Name: Bau eines vielschichtigen mesenchymale Stammzellen-Blatt mit einem 3D dynamische Kultursystem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Lernen Sie die Konstruktion mehrschichtiger mesenchymaler Stammzell-Blätter mit einem dynamischen Perfusionskultursystem. Diese Methode verbessert die Nährstoffversorgung und die therapeutische Wirksamkeit in vivo.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Natural Science Foundation of China (Grant-Nummer 31771064); Wissenschaft und Technik Planung Projekt der Provinz Guangdong (Zuschuss Zahlen 2013B010404030, 2014A010105029 und 2016A020214012); Wissenschaft und Technik Planung Projekt von Guangzhou (Grant-Nummer 201607010063); der Student Innovation und Entrepreneurship Trainingsprogramm (Grant-Nummer 201610559028); die National Science Foundation für junge Wissenschaftler von China (Gewährungsnummer 31800819).

Alle Stammzellen und Tierversuch Verfahren wurden nach den ethischen Richtlinien des nationalen Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und durch die Jinan Universität Animal Care and Use Committee (Guangzhou, China) genehmigt.
1. Vorbereitung des DPP-Gerüst mit PLA2 Decellularization Methode14
Hinweis: Siehe Abbildung 1A für eine schematische Darstellung des PLA2 Decellularization Methode.
<ol><li>100 mL 200 U/mL PLA2 Lösung vorzubereiten. 0,5 g Natrium-Deoxycholate und 2 mL PLA2 in 198 mL Pufferlösung Carbonat hinzufügen. Diese Lösung sollte innerhalb von 24 h nach der Zubereitung verwendet werden.</li>
	<li>Erhalten Sie frische porcinen Perikardium (FPP) aus dem Schlachthaus und an das Labor innerhalb von 1 h zurück. Hinweis: Die FPP ist bei 4 ° C während des Transports aufzubewahren. Schritte 1.2-1.10 sollten durchgeführt werden, mit kontinuierlichen schütteln in einem Wasserbad mit Thermostat gesteuert.</li>
	<li>Gründlich waschen die FPP mit 200 mL Phosphat-Pufferlösung (PBS) mit 1 % Penicillin-Streptomycin in einen 500-mL-Becherglas 10 ° Cfür 10 min. Schritt 2 X wiederholen.</li>
	<li>Die FPP in zwei Ebenen aufgeteilt und das Fettgewebe mit Zange und Schere zu entfernen. Hinweis: Halten Sie der FPP nass durch Zugabe von 50 mL PBS alle 20 Minuten während der Entfernung des Fettgewebes.</li>
	<li>Formen Sie die FPP in 10 x 10 cm2 Stück mit einer Schere. Waschen Sie die FPP mit 200 mL Pufferlösung Carbonat (CBS) mit 1 % Penicillin-Streptomycin in einen 500-mL-Becherglas bei 10 ° C für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 X.</li>
	<li>Übertragen Sie die FPP zu reinem Wasser und genießen Sie es bei 10° C für 12 h.</li>
	<li>Einweichen Sie die 10 x 10 cm2 Proben in 50 mL von CBS mit 200 U/mL PLA2 und 0,5 % (w/V) Natrium-Deoxycholate-Lösung bei 37 ° C für 6 Stunden.</li>
	<li>Waschen Sie den Proben mit CBS mit 1 % Penicillin-Streptomycin bei 10 ° C für 10 min. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 X.</li>
	<li>Einweichen Sie jede Probe in 50 mL von CBS mit 200 U/mL PLA2 und 0,5 % (w/V) Natrium-Deoxycholate-Lösung bei 37 ° C für 2 Stunden.</li>
	<li>Waschen Sie Proben mit CBS mit 1 % Penicillin-Streptomycin bei 10 ° C für 2 h wiederholen Sie diesen Schritt für 10 X mindestens. Legen Sie die Proben auf flache Teller und trocknen Sie sie zur Gewichtskonstanz in eine Konstante Temperatur Backofen bei 55 ° C. Hinweis: Das Beispiel muss vollständig getrocknet werden. Wägen Sie die DPP-Probe alle 10 Minuten und wiederholen, 3 x oder bis das Gewicht nicht mehr ändert.</li>
