Name: Mechanismen, die Hormonausschüttung der Darm mit der isolierten durchblutet Ratte Dünndarm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Erfahren Sie die Untersuchung von Darmhormonsekretion und Nährstoffabsorption mit dem isoliert perfundierten Ratten-Dünndarm. Diese physiologische Methode ermöglicht detaillierte Studien in situ.

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Dieses wurde unterstützt durch einen uneingeschränkten Grant, Prof. Jens Juul Holst von Novo Nordisk Center für metabolische Grundlagenforschung (Novo Nordisk Stiftung, Dänemark), eine separate Zuschuss von Novo Nordisk Stiftung dafür Nagetier Perfusion Studien (keine zu gewähren. NNF15OC0016574), ist ein Stipendium für Prof. Holst vom European Research Council (Grant no.695069) und Europäische Union siebten Rahmenprogramms für Forschung, TechnologicalDevelopment und Demonstration (Grant Nr. 266408) sowie ein Post-Doc Rune E. Kuhre der Lundbeck-Stiftung (R264-2017-3492) gewähren. Wir danken Jenna E. Hunt und Carolyn F. Deacon für sorgfältige Korrekturlesen.

Alle Studien wurden mit freundlicher Genehmigung von der dänischen Tier Experimente Inspectorate (2013-15-2934-00833) und der lokalen Ethikkommission gemäß den Richtlinien des dänischen Rechtsvorschriften über Tierversuche (1987) und den nationalen Institute der Gesundheit (Publikation Nr. 85-23).
(1) Versuchstiere
<ol><li>Erhalten männliche Wistar-Ratten (250 g) und Haus 2 pro Käfig, mit ad libitum Zugang zu standard Chow und Wasser, und halten Sie in einem 12:12 h hell-dunkel-Zyklus. Unsere Tiere-Einrichtungen verwendet nicht behandeltem Wasser und Alrtromin Nagetier Chow (1319 FORTI, Brogaarden, Lynge, Dänemark). Hinweis: Lassen Sie mindestens eine Woche Eingewöhnungszeit Tiere.</li>
</ol>2. präoperative Vorbereitungen
<ol><li>Perfusion Puffer zu machen: Krebs-Ringer-Bicarbonat-Puffer ergänzt mit 0,1 % BSA (Teil V), 5 % Dextran t-70, 3,5 Mmol/L Glucose und 5 Mmol/L Pyruvat, Fumarat und Glutamat (falls erforderlich); pH 7,4.</li>
	<li>Bereiten Sie eine ausreichende Menge an Perfusion Puffer, indem durch eine geeignete Größe der Filter filtern und passen Sie an, indem Sie tropfenweise Zugabe von 5 M HCl pH und ~7.5.</li>
	<li>3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX) (bei Bedarf fügen Sie hinzu) direkt in den Puffer auf den Tag der Studie, eine Endkonzentration von 10 µM. Hinweis: IBMX ist ein Phosphodiesterase-Hemmer, der erhöht [cAMP]ich und stellt damit die Empfindlichkeit und die Reaktionsfähigkeit des Darms in Bezug auf die Sekretion von Hormonen auf einen sekretorischen Reiz.</li>
	<li>Bereiten Sie Test Lösung(en). Vaskuläre Reize auf eine 20-fach höhere Konzentration als die gewünschte Endkonzentration im gefilterten und pH-Wert eingestellt Perfusion Puffer vorzubereiten. Luminalen Test Reize in isotonische Kochsalzlösung in die Endkonzentration vorzubereiten.</li>
	<li>Nicht gut lösliche Verbindungen in 100 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO) auflösen und verdünnen Sie weitere Perfusion Puffer oder isotonische Kochsalzlösung. Halten Sie für vaskuläre Reize die letztendliche DMSO-Konzentration von 1 % oder darunter, als Konzentrationen oben das schädigen den Darm und führen zu unspezifischen Darm Hormonausschüttung. PH-Wert zu messen und zu ~7.5 bei Bedarf anpassen.</li>
</ol>3. Bedienung und Perfusion
Hinweis: Eine Abbildung eines Perfusion Setup ist in Abbildung 1zur Verfügung gestellt.
<ol><li>Die Ratten zu betäuben, durch Verwendung einer Narkose-Therapie, die chirurgische Anästhesie und Analgesie für 30-40 min. von Hypnorm/Midazolam aufrechterhalten können (0,3 ml/100 g Körpergewicht pro ml: Hypnorm: 0,08 mg Fentanyl, 2,5 mg Fluanisone, 0,45 mg Methyl-Parahydroxybenzoate, 0,05 mg Propyl-Parahydroxybenzoate, Midazolam: 1,25 mg, Matrix Pharmaceuticals, Hellerup, Dänemark)</li>
	<li>Überprüfen Sie aus Mangel an Reflexe (Zehe Prise), legen Sie die Ratte auf dem beheizten Operationstisch und führen Sie einen Einschnitt der Haut, den Darm verfügbar zu machen.</li>
	<li>
Aussetzen der terminal Teil des Dickdarms durch Verschieben des Dünndarms beiseite so weit wie möglich. Binden Sie Gefäßsystem auf den Dickdarm zu versorgen und Verbrauchsteuern Sie es allmählich aus dem terminal Teil des Dickdarms, Richtung Dünndarm.
	<ol>
<li>Wenn nur ein bestimmter Teil des Dünndarms Perfusion (obere Hälfte) entfällt, Verbrauchsteuern Sie nicht erforderlichen Segmente nach dem Binden von Gefäßsystem liefert. Zur Minimierung von Gewebeschäden im Darm mit isotonischer Kochsalzlösung befeuchten und Tupfer, um Bindegewebe zu entfernen verwenden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie ein Kunststoffrohr (Länge: ~ 15 cm, Außendurchmesser: ~0.4 cm) in das Darmlumen (im proximalen Teil) und Krawatte Nähte es richtig verwenden. Spülen Sie sorgfältig mit isotonische Kochsalzlösung (Raumtemperatur), das Lumen der Speisebrei zu leeren.</li>
	<li>Durchspülen der Lumen mit isotonischer Kochsalzlösung bei einem Durchfluss von 0,25 mL/min, mit einer 10 mL Spritze mit einer Spritzenpumpe verbunden.</li>
	<li>Bewegen Sie Darm beiseite zu, so dass die oberen mesenterialen Arterie zugänglich ist und entfernen Sie Bindegewebe und Fett Gewebe um die Arterie offen zu legen.</li>
	<li>Legen Sie zwei Fäden unter die mesenterialen Arterie mit feinen Spitze Zange; Das Nahtmaterial gehört zum Anheben der Arterie zu kontrollieren, die Blutung nach die Arterie unterbrochen wurde und das andere ist für die Sicherung des Katheters, der in der Arterie platziert werden soll. Vorsicht nicht auf die Arterie zu perforieren.</li>
	<li>Legen Sie zwei Fäden unter die Pfortader zur Sicherung des Metall Katheters, der in die Vene für die Sammlung des Abwassers Perfusion platziert werden soll.</li>
	<li>Sicherzustellen Sie vor dem Schneiden des Loch in der mesenterialen Arterie, dass der Katheter, der in die Arterie zu eingefügten geht mit Perfusion Puffer Luft Lungenembolie verhindern gefüllt ist.</li>
	<li>Ein kleines Loch in die mesenterialen Arterie mit einer chirurgischen Schere schneiden und Einfügen den Kunststoff Katheter sofort nach.</li>
	<li>Unmittelbar nach der Katheter gesichert ist, initiieren Durchblutung des Darms durch Starten der Pumpe Walze (Durchfluss = 7,5 mL/min).</li>
	<li>Bestätigen Sie, dass die Blutgefäße im Darm innerhalb von wenigen Sekunden erbleichen, und die Pfortader blass wird.</li>
