ermöglicht die Abschirmung bestimmter Kapsid Regionen von unerwünschten Wechselwirkungen durch kovalente Bindung von synthetischen Polymeren. Gleichzeitig bietet es auch eine Möglichkeit zu befestigen Liganden und Abschirmung und targeting zu kombinieren. Verwenden einfache Chemie, können Experimentatoren Adenovirus-Vektor-Oberfläche mit einer Vielzahl von Molekülen einschließlich Peptide/Proteine, Kohlenhydrate, Lipide und andere kleine Moleküle kovalent ändern. Darüber hinaus sieht das Protokoll ein Gesamtkonzept für die chemische Modifizierung von biologisch aktiven Virus abgeleitet Vektoren unter Wartung ihrer biologische Integrität und Aktivität.

<table><tbody><tr><td><stark>Vektorreinigung und chemische Modifikation</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Argongas</td><td>Luft flüssig</td><td>lokaler Gashändler</td><td></td></tr><tr><td>Flüssiger Stickstoff</td><td>Luft flüssiger</td><td>lokaler Gashändler</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>431123</td><td></td></tr><tr><td>Stericup Express Plus 0,22 &micro; m</td><td>Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-10g</td><td></td></tr><tr><td>2 mL (3mL) Norm Ject (Spritzen)</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4020.000V0</td><td></td></tr><tr><td>Fine-Ject Nadeln zum Einmalgebrauch (gelb 0,9 x 40 mm)</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710009040</td><td></td></tr><tr><td>Cäsiumchlorid 99,999% Ultra</td><td>Quality Roth</td><td>8627.1</td><td></td></tr><tr><td>Kieselgelkügelchen</td><td>Applichem</td><td>A4569.2500</td><td></td></tr><tr><td>Methoxypolyethylenglykolmaleimid - 750 (PEG mal-750)</td><td>Iris Biotech</td><td></td><td>Store in Kieselgelkügelchen bei -80 &deg; C</td></tr><tr><td>13,2 mL Ultra Clear Ultrazentrifugenröhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td>nur in der Haube geöffnet</td></tr><tr><td>PD-10 Größenausschluss-Chromatographiesäule</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td>bei 4 & deg; C</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>AppliChem</td><td>A1069.1000</td><td></td></tr><tr><td>SDS Ultrapure</td><td>AppliChem</td><td>A1112,0500</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>AppliChem</td><td>A1123.1000</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>><Kommentare</strong</td></tr><tr><td>> Material für Zellkultur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03590</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-0231SP</td><td></td></tr><tr><td>FBS Good</td><td>PAN Biotech</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>PAN Biotech</td><td>P06-07100</td><td></td></tr><tr><td>Biosphären-Filterspitzen (verschiedene Größen)</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipetten (verschiedene Größen)</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reaktionsgefäße (verschiedene Größen)</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC Platten 15cm</td><td>Sarstedt</td><td>83.3903</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Material für Silberfärbeprotokoll</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>J.T.Baker</td><td>8045</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>AppliChem</td><td>1613,2500PE</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>AppliChem</td><td>A0820,2500PE</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd 37%</td><td>AppliChem</td><td>A0877,0250</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>AppliChem</td><td>A1613,2500PE</td><td></td></tr><tr><td>Natriumthiosulfat</td><td>AppliChem</td><td>1,418,791,210</td><td></td></tr><tr><td>Silbernitrat</td><td>AppliChem</td><td>A3944.0025</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcarbonat</td><td>AppliChem</td><td>A3900,0500<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Name</td><td>Company</strong</td><td>>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Spezielle Laborgeräte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Exsikkator</td><td>Nalgene</td><td>5311-0250</td><td></td></tr><tr><td>Megafuge 40</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roter für Megafuge TX750 + Adapter und Llids für 500 mL Röhrchen</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Konventionelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge z.B. Optima XPN-80</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>geeigneter Ultrazentrifuge Rotor z.B. SW41</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-Meter</td><td>Herkömmliches</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stativ mit Klemmen</td><td>Konventionell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schwanenhalslampe</td><td>Konventionell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Überkopfrotor</td><td>Konventionell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermischer Block</td><td>Konventionelles</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photometer (OD 260)</td><td>Konventionell</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

genetischen und chemischen kapsid modifikationen der gentransfer adenovirus-basierte vektoren kombiniert für abschirmung und targeting

Combined Genetic and Chemical Capsid Modifications of Adenovirus-Based Gene Transfer Vectors for Shielding and Targeting