	<li>Gestalten Sie jede DPP-Probe in einen Durchmesser von 10,5 mm Kreis mit einer Trephine. Packen Sie jede DPP in einem sterilen versiegelten Beutel.</li>
	<li>Sterilisieren Sie die DPP Proben durch Gammastrahlung (25 kGy). Die DPP-Proben bei 4 ° C vor dem Gebrauch gespeichert. Hinweis: Alle Proben können bis zu sechs Monate bei 4 ° c gelagert werden</li>
</ol>(2) die Vorbereitungen für die Zelle Blatt Bau
<ol><li>Autoklav alle Instrumente und Gewebe Trägerkomponenten bei 121 ° C für 30 min, einschließlich 1,5 mL zentrifugale Röhren, Zangen, Pinzetten, Scheren, gezahnten schwarze Basen (trägerbauteil Gewebe) und weiße Spannringe (trägerbauteil Gewebe).</li>
	<li>Bereiten Sie 20 mL 10 % Saccharose-Lösung keimfrei. Gewicht 2 g Saccharose und löst die Saccharose in 18 mL Reinstwasser. Autoklaven die 10 % Saccharoselösung bei 121 ° C für 30 min oder Filter die Lösung mit einem 0,22 µm-Filter.</li>
	<li>Autoklaven der dynamische Perfusion Systemgeräte bei 121 ° C für 30 min, einschließlich eine Gas austauschen, Ausrüstung, eine 500 mL-Glasflasche, Perfusion Kultur Container und die verbindenden Rohre.</li>
	<li>Bereiten Sie die Instrumente autoklaviert und Gewebe Trägerkomponenten. Setzen Sie das schwarzen Basisteil des Trägers Gewebe in der Kulturschale.</li>
	<li>Eine getrocknete DPP-Gerüst holen Sie ab und legen Sie es in der Mitte des schwarzen Sockel. Das DPP-Gerüst eine weiße Spannring anziehen und im Gewebe Träger befestigen. Hinweis: Stellen Sie sicher das Gerüst ist total fest im Gewebe Träger und es gibt keine Lücke zwischen Schwarzen und den weißen Spannring. Ist dies nicht der Fall, die Gewebe-Träger zu trennen und das Gerüst wieder zu beheben.</li>
	<li>100 µL Kulturmedium auf der DPP-Gerüst für die Rehydratation hinzufügen. Hinweis: Wenn das Gerüst nicht gut im Gewebe Träger fixiert ist, wird das Nährmedium der Kulturschale infiltrieren.</li>
	<li>Genommen Sie das Gerüst in einem 37 ° C Inkubator und lassen Sie es 15 Minuten einweichen lassen.</li>
</ol>3. Vorbereitung der Zellen für Zelle Blatt Bau
Hinweis: Dieses Protokoll ist für die Zellkultur mit einer 100 mm Schale. Siehe Abbildung 1 b für eine schematische Darstellung des den Bau der vielschichtigen Zellstruktur.
<ol><li>BMSCs13zu isolieren. Hinweis: Diese Methode ist für den Bau von einem vielschichtigen MSC Zelle Blatt vorgesehen. Ratte BMSCs werden in diesem Protokoll verwendet. Die BMSCs sind mit die ganze Knochenmark anhaftende Methode isoliert, und die BMSCs sind erweiterte in Vitro genügend Zelle zu erhalten.<ol>
<li>Autoklaven der Instrumente bei 121 ° C für 30 min, einschließlich Zangen, gezahnten Zangen und Scheren. Bereiten Sie eine 2 mL Injektionsspritze und BMSC Kulturmedium (Dulbeccos modifiziert Adlers Medium [DMEM] fötalen Rinderserum 10 %, 1 % Glutamin und 1 % Penicillin-Streptomycin).</li>
		<li>Die drei Wochen alten männlichen Sprague-Dawley (SD) Ratten von Halswirbel Verrenkung einschläfern. Das Tier in 100 mL 75 % Alkohol-Lösung in ein Becherglas für 5 Minuten einweichen.</li>
		<li>Nehmen Sie das Tier aus den Becher und anfällig auf dem OP-Tisch. Einschneiden der Haut auf dem Rücken des Tieres mit Schere und Pinzette. Isolieren Sie die Haut und Muskel Gewebe um die Oberschenkel Oberschenkelknochen verfügbar zu machen.</li>