	<li>Unmittelbar nach angemessene Perfusion schneiden Sie ein Loch in die Pfortader hergestellt wurde, legen Sie die Metall Katheter und sichern Sie es mit der Naht. Hinweis: Der Katheter kann schwer zu Ort, sondern hob die Vene durch vorsichtig ziehen die meisten proximale Naht hilft.</li>
	<li>Sobald der Katheter vorhanden sind und Perfusion Ausgabe zufriedenstellend ist, töten Sie die Ratte durch Perforation der Membran, ohne dabei aus dem Katheter rip.</li>
	<li>Sammeln Sie Perfusion Ausgang für 1 min und Messen Sie das Volumen. Starten Sie die Perfusion Druck Erwerb/Aufnahmen durch Klick Ausführen Experiment in der Druck-Aufnahme-Programm.</li>
	<li>Decken Sie den Darm mit angefeuchteten Tuch, es Austrocknen verhindert wird während des Experiments.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass das distale Ende des Darms nicht blockiert wird, so dass der luminalen Abwasser beendet werden kann, sonst wird der Darm aufquellen, Ödem entwickeln, Perfusionsdruck erhöht und Perfusion Ausgabe sinkt.</li>
	<li>Lassen Sie die Vorbereitung für etwa 30 min vor Beginn des Experiments. Hinweis: Die sekretorischen Ausgänge der Darm Hormone sind für die ersten 15 min der Perfusion, sehr unsicher, so dass dieser Gleichgewichtherstellung Schritt erforderlich ist, um eine stabile Basislinie zu erhalten.</li>
</ol>4. experiment
<ol><li>Starten Sie nach circa 30 min der Perfusion das Experiment durch das Sammeln der ersten Grundlinie Probe Fraktionssammler mit. Proben zu sammeln, um das gewünschte Zeitintervall (z.B. alle min 6,5-7,5 mL ist in der Regel gesammelt) und legen Sie sie auf dem Eis innerhalb von wenigen Minuten.</li>
	<li>
Überprüfen Sie regelmäßig die Blase Falle und wenn geleert, füllen Sie es mit Perfusion Puffer.
	<ol>
<li>Sammeln Sie den Puffer durch das Dreiwege Hahn-Ventil sofort, bevor er die Orgel tritt und von der Katheter in der Pfortader (nachdem es durch das Organ durchblutet worden ist) um zu bestätigen, dass die Orgel metabolisch aktiv ist. Sammeln Sie Proben am Anfang und Ende des Experiments Lebensfähigkeit während des Experiments zu beurteilen.</li>
		<li>Messen Sie Proben schnell, mit einem automatisierten Blut-Gas-Analysator, wie die meisten Kunststoff enthält/Spritzen nicht vollkommen luftdicht, geben Anlass zum Austausch mit der Umgebungsluft.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stimulieren Sie nach 10-15 min der Grundlinie Kollektion die ersten Prüfsubstanz. Intra-arterielle Stimulationen mit einer Spritzenpumpe durch eine drei-Wege-Hahn zu verwalten (Flow = 0,350 mL/min).</li>
	<li>Luminalen Stimulationen durch eine anfängliche Bolus-Injektion (2,5 mL/min über die ersten 5 min) durchführen, um die isotonische Kochsalzlösung zu ersetzen, die bereits in das Lumen, gefolgt von Verwaltung der Testlösung einen geringeren Durchsatz (0,5 mL/min).</li>
	<li>Um sicherzustellen, dass das Lumen der Prüfsubstanz schnell geleert wird, sobald der luminalen Stimulationsdauer vorbei ist, spülen Sie im Darmlumen mit isotonischer Kochsalzlösung durch Anwendung derselben Flussraten wie oben beschrieben.</li>
	<li>Grundlinie Proben für 15-30 min zu sammeln, bevor der nächste Testsubstanz verabreicht wird. Je nach Protokoll können 2-3 Test Reize in der Regel pro Experiment einbezogen werden. Wenn der experimentellen Protokoll Aktivierung/Hemmung von einem bestimmten molekularen Standort gleichzeitig mit Verabreichung von bestimmten Sekretagog beinhaltet, immer vorab mit dem Aktivator/Inhibitor stimulieren 10-15 min vor der Verabreichung von Sekretagogum zu sicherstellen Sie, dass die molekulare Website ganz am Anfang der Sekretagog Infusion gehemmt wird.</li>
	<li>Am Ende des Protokolls verwalten Sie (5-10 min) eine geeignete Positivkontrolle zum Testen für die Reaktionsfähigkeit der Zubereitung und 10-15 min Grundlinie Proben nach der Stimulationsdauer. Hinweis: Mehrere als positive Kontrolle, z. B. Stoffe können Test, Impulse für die zunehmende [cAMP]ich (z. B. Foskolin oder IBMX), [Ca2 +]ich (z. B. Bombesin oder Neuromedin C), depolarisierende Agenten (z.B., 30-50 mM KCl) oder mehr physiologisch relevanten Reize wie Makronährstoffe: Glukose, Peptonen, Aminosäuren. Allerdings hängt die Wahl der positiven Kontrolle über die experimentellen Ergebnisse. Glukose ist zum Beispiel eine schlechte Cholecystokinin (CCK) Sekretagog Bombesin keine robuste Sekretagog für Glucose-Dependent Insulinotropic Peptid (GIP) Sekretion30.</li>
	<li>Nach dem Ende des Experiments Verbrauchsteuern Sie perfundierten Darm, wiegen Sie und Messen Sie die Länge. Legen Sie es in Paraformaldehyd und speichern Sie (4 ° c) für später histochemische Potenzialanalyse Integrität/Gewebeschäden, zum Beispiel durch H & E Färbung.</li>
</ol>(5) biochemische Messungen
<ol><li>Konzentrationen von sezernierten Peptiden im venösen Abwasser durch Einsatz eines Inhouse oder im Handel erhältlichen Radioimmunoassays (RIA) zu quantifizieren oder ELISA-Assays. Quantifizieren Sie für Studien, die untersuchen, intestinale Resorption das Molekül des Interesses, wie z.B., Glukose oder Aminosäuren, in den venösen Abfluss. Hinweis: Die Perfusat ist in der Regel eine gute basale Puffer für die meisten Analysen, einschließlich Assays, die stützt sich auf enzymatischer Reaktionen (z. B. Quantifizierung von Glukose durch die Glucoseoxidase-Methode).</li>
</ol>(6) Datenanalyse
<ol><li>Darstellung von Daten auf unterschiedliche Weise, zum Beispiel als Konzentrationszeit Diagramm zeigt die tatsächliche sekretorische Ausgabe (Flow x Konzentration) und als Spalte Plot Darstellung der sekretorischen Gesamtleistung während der Basislinie und Antwort (in der Regel 10-15 Mal Punkte).</li>
	<li>Zeichnen Sie die tatsächliche gemessene Konzentration der jeweiligen Hormone als Konzentrationseinheiten. (Pmol/L) Hinweis: Es ist besser, stattdessen die Daten als Ausgang (Fmol/min) auszudrücken, denn mit diesem Modell, im Gegensatz zur in-vivo-Studien, die erhaltenen Werte der tatsächlichen sekretorischen Leistung (wegen der ständigen Sammlung von Perfusion Abwasser) sind.</li>
	<li>Abhängig von der Anzahl der Gruppen statistisch analysiert werden Verwendung zweiseitigen gepaart t-Test (zwei Gruppen) oder einfache ANOVA für wiederholte Messungen (mehr als zwei Gruppen) gefolgt von einer entsprechenden Post-hoc-Test für multiple Vergleiche.</li>
</ol>

