Name: Eine anpassbare Protokoll für String Montage gRNA Klonen (STAgR) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Lernen Sie STAgR zur effizienten Multiplex-gRNA-Klonierung für CRISPR/Cas9-Anwendungen. Diese Methode ermöglicht die schnelle Erzeugung maßgeschneiderter Expressionsvektoren in einem einzigen Schritt.

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Die Autoren möchten Prof. Dr. Stephan Beck und Prof. Dr. Jovica Ninkovic für ihre Beiträge danken, Hilfe und Unterstützung bei der Entwicklung der STAgR-Methode. Tobias Klötzer, Anna Köferle und Valentin Baumann für die hilfreichen Kommentare. Die Arbeit wurde von der DFG (STR 1385/1-1) unterstützt.

1. Aufbau der STAgR Klonen Strategie
<ol><li>Entscheiden Sie, auf wie viele gRNA Kassetten in einem Expressionsvektor und in welcher Reihenfolge enthalten sein werden. Feststellen, welche Promotoren und gRNA Gerüste für jede der gRNAs verwendet werden soll. Entwerfen Sie die gRNAs, indem mit einem beliebigen Online-Tool (z. B. www.benchling.com).</li>
</ol>2. Gestaltung der STAgR Klonen Primer mit Überhängen
Hinweis: Die Sinne Protospacer Reihenfolge der letzten gRNA und Antisense des ersten gRNA bzw. werden hinzugefügt, die PCR-Primer zur Verstärkung des Vektor-Backbones (Abbildung 1). Die verbleibenden Sequenzen werden aus den Saiten, damit anbringen der Sense und antisense gRNAs in der gewünschten Reihenfolge verstärkt. Die erste Zeichenfolge Stück wird mit einer vorwärts Grundierung, enthält die erste gRNA N20 Sequenz als Überhang und eine rückwärts-Primer mit der zweiten gRNA N20 Sequenz (umgekehrte Ergänzung) als Überhang verstärkt. Die folgenden Stücke sind entsprechend generiert.
<ol><li>Fügen Sie N20 gRNA Sequenzen hinzu, die nach vorne Verstärkung Zündkapseln für STAgR DNA-Zeichenfolge als Überhänge (Tabelle 1). Der forward Primer "Scf-FP" (für eine konventionelle Gerüst) oder "Sam-FP" (für ein MS2 mit Gerüst) Sinn gRNA Sequenzen 5' hinzufügen. FP Zündkapseln Tempern, das Gerüst/MS2 Bestandteil der jeweiligen STAgR Zeichenfolge (Abbildung 1).</li>
	<li>Die rückwärts-Primer-Sequenzen die umgekehrte Ergänzung N20 gRNA Sequenz hinzufügen. Wählen Sie RP Primer je nach spezifischen Promotoren und verwendeten Zeichenfolgen (hU6-RP, mU6-RP, 7sK-RP, H1-RP).</li>
</ol>3. Generation von STAgR Klonen Fragmente
<ol><li>Um die einzelnen Klonen Fragmente für Gibson Assembly zu erstellen, führen Sie PCRs durch die Einrichtung von 10 µL der High Fidelity (HF) Puffer, 1 µL 10 mM dNTPs, 0,25 µL Überhang-Grundierung (100 µM), 10 ng der DNA-Vorlage (String oder Vektor), 0,5 µL HF Polymerase , 1,5 µL Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und H2O zu einem Endvolumen von 50 µL hinzufügen. Hinweis: Verwenden Sie das Plasmid "STAgR_Neo" als Vorlage für den PCR-Backbone, um das gRNA Gerüst, um die letzten gRNA zu integrieren, wenn SAM Scaffold gewählt wird, verwenden Sie "STAgR_SAM". Für ein STAgR Plasmid mit sechs gRNA Kassetten sind beispielsweise sechs PCRs notwendig, fünf mit DNA Stränge als Vorlagen und einer mit dem Vektor-Backbone als Vorlage.</li>
	<li>Inkubieren Sie Reaktionen auf einem Thermocycler mit den folgenden Bedingungen: 1 Zyklus von 98 ° C für 1 min 30 s; 38 Zyklen von 98 ° C für 10 s, 59 ° C (für gRNA Gerüst) / 68 ° C (für SAM Schleife) für 10 s, 72 ° C für 30 s (für Einsätze) / 1 min 30 s (für Vektoren); 1 Zyklus von 72 ° C für 10 Minuten.</li>
	<li>Der PCR-Reaktion entnehmen Sie 5,5 µL, fügen Sie laden Farbstoff hinzu und analysieren Sie die amplifizierten Fragmente auf einem 1 % Agarose-Gel. Last eine entsprechende DNA-Leiter für Dimensionierung (100 bp DNA-Leiter/1 kb DNA-Leiter) und führen Sie das Gel in einen entsprechenden Gel läuft Puffer (z.B. TLE Puffer) bei 120 V für 30 Minuten.</li>
	<li>Während das Gel ausgeführt wird, fügen Sie 5 µL des Puffers zur Verfügung gestellt mit dem Restriktionsenzym und 0,5 µL DpnI (10 Stück), um die verbleibenden 44,5 µL-PCR-Reaktion und 30 min bis 1 h bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Durchführen Sie DNA-Reinigung mit magnetischen Beads.<ol>
<li>1,8 µL magnetische Beads pro 1 µL des PCR-Produktes und Mischen von Pipettieren rauf und runter. 2 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.</li>
		<li>Perlen und DNA-Fragmente von Restflüssigkeit mit einem Magneten zu trennen. Waschen Sie Perlen zweimal mit 70 % Ethanol durch Spülen der Pellets ohne resuspending komplett.</li>
		<li>Entfernen Sie alle Ethanol mit einer Pipette und lassen Sie die Pellet der Luft trocknen.</li>
		<li>Lösen Sie das Pellet in 15 – 20 µL H2O durch Pipettieren rauf und runter und trennen Sie die Perlen aus der Flüssigkeit zu, indem mit Hilfe eines Magneten. Übertragen Sie den klare Überstand auf einen neuen Schlauch. Hinweis: Alternativ können spaltenbasierten Reaktion Aufräum Kits verwendet werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNA-Konzentrationen mit einem Spektralphotometer wie an anderer Stelle29beschrieben zu bestimmen.</li>
</ol>(4) Gibson Assembly Reaktion und bakterielle Transformation
Hinweis: Die folgenden Schritte sind von Gibson Et al. 30.
<ol><li>Bereiten Sie eine hausgemachte Gibson Reaktion mischen oder eine kommerzielle Gibson cloning Kit verwenden.<ol>