		<li>Isolieren der Oberschenkel Oberschenkelknochen und legen Sie es in 30 mL PBS in einer 50 mL Zentrifugenröhrchen. Legen Sie zwei Oberschenkel Oberschenkelknochen in eine Röhre. Vortex Zentrifugenröhrchen, das Gewebe gründlich zu waschen. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 X.</li>
		<li>Geschnitten Sie beide Enden der Oberschenkelknochen mit einer Schere und setzen Sie den Knochenmark Hohlraum.</li>
		<li>Aspirieren Sie 2 mL Kulturmedium BMSC mit einer Injektionsspritze. Stechen Sie die Nadel in den Hohlraum des Knochenmarks und spülen Sie das Knochenmark mit Nährmedium. Spülen Sie alle zwei Oberschenkel Oberschenkelknochen in einer Kulturschale von 100 mm.</li>
		<li>Hinzugeben Sie für jede 100 mm Kulturschale 2 mL Kulturmedium in der Kulturschale. Setzen Sie die Kulturschale in die 37 ° C Inkubator und statische Kultur für 72 h.</li>
		<li>Herausnehmen der Kulturschale aus dem Inkubator. Den Überstand mit 6 mL frisches Nährmedium zu ersetzen.</li>
		<li>Primäre BMSCs unter dem Mikroskop zu beobachten. Im Anschluss daran Durchgang der BMSCs jeden 5-7-d.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator. Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop und wählen Sie geeignete Zellen für Zelle Blatt Bau. Wenn die BMSCs 80 % - 90 % Zusammenfluss erreichen, können die Zellen als die gesetzten Zellen gewählt werden.</li>
	<li>Entfernen Sie das Kulturmedium aus der Kulturschale. Vorsichtig waschen der Zellen mit 2 mL warmen PBS. Entfernen Sie alle PBS aus der Kulturschale und machen Sie sicher nicht flüssig bleibt. 2 mL 0,25 % Trypsin (oder eine andere Trennendem Lösung) in die Schale hinzufügen und bei 37 ° C für 3 min inkubieren.</li>
	<li>Die Trypsin-Wirkung durch Zugabe von 2 mL Kulturmedium zu stoppen, und vorsichtig waschen der Zellen aus der Schale. Übertragen Sie die Zellsuspension in eine neue 15 mL Zentrifugenröhrchen. Entmischen der Zellen bei 225 X g für 5 Minuten.</li>
	<li>Den überstand zu entfernen. Die Zellen mit 3 mL 10 % (w/V) Saccharoselösung aufzuwirbeln. Hinweis: 10 % (w/V) Saccharoselösung wird verwendet um die Zellen zu waschen um eine einheitliche Zelle-Hydrogel-Mischung in den folgenden Schritten zu erhalten.</li>
	<li>Aspirieren Sie 10 µL Zellsuspension und zählen Sie die Anzahl von Zellen mit einem Hemocytometer. Berechnen Sie das Volumen für den nächsten Schritt benötigt. Für eine Zelle-Blatt sind 3 Millionen BMSCs verwendet.</li>
	<li>3 Millionen Zellen zu extrahieren und in einem neuen 15 mL Zentrifugenröhrchen überführen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 225 X g für 5 min.</li>
	<li>Den überstand zu entfernen. Die Zellen mit 1 mL 10 % (w/V) Saccharoselösung aufzuwirbeln. Übertragen Sie die Zellsuspension in einem 1,5 mL Zentrifugenröhrchen. Hinweis: Mit einer zentrifugalen 1,5 mL-Tube ist vorteilhaft für die Vorbereitung der Zelle-Hydrogel-Mischung.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 260 Xg , für 5 min. ganz herauszudrehen überstand und die Zelle Sediment erhalten.</li>
</ol>4. Vorbereitung der BMSCs und der RAD16-ich Peptid Hydrogel Mischung
Hinweis: Siehe Abbildung 1 b für eine schematische Darstellung des den Bau der vielschichtigen Zellstruktur.