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<li>Bak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+sensitivity+of+commercially+available+assays+for+glucagon-like+peptide-1+%28GLP-1%29%3A+implications+for+GLP-1+measurements+in+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2C+Obesity+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Specificity and sensitivity of commercially available assays for glucagon-like peptide-1 (GLP-1): implications for GLP-1 measurements in clinical studies.</a> Diabetes, Obesity & Metabolism. 16, 1155-1164 (2014).</li>
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</ol>

Die Autoren dieser Arbeit erklären keine potenzielle Interessenkonflikte relevant zu diesem Artikel.

Der Dünndarm isoliert perfundierten Ratte ist eine leistungsfähige Recherche-Tool, mit dem die Dynamik und die molekularen Mechanismen, die Darm Hormonausschüttung im Detail untersucht werden kann. Der wichtigste Schritt für die erfolgreiche Produktion von Daten mit diesem Modell ist die chirurgische Operation. Handhabung des Darms wird unweigerlich dazu führen, dass einige Schäden an den Darm und sollte daher gehalten werden auf ein absolutes minimum. Noch wichtiger ist, ist die Geschwindigkeit der Betrieb Schlüssel, in...

Der Darm ist das größte endokrine Organ des Körpers, Herstellung von mehr als 15 verschiedene Peptidhormone, die Nährstoffaufnahme und Nährstoff Disposition, intestinale Wachstum zu regulieren und zu modulieren, Appetit1. Darm Hormone daher in vielen grundlegenden physiologischen Prozessen beteiligt sind, und diese Muster von Sekret und die molekularen Details, die Sekretion der jeweiligen Hormone steuern zu verstehen ist es wichtig für unsere grundlegende physiologische Verständnis und für Translationale Aspekte der Darm Hormon Aktionen; aber wie kann man die molekulare Mechanismen, Fernerkundungen Darm Hormonsekretion studieren? In der Regel Hormonsekretion kann in intakter Organismen (Mensch oder Versuchstiere) studiert werden, aus isolierten Darm Vorbereitungen oder Darm Hormon-sezernierenden primären Zellkulturen oder verewigt Zelle Kulturen2,3, 4 , 5 , 6. unser bevorzugte Modell ist der isoliert perfundierten Ratte Dünndarm, die ein physiologisch relevanten Modell, dass ermöglicht die Sekretion von Hormonen Darm, im Detail mit optimalen zeitlichen Auflösung (Sekretion Preise, mit jeder Zeit ermittelt werden untersucht werden Base auf die Sekunde), und die Ergebnisse sind wahrscheinlich auf eine in-vivo Situation7übertragbar. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll darüber, wie dieses Verfahren durchführen, aber zuerst besprechen wir andere Methoden zur Untersuchung der Darm Hormonsekretion, einschließlich die vor- und Nachteile dieser Modelle im Vergleich zu den Dünndarm isoliert perfundierten Ratte.
Will man feststellen, ob eine bestimmte Verbindung die Sekretion bestimmter Darm Hormone reguliert, sind Studien an Menschen das ultimative Ziel. Somit ist eine Verbindung zeigt große Wirkung auf die Sekretion von einem oder mehreren Darm Hormone bei Nagetieren (in Vivo oder Verbandwechsel) oder vom Hormon sezernierenden Zellen (Zell-Linien oder Primärzellen), dieser Effekt nur relevant für Medizin und Physiologie des Menschen wenn es bestätigt werden kann beim Menschen. Allerdings gibt es klare Grenzen für die Art der Studien, die beim Menschen durchgeführt werden kann, und in vivo Studien an Versuchstieren sind daher oft die zweitbeste Lösung für solche Studien. Mäuse und Ratten sind die am häufigsten verwendeten Versuchstiere vermutlich aufgrund ihrer praktischen Größe, low-cost und die Möglichkeit, die Gene, die Verdächtigen in die spezifischen Studienfragen genetisch zu verändern (z. B. aus einem bestimmten Transporter klopfen oder Rezeptor). In der Regel in-vivo Modelle davon profitieren, physiologisch intakt, sondern haben auch mehrere Einschränkungen. Vor allem die geringe Größe der Nagetiere, insbesondere Mäuse, ist ein limitierender Faktor, da die meisten Tests für Darm Hormon Quantifizierung mindestens 20 µL erfordern der Plasma (und oft noch viel mehr), was bedeutet, dass mindestens 100 µL Blut hat, ein Duplikat zurückgenommen Quantifizierung. Daher ist es nur zu wenigen Grundlinie Proben entspricht und ein oder zwei Post-Stimulation Proben (die gesamten Blutvolumen in einer Maus 20 g ist ~1.4 mL) möglich. Infolgedessen potenzielle sekretorischen Reaktionen (z.B., schnell oder spät auftretenden Reaktionen) kann daher verpasst.