<li>Kombinieren Sie 3 mL 1 M Tris (Tris (Hydroxymethyl) Aminomethane)-HCl bei pH 7,5, 300 µL 1 M MgCl, 60 µL 100 mM dCTP (60 µL 100 mM dGTP (Deoxyguanosine Triphosphat), 60 µL 100 mM dATP (Deoxyadenosine Triphosphat), 60 µL 100 mM dTTP (Deoxythymidine Triphosphat) Deoxycytidine Triphosphat), 300 µL 1 m DTT (Dithiothreitol), PEG-8000 (Polyethylenglykol), 300 µL 100 mm NAD (Nicotinamid-Adenin-Dinucleotide) 1,5 g und H2O 6 mL 5 × isothermen Reaktion Puffer erhalten hinzufügen. Hinweis: RegelmÄÑig Puffer kann bei-20 ° C für mindestens 12 Monate gespeichert werden.</li>
		<li>Mischen Sie für den Gibson-Montage-Meister, kombinieren Sie 320 µL 5 X isothermen Reaktion Puffer mit 697 µL H2O und 3 µL 10 U/µL T5 Exonuclease, 20 µL 2 U/µL DNA Polymerase und 160 µL 40 U/µL Taq DNA Ligase. Hinweis: Diese Mischung kann regelmÄÑig und gespeicherte bei-20 ° C für mindestens 12 Monate sein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie 7.5 µL des Montage-master-Mix mit 2,5 µL einfügen und Vektor. Verwenden Sie für 2 X STAgR Reaktion Molaren Vektor zum Verhältnis von 1:1, aber nicht mehr als 0,2 Pmol DNA insgesamt einfügen. Verwenden Sie für mehr als 2 gRNA Expressionskassetten einen Vektor zum Verhältnis von 1:3 einfügen aber überschreiten Sie einen Gesamtbetrag von DNA von 0,5 Pmol nicht. Hinweis: Alle verstärkten gRNA Expressionskassetten sollten äquimolaren Mengen verwendet werden. Gehören Sie ein Plasmid-Steuerelement mit der identischen Menge an Vektor aber keine Einsätze zu steuern für unverdaute Vorlage Vektor (und/oder selbständigen Ligatur).</li>
	<li>Inkubieren Sie Proben bei 50 ° C für 45 bis 60 min. Store Proben auf Eis oder bei-20 ° C für die anschließende Transformation. Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.</li>
	<li>Verwandeln Sie direkt die Hälfte der Mischung in chemisch kompetente Bakterien.<ol>
<li>Tauen Sie chemisch kompetente TOP10 E. Coli -Bakterien auf dem Eis.</li>
		<li>50 µL kompetente Bakterien 5 µL der Gibson-Mischung hinzufügen. Mischen Sie durch Streichen der Boden des Röhrchens vorsichtig. Inkubation für 30 min auf Eis.</li>
		<li>Ein Hitzeschock durchführen, indem man den Schlauch in einem 42 ° C Wasserbad oder einem Heizblock für 45 s.</li>
		<li>Die Rohre wieder auf Eis gelegt. Die Bakterien 250 µL SOC-Medium hinzu und lassen Sie sie bei 37 ° C in einem schütteln Inkubator für 30 – 45 Minuten zu erholen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nach seiner Genesung Platte die transformierten Bakterien auf 1,5 % Lysogeny Brühe (LB) Agarplatten mit Ampicillin (100 µg / mL) und über Nacht bei 37 ° c inkubieren</li>
</ol>5. Auswahl STAgR Klone von bakteriellen Kolonie PCR
<ol><li>Bereiten Sie mindestens zwei Sätze von 200 µL PCR Reaktionsgefäße (zwischen 3 und 24) für jedes Konstrukt, das sind identisch mit der Bezeichnung.</li>
	<li>Füllen Sie einen Satz mit 100 µL LB-Medium mit 100 µg / mL Ampicillin.</li>
	<li>Verwenden Sie eine sterilen Pipettenspitze, Rubbel das biologische Material von einer bakteriellen Kolonie und am unteren Rand 100 µL PCR Reaktion Leerrohr zu verbreiten. Sofort übertragen Sie die Spitze auf das zweite entsprechende Reaktionsgefäß mit LB-Medium.</li>
	<li>Schwenken Sie die Spitze um sanft, damit einige der Bakterien in den LB Medien übertragen und Inkubation bei 37 ° C für die spätere Verwendung.</li>
	<li>Richten Sie ein PCR-master-Mix (10 µL pro Reaktion).<ol>
<li>Kombinieren Sie für 10 Reaktionen 10 µL Taq Puffer, 2 µL 10 mM dNTPs, 0,5 µL des Primers (100 µM), 0.5 µL Taq Polymerase und H2O auf ein Volumen von 100 µL.</li>
		<li>Verwenden Sie die folgenden Primer: StAgR_seq_fwd2: ACTGGATCCGGTACCAAGG, StAgR_seq_rev: TTACGGTTCCTGGCCTTTTG.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die beschrifteten PCR Reaktionsgefäße ohne LB Medien 10 µL des PCR-master-Mix hinzufügen.</li>
	<li>Inkubieren Sie Reaktionen auf einem Thermocycler mit den folgenden Bedingungen: 1 Zyklus von 94 ° C für 5 min, 38 Zyklen von 94 ° C für 30 s, 55 ° C für 30 s, 72 ° C für 2 min; 1 Zyklus von 72 ° C für 10 Minuten. Hinweis: Dehnung Zeit (72 ° C Schritt) sollte mit der Anzahl der gRNA Expressionskassetten erhöht werden. Berechnen Sie theoretische Größe der Einsätze mit Tabelle 2 und verwenden Sie 1 min pro 1 kb bei 72 ° C.</li>
	<li>Fügen Sie laden Farbstoff und analysieren Sie die amplifizierten Fragmente auf einem 1 % Agarosegel. Laden Sie eine entsprechende DNA-Leiter für die Dimensionierung (1kb DNA-Leiter) und führen Sie die in entsprechenden Gel Puffer (z.B.TLE Puffer) bei 120 V für 30 min laufen.</li>
	<li>Berechnen Sie die theoretische Größe der Amplifikate mit Hilfe der Tabelle 2 durch Addition der einzelnen Größen verwendeten Promotoren, gRNA Gerüste und Anzahl der N20 Sequenzen. Identifizieren Sie aus den Ergebnissen der Kolonie PCR die bakterielle Klone basierend auf die richtige Bandgröße und ob sie korrekte Vektoren beherbergen dürften.</li>
	<li>Impfen Sie eine 2,5 mL über Nacht LB-Kultur (mit 100 µg/mL Ampicillin) mit der entsprechenden 100 µL Kultur, früher eingerichtet. Inkubation bei 37 ° C für 12 h.</li>
	<li>Plasmid-DNA mit Hilfe einer kommerziellen Plasmid Mini Kit und des Herstellers Anweisungen31zu extrahieren.</li>
	<li>Sequenz der Plasmide, die unter Verwendung der folgenden Zündkapseln: StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG), StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) und StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG) von Sanger-Sequenzierung.</li>
</ol>