<ol><li>Die zentrifugale 1,5 mL-Tube 20 µL 10 % (w/V) Saccharoselösung hinzufügen. Sanft Aufschwemmen Sie der BMSCs und erhalten Sie eine homogene Suspension zu. Hinweis: Erzeugen Sie keine Bläschen während der Wiederfreisetzung.</li>
	<li>Fügen Sie 20 µL des RAD16-ich Peptid Hydrogel an der Spitze der Suspension. Rühren Sie leicht die RAD16-ich Peptid und Zelle Federung mit der Pipettenspitze. Wenn die Zellsuspension und Hydrogel miteinander vermischt sind, pipette vorsichtig der Mischung ein paar Mal.</li>
	<li>Nehmen Sie das DPP-Gerüst aus dem Gewebe-Träger und Aspirieren Sie sanft das Kulturmedium mit einer PIPETTENSPITZE. Hinweis: Sicherstellen Sie, dass die DPP-Gerüst vollständig rehydriert ist, bevor Sie die Zelle-Hydrogel-Mischung hinzufügen.</li>
	<li>Aspirieren Sie die Mischung und fügen Sie es gleichmäßig auf der DPP-Gerüst. Hinweis: Das Gesamtvolumen der Mischung wäre etwa 40-50 µL. Es empfiehlt sich, die Mischung 10 µL jeweils von der Mitte an der Außenseite des Gerüstes hinzufügen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL Kulturmedium auf den Grund des Trägers Gewebe. Legen Sie die Zelle Blatt im Inkubator 37 ° C für 5 Minuten.</li>
	<li>Nehmen Sie die Zelle Blatt aus dem Inkubator. Sanft fügen Sie 4 mL Kulturmedium in der Kulturschale und Tauchen Sie die Zelle Blatt. Legen Sie die Zelle Blatt im 37 ° C Inkubator für 2 h statische Kultur.</li>
</ol>5. in-vitro- Kultur aus einem 3D vielschichtigen Zelle Blatt mit einem dynamischen Kultursystem
Hinweis: Siehe Abbildung 1 für eine schematische Darstellung des dynamischen 3D-System.
<ol><li>Bereiten Sie das dynamische Perfusion System, einschließlich einer peristaltischen Pumpe, Gasgeräte Austausch, eine 500 mL-Glasflasche, Perfusion Kultur Container und den verbindenden Rohren. Montieren Sie das dynamische Perfusion System, wie in Abbildung 2dargestellt.</li>
	<li>Die sterile Glasflasche 200 mL Kulturmedium hinzufügen. Legen Sie die Zelle Blatt in der Kammer des Behälters Kultur. Hinweis: Achten Sie auf die Richtung der oberen Oberfläche des Blattes Zelle.</li>
	<li>Fügen Sie 3 mL Kulturmedium im Gewebe Container hinzu, und schließen Sie den Container. Die dynamische Perfusion System im Inkubator und einschalten Sie die Pumpe. Inmitten des Durchfluss der peristaltischen Pumpe 8 mL/min. Kultur der Zelle Blatt das dynamische Perfusion System für 48 h.</li>
</ol>6. Erhalt der vielschichtigen MSC Zelle Blatt
<ol><li>Autoklaven der Instrumente und Gewebe Trägerkomponenten bei 121 ° C für 30 min, einschließlich 1,5 mL zentrifugale Röhren, Zange und gezahnten Zangen.</li>
	<li>Ziehen Sie den Eingang Kanal aus der Glasflasche, die Lieferung von Kulturmedium in den Container zu stoppen. Hinweis: Beenden der peristaltischen Pumpe, wenn der Kultur-Behälter leer ist.</li>
	<li>Nehmen Sie die Zelle Blatt aus dem Kultur-Container und steckte es in eine Kulturschale.</li>
	<li>Verwenden Sie eine Zange zu immobilisieren den Gewebe-Träger und ein anderes gezahnte Pinzette verwenden, um den weißen Spannring aus dem schwarzen Sockel trennen. Schließlich erhalten Sie die vielschichtige BMSCs Zelle Blatt.</li>
	<li>Für kurze Konservierung kann jede Zelle Blatt auf eine zentrifugale 1,5 mL-Tube mit der Zange übertragen werden. DPP-Gerüst sollte an der Innenwand des zentrifugalen Rohres angebracht werden, und das Blatt Zelle verbreiten sollte, so viel wie möglich in die Zentrifugenröhrchen.</li>
	<li>Fügen Sie sanft 1 mL Kulturmedium in der zentrifugalen Röhre, die Zelle Blatt einzutauchen. Verschließen Sie die Kappe der zentrifugalen Röhre und speichern Sie die Zelle Blatt bei 4 ° C. Hinweis: Die Zelle Blatt sollte transplantiert oder schnellstmöglich analysiert. Es wird empfohlen, die Zelle Blatt innerhalb von 4 Stunden zu verwenden.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll meldet eine effiziente Methode für das Konstruieren einer vielschichtigen MSC-Blatt. Dieses Blatt Zelle weist optimale mechanische Festigkeit, hohe Zelldichte seeding und günstige Stammzellen Bioaktivität. Mit BMSCs als ein Beispiel, die 3D Zellstruktur ist schnell aufgebaut mit RAD16-ich Peptid Hydrogel. Nach in das dynamische Perfusion System kultiviert wird, erhält man das vielschichtige BMSC Blatt erfolgreich und die BMSCs pflegen eine hohe Expression der Stammzell-Marker.