In der Perfusion Modell, dieses Problem zu umgehen, als große Stichprobe Bände stammen (Durchflussmenge: 7,5 mL/min) und die Sammlung Intervalle eingestellt werden, um sicherzustellen, dass die schnellen und kurze anhaltende Reaktionen nicht übersehen werden (wir Proben sammeln alle min)7 . Ein weiteres Problem mit in Vivo Studien an Nagern ist, dass die meisten Darm Hormone noch mehr schnell beseitigt oder verstoffwechselt als Menschen8,9,10, die die spätere biochemische Analyse erschweren kann. Zum Beispiel zeigten wir, dass die GLP-1 verstoffwechselt wird, bei Mäusen sogar schneller als beim Menschen (wo ist T1/2 1 – 2 min.11) und, noch wichtiger, die die Spaltung von GLP-1 bei Mäusen beinhaltet neben der N-terminalen Spaltung durch Dipeptidyl-Peptidase-4 (DPP4) (das ist das große GLP-1 erniedrigender Enzym beim Menschen), weitere Spaltung durch das Enzym neutrale Endopeptidase 24,11-12. Infolgedessen aktuellen kommerziellen Assays für die Quantifizierung von GLP-1 basieren entweder auf der intakten Isoform von GLP-1 (7-36amide) oder der DPP-4 gespalten Isoform (9-39amide) gewaltig unterschätzen GLP-1-Sekretion bei Mäusen und irreführenden Ergebnissen führen 12. im Dünndarm isoliert perfundierten Ratte ist die meisten des Stoffwechsels der freigesetzten Hormone beseitigt oder deutlich reduziert, da Plasma-vermittelten Abbau wird vermieden, und Leber/Niere/Lunge Extraktion/Abbau verhindert wird weil ( Perfusat wird gesammelt, als es den Darm verlässt).
Natürlich wichtige Erkenntnis erzeugt werden kann, durch den Einsatz von genetisch veränderten Tieren, z. B., Natrium-Glucose-Transporter-1 Knockout Mäuse13, aber erfordert eine detaillierte Bewertung der molekularen Sensoren Sekretion oft beteiligt Berücksichtigung mehrerer molekulare Standorte reichen von molekularen Transporter auf Ionenkanäle und von verschiedenen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an intrazelluläre Proteine. Zum Beispiel gezielte wir die Aktivität von neun verschiedenen molekularen Webseiten, wenn die molekulare Sensoren verantwortlich für Glukose stimuliert GLP-1-Sekretion7entwirren. Eine ähnliche Untersuchung wäre nicht möglich, die in-vivo wie einige der Verbindungen verwendet unspezifische oder schädlichen/letale Wirkungen. Zum Beispiel konnte bei der Verwendung von perfundierten Darms es die Rolle der intrazelluläre Glukosestoffwechsel für die Sekretion von GLP-1 und Neurotensin bewertet Vaskulogenese ATP mit 2-4-Dinitrophenol7,14 , sowie die Rolle der Voltage-gated Kalziumkanäle für Gallensäure stimuliert GLP-1, NT und PYY Sekretion3. In der Tat kann die hochgiftigen Natrium-Kanal Blocker Tetrodotoxin erfolgreich in der Perfusion Studien angewendet werden. Schließlich kann in der Perfusion Modell es direkt beurteilt werden wo im Darm eine bestimmte Verbindung Sekretion eines bestimmten Hormons stimuliert wie der Prüfer einfach wählen und die gewünschte Region zu durchspülen vorbereiten kann, und gleichzeitig untersucht werden können ob ein Reiz verursacht Sekretion durch Aktivierung der molekularen Sensoren luminalen oder vaskulären seitens des Darms3,15,16.
Die sekretorischen Mechanismen, die zugrunde liegende Darm Hormonausschüttung auch untersucht werden kann verwenden Stück Darm Gewebe (einschließlich menschliches Gewebe), intestinale Primärkulturen (in der Regel von Mäusen), verewigt Hormon sezernierenden Zelllinien (von Maus oder menschlichen Ursprungs), durch Darm Gewebe in h-Kammern oder von Organellen (beide in den meisten Fällen von Mäusen)2,3,4,5,6,17,18montiert. Im Vergleich zu Darm Perfusionen, Studien zur menschlichen Darm Stücke, primären Zellkulturen und Zelllinien sind technisch leichter durchzuführen und sind ein schneller und kostengünstiger Weg, Daten zu generieren, aber natürlich erfordert das Studium der Darm Stücke Zugang zu frischem menschlichen Darm Proben. In diesen Modellen ist jedoch die normale Zelle Polarisation des Darms von Natur aus verloren, was bedeutet, dass diese Modelle können nicht verwendet werden, um normale Aktivierung des molekularen Sensoren zu bewerten, und Absorption Prozesse auch können nicht untersucht werden. Darüber hinaus solche Studien beschäftigen in der Regel statische Inkubationen (für bis zu mehreren h) die ist höchst physiologisch und hat nichts mit den Zellen normale sekretorischen Dynamik, zu tun, weil die sekretierte Produkt nicht entfernt wird und somit auch Feedback beeinflussen kann die Ausschüttung von Hormonen. Im Gegensatz dazu werden in perfundierten Darm abgesondert und absorbierte Moleküle effizient durch die Schleimhaut Mikrozirkulation entfernt sind in-vivo, um sicherzustellen, dass transmukosale Gradienten gepflegt werden, so dass in einem normalen Tempo Resorption und Sekretion auftreten können. Darüber hinaus können Zellkulturen entdifferenzierten haben aus ihren nativen Enteroendocrine Zellen-Ursprung, was bedeutet, dass sie nicht mehr Vertreter der einheimischen Zellen inhaltlich Peptid und Ausdruck der molekularen Sensoren sind, obwohl sie möglicherweise noch sondern Sie ab, das Hormon in Frage. Dies ist beispielsweise der Fall für GLP-1 insulinproduzierenden Zellen Linien19.