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<li>Xie, K., Minkenberg, B., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boosting+CRISPR%2FCas9+multiplex+editing+capability+with+the+endogenous+tRNA-processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (11), 3570-3575 (2015).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für STAgR ermöglicht die schnelle und einfache Generierung von gRNA Ausdruck Plasmide in verschiedenen Größen. Dieses Protokoll kann für einstufige Generation von gRNA Plasmide mit 2 – 8 gRNA Expressionskassetten (mit oder ohne zwei MS2-RNA Aptameren) in dem Expressionsvektor gRNA STAgR_Neo und die Verwendung von menschlichen U6, Maus U6, menschliche 7sK und menschlichen H1 Promotoren28 verwendet werden ,32,33. Wenn mehr als vier Kassetten gewünscht werden, empfiehlt es sich, mindestens zwei verschiedene Projektträger/Gerüst-Typen verwenden, um Effizienz zu steigern. Andere Vektoren, Promoter und Veranstalter Kombinationen sowie mehr als 8 gRNA Kassetten könnte genauso gut machbar sein; Dies wurde jedoch nicht getestet. Obwohl in unserer Erfahrung nach ist die Methode zuverlässig und reproduzierbar funktioniert, wir wichtige Schritte bestimmt haben und Fehlerbehebung Strategien sollte das erwartete Ergebnis nicht sofort auftreten. Nach unserer Erfahrung einige Schritte sind entscheidend für den Erfolg des Konzepts: Zuallererst ist es wichtig, die richtigen Molaren Verhältnisse der Einsätze mit dem Vektor-Backbone an Gibson Montageschritt (3:1) zu verwenden. Wir haben jedoch festgestellt, dass für einige gRNA Sets ein 1:1 Verhältnis von Einsätzen, Vektor vorteilhaft, auch wenn die gRNA Kassette Anzahl zwei übersteigt. Zweitens sollte der Zeitraum von der Gibson-Montage-Reaktion ausreichend lang sein (mindestens 45 min empfohlen).
STAgR kann mit einer Vielzahl von Modifikationen eingesetzt werden. Ausrichtung auf Sequenzen, gRNA können frei Zahlen und Gerüste, Promotoren und Vektor-Backbones angepasst und kombiniert werden. Jede Kombination kann jedoch leicht unterschiedliche Anforderungen haben. Nach unserer Erfahrung, wenn mittlere oder hohe Zahlen von gRNA Kassetten (> 4) sind erwünscht aber nicht erhalten sofort, in der Regel der schnellste Weg, um dieses Problem zu umgehen, ändern Sie die Reihenfolge der einzelnen gRNA Kassetten im Vektor ist. In ähnlicher Weise kombinieren verschiedene gRNA Promotoren und Gerüste verbessert die Effizienz (und senkt so die erforderliche Anzahl von Kolonie-PCR, die bewertet werden müssen) wenn viele gRNA Kassetten werden geklont. Wir fanden, dass falsche Klone bei der Gibson-Montage in der Regel durch die spontane Verbindung von wiederholten Sequenzen generiert werden. Obwohl dies die Wirksamkeit der Methode reduzieren kann, ergibt sich auch die gleichzeitige Erzeugung von Vektoren mit funktionalen gRNA Teilmengen28.
Generation von multiplexing gRNA Vektoren, enthält mehrere gRNA Expressionskassette wurde mit einer Reihe von verschiedenen Methoden21,22,23,24,25berichtet, 26,27. Während einige gleichzeitige oder sequentielle gRNA Paare22,34Klonen beschäftigen, hängen andere Golden Gate Montage- und mehrere sequenzielle Klonen Schritte25,35. Xie Et Al., wurde ein spezielles Konzept eingesetzt, durch den Einsatz der endogenen tRNA Verarbeitung Zellsystem, mehrere gRNAs aus einer einzigen Stammvater Transkript36zu schneiden. Die Advangetage dieser Methode ist das Erfordernis der einzige Veranstalter; der Nachteil ist die Notwendigkeit der neu synthetisierte DNA-Fragmente für jede gRNA Kombination. Jede gRNA multiplexing-Verfahren hat vor- und Nachteile; STAgR kombiniert Einfachheit mit Effizienz, hohe Anzahl von möglichen gRNA Kassetten mit niedrigen Kosten.
STAgR (und andere multiplexing Systeme) wahrscheinlich werden maßgeblich ermöglicht effiziente (und gleichzeitige) Störung der mehrere Gene in Vivo, im Zebrafisch Gehirne28Pionierarbeit geleistet. Eine weitere zukünftige Anwendung gRNA multiplexing Vektoren ist das Versprechen für die Manipulation von kompletter transkriptionelle Programme im Gegensatz zu der Induktion oder Unterdrückung einzelner Gene. Wahrscheinlich werden diese Ansätze ermöglichen verwandelnde Zellen und Organe am werden in viel höherem Maße als es heute möglich ist.