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Stammzell-Therapie als eine wirksame Behandlung für viele Krankheiten berichtet; niedrige Zelle Retention und Armen überleben innerhalb der Zielzone bleiben jedoch kritische Fragen nach der traditionellen Stammzell-Injektion. Um dieses Problem zu lösen, entwickelte Gewebe-engineering-Wissenschaftler die Zelle Blatt Technik. Eine monolayered Zelle Blatt mit intakten extrazelluläre Matrix war zunächst mithilfe der Temperatur-Antwort Kultur Gericht1vorbereitet, und seine Follow-up Studien berichtet die signifikanten Verbesserungen der Stammzellen Aufbewahrung und Überleben in das infarzierte Bereich2,3. Unter den Methoden Bau der vielschichtigen Zelle Blatt als eine wirksame Strategie zur Verbesserung der Zelle überleben und die Zelle Blatt therapeutische Wirkung3,4berichtet. Seitdem haben Wissenschaftler gearbeitet, auf andere Zelle Blatt Bauweisen zu entwickeln, um die Zelle Höhe, Stammzell-Eigenschaft und mechanischen Eigenschaften der Zelle Blätter erhöhen. So weit, bestimmte Arten von Zelle Blatt wurden konstruiert und studierte bei der Behandlung von Herzinfarkt5, Knorpel Verletzung6, und Haut Wunde7.
Die Bioaktivität der Stammzellen vor der Transplantation zeigten einen aufstrebenden Einfluss auf die Regeneration des verletzten Gewebes, und andere Zelle Blatt Bau Strategien haben unterschiedliche Auswirkungen auf die Stammzellen. Auf der einen Seite konfluierende Zelle Blätter bestand nur aus High-Density-Stammzellen, und natürliche extrazelluläre Matrizen konnte durch Stapeln monolayered Zelle Blätter8 oder mithilfe magnetischer Tissue engineering Techniken9erworben werden. Auf der anderen Seite entwickelten die Forscher verschiedene Gerüste um ausreichende mechanische Festigkeit und Unterstützung Zelle Wachstum10,11,12, ermöglichte eine niedrige Stammzelle Aussaat Dichte um die Ernährung zu gewährleisten liefern. Die niedrigen effizienten Nährstoffversorgung innerhalb der vielschichtigen Zellstruktur Blatt bleibt jedoch trotz dieser Ansätze ein Hauptanliegen beim in-vitro- Bau. Eine effiziente und praktikable Zelle Blatt Bausystem ist daher dringend erforderlich.
Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, um ein Multilayeredmesenchymal Stammzellen (MSC) Zelle Blatt vorbereiten. In diesem Bausystem bietet ein DPP die Zelle Blatt mechanische Festigkeit. Basierend auf diesem Gerüst, die 3D Zellstruktur kann schnell aufgebaut werden mit RAD16-ich Peptid Hydrogel und eine dynamische Perfusion System wird verwendet, um die Kultur der vielschichtigen Zelle Blatt, um die 3D Blatt Zellstruktur stabilisieren und für eine ausreichende Ernährung Versorgung der Zellen. Mit diesem System, ein vielschichtiges BMSC Blatt wurde erfolgreich erstellt und einen optimalen therapeutischen Effekt auf die Ratte Myokardinfarkt Modell13ausgestellt.