Es ist daher der Meinung, dass die primären Zellkulturen oder Zelle Linie Studien sind am besten geeignet zu screening-Zwecken und für die Durchführung von Arten Experimente, die nicht durchgeführten in-Vivo oder in der isoliert perfundierten Darm. Zum Beispiel ist eine wahre Stärke des primären Zellkulturen und Linie Zellkulturen, dass intrazelluläres sekundäre Botenstoffe (z.B. Ca2 +, cAMP, NAD(P)H) kann in Echtzeit beobachtet werden, und elektrische Signalisierung des Hormons sezernierenden Zellen kann 20,21,22untersucht. Darüber hinaus kann SiRNA Zuschlag erfolgen, das ist besonders nützlich, wenn spezifische Inhibitoren nicht verfügbar,20,21,22,23,24 sind. Darm-Gewebe von Mäusen in h-Kammern montiert hat zuletzt für das Studium der molekularen Mechanismen, die Gallensäure stimulierten GLP-1-Sekretion, während der Darm Organellen (von Mäusen) und menschlichen Darm Stücke werden auch für das Studium der molekularen Details der Darm Hormon Sekretion17,25. Während die bisherigen Leistungen davon2 polarisiert beinhalten alle diese Modelle statische Inkubationen. Studien zur menschlichen Darm Stücke, profitieren jedoch von mit menschlichen, sondern als Nagetier, Gewebe, was seit Artunterschied in Gewebe Ausdruck 7TM Rezeptoren wichtig ist und molekulare Transporter können verschiedene molekulare Erkennung Wege zwischen Spezies. In der Tat, die meisten Daten in diesem Bereich durch Studien über Schweine, Mäuse oder Ratten erzeugt worden ist, und es bleibt schwer, ob diese Ergebnisse auf den Menschen übertragen werden können. Es ist doch beruhigend, dass die molekularen Fernerkundungen Mechanismen, die Glukose-stimulierten GLP-1-Sekretion zugrunde liegen scheinen ähnlich zwischen Maus, Ratte, Mann, und transkriptomischen und Peptidomic profiling von Maus und Mensch L-Zellen zeigten starke globale Ähnlichkeiten zwischen den beiden Arten7,18,26,27.
Dünndarm isoliert perfundierten Ratte hat allerdings auch einige Einschränkungen, die berücksichtigt werden sollten. Am wichtigsten ist, ist es unmöglich, festzustellen, ob eine gegebene sekretorische Antwort ergibt sich aus direkten Aktivierung durch die Prüfsubstanz der gezielten hormonproduzierenden Zellen oder vielmehr durch einen indirekten Mechanismus verursacht wird. Zum Beispiel KCl sofort GLP-1-Sekretion aus der perfundierten Darm7steigt, aber es ist unbekannt, ob dies eine Folge des direkten Depolarisation der L-Cell ist oder ergibt sich aus Depolarisation von Neuronen in der Nähe der L-Zellen oder Auswirkungen von gleichzeitig veröffentlicht parakrine Stimulatoren/Inhibitoren. Daten aus Studien mit perfundierten Darm, die darauf abzielen, die molekularen Mechanismen, die Sekretion aufzuklären, daher, immer in Zusammenhang mit Daten aus anderen speziellere Modelle erhöhen die Möglichkeit zur Einrichtung legen Kausalität. Zum Beispiel Glukose stimuliert GLP-1-Sekretion von GLP-1 absondert Zelllinie GLUTag28,29 und primäre Maustaste L-Zellen richten sich nach der Aktivität der Glucose-Transporter (SGLT1 und GLUT2). Blockieren diese Transporter im Dünndarm perfundierten Ratte dämpft auch Sekretion20, was bedeutet, dass es wahrscheinlich ist, dass Glukose stimuliert GLP-1-Sekretion weitgehend durch direkten Aktionen der Glucose auf die L-Zelle vermittelt wird. Eine weitere wichtige Einschränkung der isoliert perfundierten Darm ist, dass einige der Lipide schwierig sind, wegen ihrer Hydrophobie zu studieren. Packen Sie obwohl es möglich ist, die Endprodukte der Lipidverdauung (Fettsäuren, Diacyl Glycerols, Lysophosphatidylglycerols, etc.) zu untersuchen und die Vorbereitung der Lipide Intra Einnahme und vielleicht wieder esterify werden kann, diese in Chylomikronen, den Transport von den Chylomikronen aus den Zellen und ihre anschließende Aufnahme durch die Lacteals der Zotten gestört ist, da der Lymphfluss in den isolierten Darm nicht gesichert werden kann. Am ehesten ist daher Lipid Aufnahme gestoppt, sobald die aufgenommene Produkte beginnen, in den Zellen ansammeln. Die in-vitro-Zellsysteme sind wegen ihrer mangelnden Polarisation für Lipid-Studien noch weniger geeignet. Natürlich, diese Einschränkung ist nur relevant für Lipide, die aufgenommen und über die Lacteals transportiert, während diejenigen über den Darm Blutgefäßen absorbiert dürften normalerweise verarbeitet werden.