Zeichenfolge Montage gRNA Klonen (STAgR) ist eine Methode, die ermöglicht effiziente Übernachtung Erzeugung von Expressionsvektoren, mehrere gRNA-Expression, die Kassetten in einem einzigen Klonen Schritt enthält. Das STAgR-Protokoll hängt nicht Fachkompetenz oder Materialien und bietet mehrere Optionen für die Anpassung.
Die bakterielle CRISPR-Protein Cas9 hat eine einzigartige Fähigkeit. Es ist in der Lage zu finden und binden selektiv nur die DNA-Sequenzen in natürlich vorkommenden CrRNAs oder veränderter gRNAs1kodiert. Seine Verwendung als molekulare Werkzeug hat eine große Anzahl von Ansätzen, die waren unmöglich, unmöglich oder nur eingeschränkt für bestimmte zelluläre Modelle bis vor kurzem aktiviert. Dazu gehören gezielte Gen-Mutationen-2, Genom engineering3, Epigenom Bearbeitung von4,5,6, transkriptionelle Aktivierung und Gen-silencing-7,8. Soweit wir wissen, dass CRISPR universell einsetzbarer, wie Berichte über die Anwendung ist für eine breite Palette von Ziel-Sites, Zelle Arten und Arten vorhanden. Jedoch hängen viele CRISPR-Anwendungen direkt oder indirekt auf die Lieferung von mehreren gRNAs, einschließlich einer Reihe von genomischen Manipulationen (Translokation9,10, mittlere11 und groß angelegte genomischen Veränderungen 12 , ( 13), Genom-Technik (Verwendung von Cas9 Nickases14), Erzeugung von bedingten Allele11,15 oder serielle Mutationen16und tracing Strategien17. Darüber hinaus für andere Ansätze (transkriptionelle engineering18, Epigenom engineering19,20) mehrere targeting Standorte nicht sind streng vorgeschrieben, aber sie erreichen ihre maximale Wirkung oft nur unter diesem Zustand.
Einige nützliche Methoden wurden beschrieben, um gRNA Vektoren mit mehr als einem gRNA Ausdruck Kassette21,22,23,24,25,26zu generieren, 27. Hier präsentieren wir ein Protokoll für STAgR, Zeichenfolge Montage gRNA Klonen, das ist einzigartig in seiner Kombination aus Einfachheit und Geschwindigkeit (nur eine Übernachtung Klonen Schritt ist erforderlich), niedrige Kosten (wie DNA-Templates können mehrfach verwendet werden), Anpassbarkeit (für verschiedenen gRNA Systeme und Promotoren) und Effektivität (es ermöglicht die Erzeugung von Vektoren, die hohe Zahl von gRNA Kassetten enthalten)28.
STAgR kann im Prinzip zum Expressionsvektoren mit wenigen (1 – 2 gRNAs) generieren verwendet werden, mehrere (3 – 5 gRNAs) und einige der höchsten Anzahl von Expressionskassetten gemeldet, so weit (6 – 8 gRNAs)28. STAgR gilt ebenso für gRNA Sequenz, Rückgrat oder Veranstalter. Da jedoch STAgR hauptsächlich auf Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Gibson Montage basiert, sollte gRNAs mit hohen Sequenz Ähnlichkeiten mithilfe einer alternativen Methode generiert werden.