Adenovirus-Vektoren sind mächtige Werkzeuge für genetische Impfung und onkolytische Virotherapie. Jedoch sind sie anfällig für mehrere unerwünschte Vektor-Wirt Interaktionen, vor allem nach Lieferung in Vivo . Es ist ein Konsens, dass die Beschränkungen durch unerwünschte Vektor-Wirt Interaktionen können nur überwunden werden, wenn definierte Modifikationen der Vektor Oberfläche durchgeführt werden. Diese Änderungen umfassen Abschirmung der Teilchen aus unerwünschten Wechselwirkungen und gezielt durch die Einführung des neuen Liganden. Das Ziel des hier vorgestellten Protokolls soll den Leser zu generieren abgeschirmt und, falls gewünscht, umleiten, menschliche Adenovirus gen Übertragung Vektoren oder onkolytische Viren. Das Protokoll ermöglicht es Forschern, die Oberfläche des Adenovirus-Vektor-Capsids von bestimmten chemischen Anlage von synthetischen Polymeren, Kohlenhydrate, Lipide oder anderen biologischen oder chemischen Moieties zu ändern. Es beschreibt die Spitzentechnologie der kombinierten genetischen und chemischen Kapsid Modifikationen, die gezeigt worden, um das Verständnis und die Überwindung der Barrieren für in Vivo Lieferung von Adenovirus Vektoren zu erleichtern. Eine ausführliche und kommentierte die entscheidenden Schritte für die Durchführung von bestimmter chemischer Reaktionen mit biologisch aktiven Viren oder Virus-abgeleitete Vektoren ist beschrieben. Im Protokoll beschriebene Technik basiert auf der genetischen Einführung (natürlich abwesend) Cystein Rückstände in Lösungsmittel ausgesetzt Schleifen von Adenovirus-abgeleitete Vektoren. Diese Cystein-Reste bieten eine spezifische chemische Reaktivität, die nach der Produktion der Vektoren, hohe Titer für sehr gezielt und effizient kovalente chemische Kopplung der Moleküle aus den unterschiedlichsten Substanzklassen zum Vektor ausgenutzt werden kann, Partikel. Wichtig ist, kann dieses Protokoll leicht angepasst werden, um eine Vielzahl von verschiedenen (nicht-Thiol-basierten) chemische Modifikationen des Adenovirus-Vektor-Capsids durchzuführen. Schließlich ist es wahrscheinlich, dass unbehüllte Viren Gene Transfer Vektoren anders als Adenovirus auf der Basis dieses Protokolls geändert werden kann.

Abbildung 2 zeigt Beispiele für die zytopathischer Effekt (CPE) 293 (HEK 293) Zellen, die erfolgreich Vektor Produktion angibt. Zellen sollten Morphologie (Abbildung 2) 40-48 Stunden nach der Impfung mit dem Virus Vektor zeigen. Die richtige Timepoint für die Ernte ist entscheidend für Viruspartikel durch Lyse der Zelle nicht zu verlieren und Oxidation von gentechnisch eingeführte Thiol-Gruppen zu verhindern. Wenn Vektor Partikel...

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht Forschern speziell Adenovirus Capsids an ausgewählten Standorten durch einfache Chemie ändern. Geschirmte Adenovirus Vektoren Partikel Targeting-gen Übertragung Vektoren erzeugt werden können und Vektor-Wirt-Interaktionen untersucht werden können.

Genetischen und chemischen Kapsid Modifikationen der Gentransfer Adenovirus-basierte Vektoren kombiniert für Abschirmung und Targeting

Adenovirus vectors are potent tools for genetic vaccination and oncolytic virotherapy. However, they are prone to multiple undesired vector-host ...