<table><tbody><tr><td>Chemikalien für Perfusionspuffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Merck</td><td>1.12018.0500</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2 x 2 H2O)</td><td>Merck</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>Dextran 70</td><td>Pharmacosmos</td><td>40014</td><td></td></tr><tr><td>Fumarsäure-Dinatriumsalz (C44H2Na2O4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9642</td><td></td></tr><tr><td>Glukose (C6H12O6)</td><td>Merck</td><td>108342</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Hepatahydrat (MgSO4)</td><td>Merck</td><td>105886</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4)</td><td>Merck</td><td>104873</td><td></td></tr><tr><td>Brenztraubensäure-Natriumsalz (C3H3NaO4)</td><td>Merck</td><td>106619</td><td></td></tr><tr><td>Natrium Bicarbonat (NaHCO3)</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Merck</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>Natrium-L-Glutamat-Monohydrat (C5H8NNaO4 x H2O)</td><td>Merck</td><td>106445</td><td></td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company<</td><td> strong>Katalognummer<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>Perfusion equitment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Universelles Perfusionssystem</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td></td><td></td>732316</tr><tr><td>GRUNDGERÄT UNIPER UP-100, TYP 834</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rollenpumpe, mit vier Kanälen</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td>730100</td><td></td></tr><tr><td>Windkessel</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td></td><td></td>732068</tr><tr><td>thermostatischer Zirkulator, Badvolumen 3L, 230V/50Hz</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td></td><td></td>730125</tr><tr><td>OP-Tisch, beheizt auf Stativständer, Typ 873</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td></td><td></td>733776</tr><tr><td>Kanüle mit Behälter, AD = 2,0 mm, ID = 1,0 mm</td><td>Harvard Bioscience, Inc.</td><td></td><td></td>733313</tr></tbody></table>