<table><tbody><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td>Polymerase für Gibson Master Mix sowie alle PCRs</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Life Technology</td><td>R0191</td><td>dNTPs für alle PCRs</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Life Technology</td><td>R0141</td><td>dNTPs für Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>dCTP</td><td>Life Technology</td><td>R0151</td><td>dNTPs für Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>dGTP</td><td>Life Technology</td><td>R0161</td><td>dNTPs für Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>dTTP</td><td>Life Technology</td><td>R0171</td><td>dNTPs für Gibson Master</td></tr><tr><td>Mix Agarose</td><td>VWR</td><td>443666A</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>für DNA-Aufreinigung</td></tr><tr><td>Tris HCL</td><td>Roth</td><td>9090.2</td><td>für Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Life Technology</td><td>R0861</td><td>für Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>VWR</td><td>RC-077</td><td>für Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Cayman Chemicals Company</td><td>16077</td><td>für Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>T5 Exonuklease</td><td>NEB</td><td>M0363S</td><td>für Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>Taq DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0208S</td><td>für Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>SigmaAldrich</td><td>PHR1393-1G</td><td></td></tr><tr><td>DNA Ladder 1 kb Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Mini Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid- und Primer-Sequenzen</td><td></td><td></td><td>Alle Sequenzen sind bei Figshare (https://goo.gl/UGdc3Q verfügbar.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>PanReacAppliChem</td><td>6381-92-6</td><td>für TLE Buffer</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>SigmaAldrich</td><td>M8266</td><td>für Gibson Master Mix</td></tr><tr><td>Top10 chemisch kompetente Bakterien</td><td>Thermo Scientific</td><td>C404003</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. Medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>Hefe-Extrakt</td><td>SigmaAldrich</td><td>Y1625</td><td>für lysogene Bouillon (LB Media)</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SigmaAldrich</td><td>S7653</td><td>für lysogene Bouillon (LB Media)</td></tr><tr><td>Pepton</td><td>SigmaAldrich</td><td>91249</td><td>für lysogene Bouillon (LB Media)</td></tr><tr><td>Agar-Agar</td><td>SigmaAldrich</td><td>5040</td><td>für lysogene Bouillon (LB Media)</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>Quiagen</td><td>201203</td><td></td></tr></tbody></table>

eine anpassbare protokoll für string montage grna klonen (stagr)

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

Die bakterielle CRISPR/Cas9 System hat methodische Optionen für Lebenswissenschaftler deutlich erhöht. Aufgrund dessen Nutzung wurde genetische und genomic Engineering für eine Vielzahl von Systemen. Darüber hinaus viele transkriptionelle und epigenomischen engineering Ansätze sind jetzt zum ersten Mal in der Regel möglich. Ein Grund für die breite Anwendbarkeit der CRISPR liegt in seiner zweiseitigen Natur. Kleine gRNAs bestimmen die genomische Ziele des Komplexes, Varianten des Proteins Cas9 und die lokalen molekularen folgen. Viele CRISPR Ansätze hängen jedoch die gleichzeitige Lieferung von mehreren gRNAs in einzelne Zellen. Hier präsentieren wir Ihnen eine anpassbare Protokoll für Zeichenfolge Montage gRNA Klonen (STAgR), eine Methode, die einfache, schnelle und effiziente Erzeugung von Multiplex gRNA Expressionsvektoren in einem einzigen Klonen ermöglicht, Schritt. STAgR ist kostengünstig, da (die in diesem Protokoll) der einzelnen targeting Sequenzen von kurzen Überhang Primer eingeführt werden, während die langen DNA-Templates die gRNA Expressionskassetten mehrfach wiederverwendet werden können. Darüber hinaus kann STAgR Einzelschritt Einbeziehung der eine große Anzahl von gRNAs, sowie Kombinationen von verschiedenen gRNA Varianten, Vektoren und Promotoren.