Diese Methode kann helfen, schlüsselhafte Fragen auf dem Gebiet der Gentherapie, Onkolyse und GenetischeN Impfung zu beantworten. Es erleichtert das Verständnis und die Modulation von Vektorhosts Interaktionen von Adenovirus-Gentransfervektoren, dem am häufigsten verwendeten Vektortyp in klinischen Studien bis heute. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Adenovirus-Capsulate mit einfacher Chemie gezielt in hochdefinierter Weise an ausgewählten Positionen und in variablem Umfang modifiziert werden können.Die Implikationen dieser Technik reichen auf die Therapie aus, da die Vektorhostmodifikation nicht nur analysiert, sondern auch patientenorientiert moduliert werden kann. Obwohl diese Methode Einblicke in bestimmte Vektor-Wirt-Wechselwirkungen bietet, kann sie auch für die Kennzeichnung und Verfolgung von Viruspartikeln in lebenden Organismen wie Mäusen verwendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, mit der einzigartigen Kombination von Virologie und organischer Chemie zu kämpfen, die praktisches Wissen aus beiden Bereichen erfordert.Eine besondere Demonstration dieser Technik ist von entscheidender Bedeutung, da hier Methoden aus der Organischen Chemie auf Methoden aus der Zellbiologie und Virologie treffen, einschließlich feldspezifischer Handhabungstricks. Bereiten Sie zum Starten dieses Verfahrens alle Puffer wie im Textprotokoll beschrieben vor. Wiegen Sie einen Milliliter jedes Gradientenpuffers, um seine Dichte zu überprüfen.Nach der Sterilisation aller Puffer die Puffer, die TCEP enthalten, für etwa 30 Sekunden mit Argongas streuen, um eine Oxidation des TCEP zu verhindern. Bewahren Sie die Durchstechflaschen mit der massiven pulverförmigen Kupplung in größeren Schläuchen auf, die jeweils mit einem Kissen aus Kieselgelperlen gefüllt sind, um den Aufbau von Kondenswasser beim Auftauen der Durchstechflaschen zu verhindern. Legen Sie diese Rohre in einen Trockentrockner.Entfernen Sie die Luft im Trockenbau und ersetzen Sie sie durch Argongas. Dann jedes Rohr fest schließen und in einen größeren Behälter mit Kieselgelperlen geben. Sobald alle Rohre verlegt sind, schließen Sie den Behälter.Bewahren Sie den Behälter bei 80 Grad Celsius auf, bis er einsatzbereit ist. Wenn Sie bereit zum Tauen sind, legen Sie den Behälter in eine Schicht Kieselsäureperlen in einem Trockenschrank. Lassen Sie den Behälter langsam auf Raumtemperatur erwärmen und öffnen Sie dann den Behälter.Wenn Zellen den optimalen zytopathischen Affekt erreichen, sammeln Sie sie, indem Sie die Platten kratzen und den Überstand auf Zentrifugenrohre übertragen. Drehen Sie die Zellsuspension bei 400 mal G für 10 Minuten. Als nächstes setzen Sie das Zellpellet in vier Milliliter Ad-Puffer mit 10 Millimolar TCEP wieder auf und übertragen Sie die resultierende Lösung in ein steriles 50-Milliliter-Rohr.Die Lösung in flüssigem Stickstoff einfrieren und dann in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auftauen. Wiederholen Sie diesen Gefriertauzyklus dreimal, um den Vektor zu retten. Zentrifuge bei 5000 G und vier Grad Celsius für zehn Minuten.Während zentrifugieren zwei Ultrazentrifugenrohre, um die Vorbereitung zwei gleiche Cäsiumchlorid Schritt Gradienten beginnen. Fügen Sie drei Milliliter der unteren Phase zu jedem dieser Rohre hinzu. Markieren Sie den Pegel der unteren Phase auf dem Rohr, bevor Sie die obere Phase laden.Dann stapeln Sie vorsichtig fünf Milliliter der oberen Phase bis zur unteren Phase und pfeifen Sie sie sehr langsam entlang der Wände des Rohres. Wenn die Steigungen vorbereitet sind und die Zentrifugation vollständig ist, lädt der Überstand aus der Probe gleichmäßig über die beiden Gradienten. Füllen Sie den verbleibenden Platz in jedem Gradientenrohr mit einem Ad-Puffer, der zehn Millimolar TCEP enthält und stellt sicher, dass die Rohre bis ganz nach oben gefüllt werden.Passen Sie das Gewicht der gegenüberliegenden Rohre auf eine Nullgewichtsdifferenz an. Und zentrifugieren Sie die Zentrifuge für 176000 mal G und 4 Grad Celsius für zwei Stunden. Danach verwenden Sie eine Klemme, um ein Ultrazentrifugationsrohr an einem Ständer zu befestigen.Achten Sie darauf, den Bereich um die untere Phase Ebene markiert zugänglich zu lassen. Legen Sie die Gänsehalslampe über das Rohr. Um die Markierung herum, an der Grenze zwischen der unteren und oberen Phase, sollte ein deutliches Band sichtbar sein.Punktieren Sie das Rohr mit einer Nadel, und aspirieren Sie das Vektorband in eine Spritze, um den Vektor zu sammeln. Übertragen Sie gesammelte Vektorvirons auf ein 15-Milliliter-Rohr und berechnen Sie die Menge des Kopplungssubstrats, die im Textprotokoll beschrieben wird. Übertragen Sie dann die Vektorlösung in ein Rohr von entsprechender Größe.Und die berechnete Menge der Kupplung Verbindungen Lagerlösung. Durch Overhead-Rotation bei Raumtemperatur eine Stunde lang sanft mischen. Passen Sie als Nächstes das Gesamtvolumen der Vektorlösung auf sechs Milliliter an, indem Sie den Ad-Puffer hinzufügen.Reinigen Sie den Vektor aus dem unreagierten Kopplungsmoiety mit einem zweiten Cäsiumchloridbindungsschritt, wie im Textprotokoll beschrieben. Punktieren Sie das Rohr mit einer Nadel und aspirieren Sie das Vektorband in eine Spritze. Übertragen Sie die gesammelten Vektoren in eine 15-Milliliter-Röhre.Wenn die Kombination aus beiden Gradientenröhren weniger als 2,5 Milliliter beträgt, stellen Sie die Lautstärke auf 2,5 Milliliter ein, indem Sie den Ad-Puffer hinzufügen. Laden Sie die kombinierten Virons in eine gleich verbesserte Pd-Spalte und verwerfen Sie den Durchfluss. Fügen Sie dann drei Milliliter Ad-Puffer zur Spalte hinzu und sammeln Sie den Durchfluss durch.Fügen Sie 333 Mikroliter Glycerin in den gesammelten Durchfluss ein, um die Endkonzentration von zehn Prozent zu erhalten. Teilen Sie diese in geeignete Aliquots auf. Achten Sie darauf, ein Aliquot von 20 Mikrolitern für eine strengere Bestimmung durch OD 260 Messung enthalten.Bewahren Sie die Vektorlösung bei 80 Grad Celsius auf, bis sie einsatzbereit ist. Repräsentative Ergebnisse der Auswirkungen auf 293 Zellen deuten darauf hin, dass die Vektorproduktion erfolgreich ist. Zellen sollten Morphologie 40-48 Stunden nach der Inkulturulation mit dem Virusvektor zeigen.Silbergebeizt SDS-Phagen wird dann verwendet, um die Kopplungseffizienz zu bewerten. Vektoren mit Cysteins, die sowohl mit dem hexonmodifizierten als auch mit dem unveränderten Hexon in die Capsomere-Pentonbasis eingeführt werden, werden ausgeführt. Die Hexon-Bänder weisen eine Verschiebung auf, die auf eine erfolgreiche Modifikation von über 90 Prozent der Monomere pro Capsid hinweist.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, eine reduzierende Umgebung für nicht modifizierte Vektorpartikel zu gewährleisten. Nach dem Umbau ist eine regelmäßige Atmosphäre geeignet. Präzise dokumentarische Berechnungen müssen eine quantitative Modifikation aller Vektorteilchen gewährleisten.Die Entwicklung dieser Technik hilft der Forschung auf dem Gebiet der Gentherapie, sichere und mangelhafte Strategien für die Vektorabgabe weiter zu erforschen. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Kopplung von Liganden zum Targeting oder Fluoreszenzfarbstoffe zur Kennzeichnung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie Rezeptornutzung und Bioverteilung zu beantworten. Bitte achten Sie darauf, Ihre lokalen GVO- und Arbeitssicherheitsvorschriften zu befolgen.