mechanismen, die hormonausschüttung der darm mit der isolierten durchblutet ratte dünndarm

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

Der Darm ist das größte endokrine Organ des Körpers, Herstellung von mehr als 15 verschiedene Peptidhormone, die Appetit und Nahrungsaufnahme, Verdauung, Nährstoffaufnahme und Verteilung und Ausflüge postprandialen Blutzucker zu regulieren. Verständnis der molekularen Mechanismen, die Hormonausschüttung Darm zu regulieren ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis und Darm Hormon Physiologie zu übersetzen. Traditionell, die Mechanismen Darm Hormonausschüttung werden entweder in vivo (im experimentellen Tieren oder Menschen) studiert oder Zellkulturen oder Zellinien mit Darm Hormon-sezernierenden primäre Schleimhaut. Hier stellen wir eine isoliert perfundierten Ratte Dünndarm als alternative Methode zur Untersuchung der Darm Hormonausschüttung. Die Vorzüge dieses Modells sind, dass sie stützt sich auf den intakten Darm, was bedeutet, dass es die meisten physiologisch wichtigen Parameter für die Sekretion in in-vivo Studien, einschließlich Schleimhaut Polarisation, parakrine Beziehungen und Transportwege rekapituliert Perfusion/Reiz ausgesetzt. Darüber hinaus und im Gegensatz zu in vivo Studien ermöglicht der isoliert perfundierten Ratte Dünndarm fast vollständige experimentelle Kontrolle und unmittelbare Bewertung der Sekretion. Im Gegensatz zur in-vitro-Studien ist es möglich, das Ausmaß und die Dynamik der Sekretion und wichtige Fragen, wie welche Reize Sekretion von verschiedenen Darm Hormone verursachen von welcher Seite des Darms (luminalen oder vaskuläre) Sekretion ist zu studieren angeregt, und im Detail molekulare Sensoren zugrunde liegt die sekretorische Antwort zu analysieren. Darüber hinaus ist die Vorbereitung ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung der intestinale Resorption und Details hinsichtlich der Dynamik der intestinale Resorption einschließlich der Verantwortlichen Transporter.

Die Fähigkeit, festzustellen, ob eine gegebene Anregung Sekretion des Hormons Darm von Interesse verursacht stützt sich auf eine stabile Basislinie Sekretion. Außerdem, wenn keine Antwort auf den Reiz zu beobachten ist, eine robuste sekretorische Antwort auf die Positivkontrolle ersichtlich zu ausschließen, dass das Ausbleiben einer Reaktion auf den Test-Reiz keinen allgemeinen Mangel an Reaktionsfähigkeit widerspiegelt. Abbildung 2A und 2 b ...

Hier präsentieren wir eine leistungsstarke und physiologische Modell zur Untersuchung der molekularen Mechanismen Darm Hormonsekretion und intestinale Resorption – isoliert perfundierten Ratte Dünndarm.

Mechanismen, die Hormonausschüttung der Darm mit der isolierten durchblutet Ratte Dünndarm