Nach dem Protokoll zur hand, macht die Generierung von kundenspezifischen multiplexing gRNA Vektoren möglich (Abbildung 1). Repräsentative Ergebnisse STAgR Ansätze mit sechs verschiedenen gRNA Kassetten sind in Abbildung 2dargestellt. Abbildung 2 A zeigt ein typisches Ergebnis der PCRs verwendet, um die STAgR Teile (Protokoll 3.1-3.3) abzurufen. Die sechs Amplifikate (BB, S1-S5) repräsentieren lineare DNA-Stücke mit den einzelnen gRNA N20 Sequenzen an ihren Enden. Das Plasmid Rückgrat (BB) ist nun mit dem targeting Sequenzen von gRNA1 und gRNA6 erweitert und besitzt daher die erforderlichen Überschneidungen zu zwei anderen PCRs (S1 und S5) für Gibson Montage (Abbildung 2A, Tabelle 3). Nach der Reinigung kann ein DNA-Ertrag von mindestens 1 µg für Vektoren und Einsätze erreicht werden.
Bakterielle Transformation sollte nach Gibson Montage 100 bis 700 Bakterienkolonien führen. Abbildung 2 B zeigt eine repräsentative Analyse der 10 Bakterienkolonien über Kolonie PCR, nach einem STAgR Protokoll mit sechs gRNA Kassetten. Gelelektrophorese zeigt, dass drei Klone die erwarteten Amplikons Größe für die komplette Montage (Tabelle 2 zeigen). Andere Klone wahrscheinlich empfangene STAgR Vektoren enthalten ein bis fünf gRNA Kassetten, während ein Klon (Abbildung 2B, No. 18) leer ist.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58556/58556fig1.jpg"> Abbildung 1 : Überblick über STAgR besser gekleideteres Design. Ersten gRNA Anzahl und Gerüste sind gewählt, dann gRNA Ordnung und Promotor und zuletzt, welche Art von Vektor verwendet werden soll. Für jede gRNA ist eine spezifische vorwärts Grundierung mit der Reihenfolge im Sinne Orientierungs- und entweder den gemeinsamen Teil der "Scf-FP" oder "Sam-FP" targeting gRNA konzipiert. Ebenso ist die einzelnen rückwärts-Primer der entsprechenden Promotorsequenz generieren (RP) mit die umgekehrte Ergänzung der N20 Abfolge der nächsten gRNA verschmolzen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58556/58556fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58556/58556fig2.jpg"> Abbildung 2 : Repräsentative Ergebnisse STAgR Ansätze mit sechs verschiedenen gRNA Kassetten. (A) repräsentatives Beispiel eines PCR von fünf Einsätze sowie den Vektor STAgR_Tomato. (B) Kolonie PCR eines 6 x STAgR Reaktion unter Verwendung der hU6 und mU6 Promotoren und kanonischen gRNA sowie SAM Gerüste. 22 Bakterienkolonien wurden analysiert, 7 zeigte die erwartete Band Komplettmontage angibt. Leiter: 1 kb plus, Zahlen in Basenpaaren (bp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58556/58556fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Forward Primer für String und Vektor</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>scaffold_fwd</td>
			<td>GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM_fwd</td>
			<td>GTTTTAGAGCTAGGCCAACATGAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rückwärts-Primer für String und Vektor</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>hU6_rev</td>
			<td>CGGTGTTTCGTCCTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>mU6_rev</td>
			<td>CAAACAAGGCTTTTCTCCAAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>hH1_rev</td>
			<td>CTGGGAAAGAGTGGTCTCATACAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>h7SK_rev</td>
			<td>CCGAGGTACCCAAGCGG</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Primer-Sequenzen für gRNA Gerüste und Veranstalter.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Größen von Promotoren und Gerüste.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>hU6</td>
			<td>265 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>hH1</td>
			<td>225 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>mU6</td>
			<td>316 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>h7SK</td>
			<td>245 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA Gerüst</td>
			<td>83 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAMloop + gRNA Gerüst</td>
			<td>143 bp</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Theoretische Größen der einzelnen Expressionskassette Kolonie-PCR-Ergebnis berechnen.
<table><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>hU6</td>
			<td>hH1</td>
			<td>mU6</td>
			<td>h7SK</td>
			<td>STAgR_Neo</td>
			<td>STAgR_tdTomato</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA Scf</td>
			<td>400 bp</td>
			<td>360 bp</td>
			<td>451 bp</td>
			<td>380 bp</td>
			<td>3722 bp</td>
			<td>4487 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM</td>
			<td>460 bp</td>
			<td>420 bp</td>
			<td>511 bp</td>
			<td>440 bp</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3: Größen von Promotoren und Gerüste.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>hU6</td>
			<td>hH1</td>
			<td>mU6</td>
			<td>h7SK</td>
			<td>STAgR_Neo</td>
			<td>STAgR_tdTomato</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA Scf</td>
			<td>368 bp</td>
			<td>328 bp</td>
			<td>419 bp</td>
			<td>348 bp</td>
			<td>+ 74 bp</td>
			<td>+ 67 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>SAM</td>
			<td>428 bp</td>
			<td>388 bp</td>
			<td>479 bp</td>
			<td>408 bp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 4: Berechnete Größen STAgR Stücke nach PCR.