combined-genetic-chemical-capsid-modifications-adenovirus-based-gene

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir zeigen die grundlegende Technik zur molekularen konstruieren und zu entwickeln synthetischen Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektoren für die Gentherapie durch DNA-Shuffling Familie. Darüber hinaus bieten wir allgemeine Richtlinien und repräsentative Beispiele für die Auswahl und Analyse der einzelnen chimären Kapside mit verbesserten Eigenschaften auf Ziel-Zellen in Kultur oder in der Maus.

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-assoziierte Virus (AAV) Vektoren für die Gentherapie über DNA-Familie Shuffling

In den letzten 15 Jahren haben vom caninen Adenovirus Typ 2 (CAV2) abgeleitete Vektoren ihre Wirksamkeit bei der Übertragung von Zellen in vitro und in vivo bewiesen und werden häufig für Impfungen und Gentherapien eingesetzt. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Konstruktion, Herstellung und Reinigung von CAV2-Vektoren, wodurch virale Suspensionen mit hohem Titer entstehen.

Produktion und Aufreinigung von nicht-replikativen Vektoren des caninen Adenovirus Typ 2

Hier, um einen Proof-of-Prinzip zweiwertigen Adenovirus Typ 5 (Ad5) Vektor zu erzeugen präsentieren wir ein Protokoll Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 6 durch Verwendung des Antigen Capsid-Incorporation Strategie. Dieser Vektor wurde gezeigt qualitative Fitness aufweisen, um die Fähigkeit Ad5-positiven Seren in vitro und die Antigenität als auch die Immunogenität für die zugesetzten Antigene zu entkommen.