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

Die Methode, die wir hier entwickelt haben, hat sich als äußerst nützlich in unserer Arbeit erwiesen, versucht, die molekularen Mechanismen der Sekretion von Hormonen aus dem Darm, aber auch Absorption von Nährstoffen, und die Kopplung zwischen den beiden herauszufinden. Der Hauptvorteil dieser hochphysiologischen Technik ist, dass der Darm in situ gelassen wird, während detaillierte Studien erlaubt werden, die in der Regel nur innerhalb von In-Vitro-Modellen durchgeführt werden. Zuerst die Ratte auf einen beheizten Operationstisch legen, einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen bestätigen und eine Haut und peritoneale Exzision machen, um die Bauchhöhle freizulegen.Bewegen Sie den Dünndarm zur Seite, um den Endbereich des Dickdarms freizulegen. Und ligate die versorgung des Dickdarms. Nach und nach extrahieren Sie den Dickdarm, beginnend aus der Endregion, und bewegen Sich in Richtung des Dünndarms, Hydratisieren des Gewebes mit isotonischer Saline, und mit Wattestäbchen, um das Bindegewebe bei Bedarf zu entfernen.Wenn der gesamte Dickdarm entfernt wurde, legen Sie ein 15 Zentimeter großes Stück Kunststoffschläuche in das proximale Ende des kleinen Darmlumens ein und sichern Sie die Schläuche mit Nähten. Verwenden Sie dann eine 10-Milliliter-Spritze und eine Spritzenpumpe, um den Dünndarm mit raumtemperaturisotonischer Saline bei einem Durchfluss von 25 Milliliter pro Minute vorsichtig zu spülen. Wenn das Gewebe von Chyme geleert wurde, passen Sie das Gewebe so an, dass die obere mesenterische Arterie zugänglich ist, und entfernen Sie das Bindegewebe und das Fettgewebe, um die Arterie freizulegen.Verwenden Sie feine Point Forceps, um zwei Nähte unter die mesenterische Arterie und zwei Nähte unter der Portalvene zu platzieren. Füllen Sie einen 22-Spur-Kunststoffkatheter, der an einer Walzpumpe mit Perfusionspuffer befestigt ist, und schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere ein kleines Loch in die mesenterische Arterie, wobei der Katheter sofort in den Schnitt einfügt wird. Legen Sie den Katheter innerhalb von zwei Minuten nach dem Schneiden eines Lochs in die Arterie, sonst wird der Darm wahrscheinlich von ischämischen Schäden leiden.Sobald der Katheter mit einer Naht gesichert ist, starten Sie die Walzpumpe, um die Perfusion mit einem Durchfluss von 7,5 Milliliter pro Minute zu initiieren. Wenn die Blutgefäße in der Darm- und Portalvene blass werden, schneiden Sie ein Loch in die Portalvene. Legen Sie einen Metallkatheter ein und sichern Sie den Metallkatheter mit einer weiteren Naht.Achten Sie beim Einsetzen des Katheters in die Portalvene, da die Vene dünn wandbein ist. Da die Wache nun jedoch durchsetzt ist, ist ein schnelles Einsetzen nicht entscheidend. Nach dem Sammeln der Perfusionsausgabe für eine Minute, messen Sie die Lautstärke und klicken Sie auf Experiment im Druckaufzeichnungsprogramm ausführen, um die Perfusionsdruckerfassungsaufzeichnungen zu initiieren.Dann bedecken Sie den Darm mit einem befeuchteten Laborgewebe, um es vor dem Austrocknen zu bewahren, und bestätigen Sie, dass das distale Ende des Darms nicht blockiert ist, und ein luminal haploid kann verlassen. Um den Teildruck von Sauerstoff und Kohlendioxid zu messen, sammeln Sie den Perfusionspuffer durch ein Drei-Wege-Hahnenventil unmittelbar vor dem Eindringen in das Organ, nach etwa drei Minuten Perfusion, und aus dem katheter in die Portalvene eingeführten Katheter. Legen Sie die Proben auf Eis und verwenden Sie einen automatisierten Blutgasanalysator, um die Proben kurz nach der Entnahme zu messen.Verwenden Sie einen Fraktionskollektor, um die ersten Basisstichproben zu erhalten. Nach 10 bis 15 Minuten Baseline-Sammlung verwenden Sie eine Spritzenpumpe, um das erste intraarterielle Stimulans durch einen Drei-Wege-Stop-Hahn bei einem Durchfluss von 35 Millilitern pro Minute zu verabreichen. Führen Sie luminale Stimulationen durch eine erste Stimulation boas Injektion mit einem 2,5 Milliliter pro Minute Durchflussrate über die ersten fünf Minuten der Stimulation, gefolgt von der Verabreichung der Testlösung bei 5 Milliliter pro Minute Durchflussrate.Sobald eine luminale Stimulationsperiode vorbei ist, spülen Sie das Lumen mit isotonischer Saline mit einem Durchfluss von 2,5 Milliliter pro Minute für fünf Minuten. Dann sammeln Sie Basisproben mit 5 Milliliterpro Minute für 15 bis 30 Minuten, bevor die nächste Testsubstanz verabreicht wird. Am Ende des Experiments eine geeignete, positive Kontrolle, um die Reaktionsfähigkeit der Zubereitung für fünf bis zehn Minuten zu testen, sammeln und zusätzliche 10 bis 15 Minuten Baseline-Proben am Ende der Positivkontrolle Stimulationsperiode.Hier wird ein Beispiel für qualitativ hochwertige Daten gezeigt, die Glucagon-ähnliche Peptid-1 oder GLP-1 zeigen, Sekretion aus einem isolierten perfundierten Ratten-Dünndarm, der in einem Minutentakt gesammelt wird. Unter basalen Bedingungen war die Sekretion stabil, während sowohl vor als auch nach der Verabreichung des Testreizes und der positiven Kontrolle eine robuste sekretorische Reaktion offensichtlich war. Diese GLP-1-Sekretionsdaten, die aus einem isolierten perfundierten Ratten-Dünndarm gewonnen wurden, sind von schlechter Qualität mit einer unbeständigen Sekretion, die bei basalen Bedingungen gemessen wird, die während der Tests in einer Weise nach oben drifteten, die nichts mit den Verabreichungen der Prüfsubstanz oder der Positivkontrolle zu tun zu haben schien.Es ist daher unmöglich festzustellen, ob die erhöhte GLP-1-Sekretion, die am Ende der vaskulären Fructosestimulation beobachtet wurde, eine fructose vermittelte Reaktion war. Bei diesem Versuch, die Katheter richtig zu sichern und die Perfusionsgeräte gründlich zu reinigen, da der Perfusionspuffer ein ausgezeichnetes Medium für das Bakterienwachstum bietet. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie In-Vitro-Studien an hormonsekretierenden Zelllinien primärer Darmzellkulturen durchgeführt werden, um die intrazelluläre Produktion von zyklischem AMP oder intrazellulärem Kalzium direkt zu untersuchen.Also haben wir bereits die Methode jetzt für die Aufklärung einer Reihe von Prozessen hinter der Absorption von Nährstoffen und den Mechanismus der Sekretion der Hormone verwendet und es hat sich als äußerst nützlich erwiesen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Blockern oder Aktivatoren molekularer Standorte extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung eines Labormantels, Handschuhen und einer Schutzbrille, eine Dunstabzugshaube sollte immer während der Durchführung dieses Verfahrens eingenommen werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

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Ex vivo-Darm-Sacs zu beurteilen Durchlässigkeit der Schleimhaut in Modelle von Magen-Darm-Krankheit

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Mechanismen, die Hormonausschüttung der Darm mit der isolierten durchblutet Ratte Dünndarm

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