Hier präsentieren wir Zeichenfolge Montage gRNA Klonen (STAgR), eine Methode, um leicht gRNA Vektoren multiplex für nähert sich CRISPR/Cas9. STAgR macht gRNA Multiplexen, einfach, effizient und individuell.

Eine anpassbare Protokoll für String Montage gRNA Klonen (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

Das bakterielle CRISPR-Cas9-System hat die experimentellen Möglichkeiten für Life-Wissenschaftler erheblich erhöht. Mehrere CRISPR-Ansätze hängen jedoch von der gleichzeitigen Abgabe mehrerer Führungs-RNAs in einzelne Zellen ab. Das GRNA-Klonen der String-Baugruppe ermöglicht die einfache und schnelle Generierung von Multiplex-gRNA-Expressionsvektoren in einem einzigen Klonschritt.Aber STAgR ist nicht nur einfach, es ist auch effizient, billig und einfach anzupassen. Um zu beginnen, fügen Sie die N20 gRNA Sequenzen zu den vorwärts ampliflifikationsprimern für STAgR DNA String als Überhänge. Fügen Sie sense gRNA-Sequenzen fünf Prime zur Vorwärtsgrundierung, Gerüst-Vorwärtsgrundierung, für ein herkömmliches Gerüst oder zu SAM-Vorwärtsgrundierung für ein MS2-haltiges Gerüst hinzu.Als Nächstes fügen Sie die umgekehrte Komplement N20 gRNA Sequenzen zu den Reverse Primer-Sequenzen hinzu, indem Sie RP-Primer auswählen, abhängig von den verwendeten Promotoren und Strings. Um mit der Erzeugung der einzelnen Klonfragmente für Gibson Assembly zu beginnen, übertragen Sie 10 Mikroliter des Hochtreuepuffers in ein Rohr. Fügen Sie einen Mikroliter von 10 millimolaren dNTPs und 0,25 Mikroliter der beiden 100 mikromolaren Überhanggrundierungen hinzu.Fügen Sie 10 Nanogramm der DNA-Vorlagenzeichenfolge oder des Vektors und 1,5 Mikroliter DMSO hinzu. Fügen Sie genügend Wasser hinzu, um das endige Volumen auf 49,5 Mikroliter zu bringen, und fügen Sie dann 0,5 Mikroliter HF-Polymerase hinzu. Inkubieren Sie die Reaktionen auf einem Thermocycler, wie im Textprotokoll beschrieben.Danach nehmen Sie einen 5,5 Mikroliter Aliquot aus der PCR-Reaktion. Fügen Sie allen Aliquots Ladefarbstoff hinzu und laden Sie ihn auf ein 1%Agarose-Gel. Laden Sie eine geeignete DNA-Leiter für die Dimensionierung, und führen Sie das Gel in einem geeigneten Gel-Laufpuffer bei 120 Volt für 30 Minuten.Während das Gel läuft, fügen Sie fünf Mikroliter des Puffers hinzu, der mit dem Restriktionsenzym bereitgestellt wird, und 0,5 Mikroliter DpnI zu den verbleibenden 44,5 Mikrolitern Vektor-PCR-Reaktion, um Restplasmid-Vorlage zu entfernen, die während der PCR verwendet wird. 30 bis 60 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Stellen Sie sicher, dass die Amplicons die richtige Größe haben.Um mit der DNA-Reinigung zu beginnen, fügen Sie 1,8 Mikroliter Magnetperlen pro einem Mikroliter PCR-Produkt hinzu und mischen Sie sie durch Pipettieren nach oben und unten. Bei Raumtemperatur zwei Minuten inkubieren. Mit einem Magneten trennen Sie die Perlen in DNA-Fragmenten von der Restflüssigkeit.Spülen Sie das Pellet mit 70% Ethanol, ohne es vollständig wieder aufzuhängen, um die Perlen zu waschen. Wiederholen Sie diese Wäsche ein weiteres Mal. Mit einer Pipette das gesamte Ethanol entfernen und die Pelletluft trocknen lassen.Dann fügen Sie 15 bis 20 Mikroliter Wasser, und Pipette nach oben und unten, um zu mischen und lösen Sie das Pellet. Verwenden Sie einen Magneten, um die Perlen von der Flüssigkeit zu trennen. Übertragen Sie den klaren Überstand auf eine neue Röhre.Verwenden Sie anschließend ein Spektralphotometer, um die DNA-Konzentrationen zu bestimmen. Bereiten Sie zunächst den 5x isothermalen Reaktionspuffer vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Kombinieren Sie für den Gibson Assembly Master Mix 320 Mikroliter des 5x isothermen Reaktionspuffers mit 697 Mikroliter Wasser.Fügen Sie 3 Mikroliter T5 Exonuklease, 20 Mikroliter DNA-Polymerase und 160 Mciroliter Taq DNA-Ligase hinzu. 7,5 Mikroliter des Assembly Master Mix in ein frisches Rohr geben. Fügen Sie dann 2,5 Mikroliter Insert in Vektor hinzu, wie im Textprotokoll beschrieben.Inkubieren Sie die Proben bei 50 Grad Celsius für 45 bis 60 Minuten. Danach Proben auf Eis oder bei 20 Grad Celsius für die nachfolgende Transformation lagern. Wenn Sie bereit sind, die Bakterien zu transformieren, tauen Sie chemisch kompetente TOP10 E.Coli-Bakterien auf Eis auf.Als nächstes fügen Sie fünf Mikroliter des Gibson Mix zu 50 Mikrolitern kompetenter Bakterien hinzu und mischen Sie, indem Sie sanft den Boden des Rohres streichen. 