Unter Verwendung der Antigen Capsid-Incorporation Strategie für die Förderung der Adenovirus-Serotyp 5-Vectored Vaccine Approaches

Es wird ein Protokoll zur Erzeugung von adenoviralen Vektoren mit hoher Kapazität vorgestellt, bei denen alle viralen kodierenden Sequenzen fehlen. Die Klonierung von Transgenen, die im Vektorgenom enthalten sind, basiert auf Homing-Endonukleasen. Die Virusamplifikation in Produzentenzellen, die als adhärente Zellen und in Suspension gezüchtet werden, beruht auf einem Helfervirus, das virale Gene in trans bereitstellt.

Klonierung und großtechnische Produktion von High-Capacity Adenovirusvektoren Auf der Grundlage des humanen Adenovirus Typ 5

Hier beschreiben wir eine effiziente und reproduzierbare Strategie zu produzieren, Titer und Qualitätskontrolle Chargen von Adeno-assoziierten Virus-Vektoren. Es ermöglicht dem Benutzer, eine Vektor-Vorbereitung mit hoher Titer zu erhalten (≥1 x 1013 Vektor Genome/mL) und eine hohe Reinheit, in Vitro oder in Vivo einsatzbereit.

Produktion, Reinigung und Qualitätskontrolle für Adeno-assoziierten Virus-basierte Vektoren

Hier stellen wir ein Protokoll für die Adenovirus-Produktion mit dem pAdEasy-System vor. Die Technologie umfasst die Rekombination der Plasmide pAdTrack und pAdEasy-1, die Adenovirus-Verpackung und -Verstärkung, die Reinigung der adenoviralen Partikel aus Zelllysat und Kulturmedium, die virale Titration und die funktionelle Prüfung des Adenovirus.

Eine effiziente Methode für die Adenovirus-Produktion

Generierung von AAV-Peptid-Display-Bibliotheken und anschließende Validierung durch Barcoding von Kandidaten mit neuartigen Eigenschaften für die Erstellung von AAVs der nächsten Generation.

Isolierung von Gentherapievektoren der nächsten Generation durch Engineering, Barcoding und Screening von Kapsidvarianten des Adeno-assoziierten Virus (AAV)

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung und Reinigung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren unter Verwendung einer optimierten Heparin-basierten Affinitätschromatographie-Methode. Es stellt einen einfachen, skalierbaren und kostengünstigen Ansatz dar, der die Notwendigkeit einer Ultrazentrifugation eliminiert. Die daraus resultierenden Vektoren weisen eine hohe Reinheit und biologische Aktivität auf, was ihren Wert in präklinischen Studien unter Beweis stellt.

Isolierung von Adeno-assoziierten viralen Vektoren durch ein einstufiges und halbautomatisches Heparin-Affinitätschromatographie-Protokoll

Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine Methode zur Herstellung und Reinigung von mesenchymalen Stammzellen (MSC)-abgeleiteten extrazellulären Vesikelbiomimetika für die Gentherapie einzuführen. Das Nanovesikel ist mit MSC-abgeleiteten Lipid-Doppelschichten eingeschlossen und kapselt rekombinante AAVs, die das relevante Gen im Lumen tragen. Dieses Nanovesikel bietet einen verbesserten Vektor für die Genlieferung in vivo .

Entwicklung mesenchymaler Stammzellmembran-umhüllte Nanovesikel zur verbesserten Genlieferung

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Unterscheidung myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark der Maus. Isolierung von Maus Schienbein und Oberschenkelknochen, und die Verarbeitung von Knochenmark nachgewiesen. Bilder zeigen Zellmorphologie vor und nach der Differenzierung und Figurengruppen Zellphänotyp und IL-12 Produktion nach der Reifung mit CpG gezeigt.

Kultur myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark Vorstufen

Erfahren Sie die chemische Modifikation von Adenovirus-Kapsiden für Gentherapie und onkolytische Anwendungen. Diese Methode ermöglicht präzise Veränderungen über 90 % der Kapsid-Monomere für therapeutische Vektoren.

Genetischen und chemischen Kapsid Modifikationen der Gentransfer Adenovirus-basierte Vektoren kombiniert für Abschirmung und Targeting (Video) | JoVE Journal

Genetischen und chemischen Kapsid Modifikationen der Gentransfer Adenovirus-basierte Vektoren kombiniert für Abschirmung und Targeting

Weitere Videos entdecken