30 Minuten auf Eis bebrüten. Legen Sie das Rohr 45 Sekunden lang in ein 42 Grad Celsius Wasserbad oder einen Wärmeblock, um die Bakterien zu erhitzen.Dann legen Sie die Rohre wieder auf Eis. Fügen Sie den Bakterien 250 Mikroliter SOC-Medium hinzu und lassen Sie sie sich 30 bis 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Schüttel-Inkubator erholen. Nachdem sich die Bakterien erholt haben, platten Sie sie auf 1,5%LB Agar-Platten, die 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin enthalten.Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius über Nacht. Bereiten Sie zunächst mindestens zwei Sätze von 200 Mikroliter-PCR-Reaktionsröhren für jedes Konstrukt vor. Füllen Sie einen der Sätze von Reaktionsröhren mit 100 Mikroliter LB Medium, das 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin enthält.Mit einer sterilen Pipettenspitze das biologische Material aus einer Bakterienkolonie abkratzen und an der Unterseite eines leeren 200-Mikroliter-PCR-Reaktionsrohrs verteilen. Übertragen Sie die Pipettenspitze sofort auf das zweite entsprechende Reaktionsrohr, das LB-Medium enthält. Wirbeln Sie die Spitze herum, um sicherzustellen, dass einige der Bakterien auf die LB-Medien übertragen werden.Inkubieren Bei 37 Grad Celsius für den späteren Gebrauch. Bereiten Sie dann 10 Mikroliter PCR Master Mix pro Reaktionsröhre vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Fügen Sie 10 Mikroliter des PCR Master Mix zu den beschrifteten PCR-Reaktionsröhren hinzu, ohne das LB-Medium.Mit einem Thermocycler die Reaktionen, wie im Textprotokoll beschrieben, inkubieren. Danach fügen Sie den verstärkten Fragmenten Ladefarbstoff hinzu und laden Sie sie auf ein 1%Agarose-Gel. Laden Sie eine geeignete DNA-Leiter für die Dimensionierung, und führen Sie das Gel in einem geeigneten Gel-Laufpuffer bei 120 Volt für 30 Minuten.Berechnen Sie die theoretische Größe des Amplicons, indem Sie die einzelnen Größen der verwendeten Promotoren, gRNA-Gerüste und die Anzahl der N20-Sequenzen addieren. Identifizieren Sie anhand der Ergebnisse der Kolonie PCR die bakteriellen Klone, basierend auf der richtigen Bandgröße und ob sie wahrscheinlich korrekte Vektoren aufweisen. Mit der entsprechenden 100-Mikroliter-Kultur impfen Sie eine 2,5-Milliliter-LB-Kultur über Nacht, die 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin enthält.12 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Verwenden Sie dann ein kommerzielles Plasmid-Mini-Kit, um die Plasmid-DNA gemäß den Anweisungen des Herstellers zu extrahieren. Bei diesem Verfahren wird das String-Assembly-gRNA-Klonen verwendet, um schnell gRNA-Expressionsplasmide zu erzeugen.Ein typisches Ergebnis der PCRs, die verwendet werden, um die STAgR-Stücke zu erhalten, ist hier zu sehen. Die sechs Amplicons stellen lineare DNA-Stücke dar, die jeweils die einzelnen gRNA N20-Sequenzen an ihren Enden enthalten. Das Plasmid-Backbone wird mit den Targeting-Sequenzen von gRNA1 und gRNA6 erweitert und verfügt daher über die erforderlichen Überlappungen zu zwei anderen PCRs für Gibson Assembly.Nach der Reinigung kann eine DNA-Ausbeute von mindestens einem Mikrogramm für Vektoren und Inserts erreicht werden. Nach der Gibson Assembly führt die bakterielle Transformation zu 100 bis 700 Bakterienkolonien. Repräsentative Analysen von 22 Bakterienkolonien über Kolonie PCR nach einem STAgR-Protokoll mit sechs gRNA-Kassetten zeigen, dass sieben Klone die erwartete Amplikongröße für die Vollmontage aufweisen.Die anderen Klone erhielten wahrscheinlich STAgR-Vektoren, die ein bis fünf gRNA-Kassetten enthielten, während ein Klon vollständig leer ist. Einmal gemeistert, kann diese Technik in wenigen Stunden durchgeführt werden. Richtig durchgeführt, ermöglicht es die Erzeugung einer Vielzahl von Multiplex-gRNA-Expressionsvektoren in weniger als einer Arbeitswoche.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, auf die richtige Zuweisung und Kombination von N20-Überhanggrundierungen zu achten. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihre eigenen Multiplex-Führungs-RNA-Expressionsvektoren erstellen können.

a-customizable-protocol-for-string-assembly-grna-cloning-stagr

Research

Forschung

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Genetics

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