<table><tbody><tr><td>Phospholipase A2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6534</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer</td><td>Gibco BRL</td><td>89033</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin / Amphotericin&nbsp;</td><td>Gibco BRL</td><td>15640055</td><td></td></tr><tr><td>Puffer Bikarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3041</td><td></td></tr><tr><td>Tischkonzentrator</td><td>Changzhou Aohua Instrument Co.</td><td></td><td></td>KT20183</tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-014-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Südamerikanisches fötales Rinderserum&nbsp;</td><td>Gibco BRL</td><td>10270-106/P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsin/2,21 mM EDTA</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Biosicherheitswerkbank</td><td>Esco,Singapur</td><td>AC2-2S1</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator mit konstanter Temperatur&nbsp;</td><td>Esco, Singapur</td><td>CLS-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen &nbsp;</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>EP Röhrchen</td><td>Axygen</td><td>31617934</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugalmaschine</td><td>TOMOS</td><td>1-16R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pura Matrix&nbsp;</td><td>BD</td><td>354250</td><td></td></tr><tr><td>Dynamisches Perfusionskultursystem</td><td>Minucells und Minutissue</td><td>D-93077</td><td></td></tr><tr><td>Schlauchpumpe</td><td>Ismatec</td><td>IPC N8</td><td></td></tr><tr><td>Pumpenschlauch</td><td>Ismatec</td><td>Nr.1306</td><td></td></tr><tr><td>MINUSHEET 1300&nbsp;</td><td></td><td>Regensburger</td><td>Gewebeträgerkomponenten&nbsp;</td></tr><tr><td>MINUSHEET</td><td>Regensburg</td><td></td><td>dynamisches Perfusionssystem&nbsp;</td></tr><tr><td>MINUSHEET 0006</td><td>Regensburg</td><td></td><td>Gasaustauschausrüstung&nbsp;</td></tr><tr><td>MINUSHEET 0002</td><td>Regensburg</td><td></td><td>500 mL Glasflasche&nbsp;</td></tr><tr><td>MINUSHEET 1301</td><td></td><td></td><td>Behälter für Perfusionskultur&nbsp;</td></tr></tbody></table>

bau eines vielschichtigen mesenchymale stammzellen-blatt mit einem 3d dynamische kultursystem

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Stammzell-Therapie zeigt eine viel versprechende Zukunft bei der Regeneration von verletzten Organ und Gewebe, und die Zelle-Blatt-Technik wurde entwickelt, um die niedrigen Zelle Aufbewahrung und Armen überleben innerhalb der Zielzone zu verbessern. Während des Bauprozesses in Vitro ist eine Lösung für die Aufrechterhaltung der Stammzelle Bioaktivität und Erhöhung der Zelle innerhalb der Zelle Blatt jedoch dringend erforderlich. Dieses Protokoll stellt eine Methode für das Konstruieren einer vielschichtigen Zelle Blatt mit günstigen Stammzellen Bioaktivität und optimale Bedienbarkeit. Decellularized porcinen Perikard (DPP) wird vorbereitet, indem Phospholipase2 (PLA2) Decellularization Methode als die Zelle Blatt Gerüst und Ratte Knochenmark mesenchymale Stammzellen (BMSCs) sind isoliert und als die gesetzten Zellen erweitert. Die temporäre vielschichtigen Zellstruktur Blatt mit RAD16 konstruiert ist-ich Peptid Hydrogel. Schließlich Zelle Blatt ist mit einem dynamischen Perfusion System zu stabilisieren die dreidimensionale (3D) Struktur kultiviert, und die Zelle Blatt konnte nach einer 48-Stunden-Kultur in Vitroabgerufen werden. Dieses Protokoll bietet eine effiziente und praktikable Methode für den Bau von einem vielschichtigen Stammzell-Blatt und das Blatt Zelle in der Zukunft als günstige Stammzell-Therapie Produkt entwickelt werden könnte.

Die schematische Darstellung der vielschichtigen Stammzell-Blatt Bau ist in Abbildung 1dargestellt. Vorbereitung der Zelle Blatt Gerüst von der PLA-2 -Decellularization-Methode ist der erste Schritt. Basierend auf dem Schafott, entsteht eine temporäre 3D Zellstruktur durch Mischen der Stammzellen mit der RAD16-1-Peptid-Hydrogel. Um ein vielschichtiges Zelle Blatt mit günstigen Stammzellen Bioaktivität und optimale mechanische Festigkeit zu erhalten...

Dieser Artikel bietet eine effiziente und praktikable Methode für den Bau von vielschichtigen Stammzell-Blätter mit günstigen Stammzell-Eigenschaft.

Bau eines vielschichtigen mesenchymale Stammzellen-Blatt mit einem 3D dynamische Kultursystem

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

Die Stammzelltherapie wurde weithin als vielversprechende Behandlung für viele Krankheiten berichtet. Und die Zellblatttechniken wurden entwickelt, um auch die Retention der Zelle und das Überleben innerhalb der Ziele zu verbessern. Während des Zellblattbaus bleibt die unzureichende Nahrungsversorgung ein zentrales Problem für den Verlust der Funktion der Stammzellzelle und ist eine unbefriedigende Stammzelleigenschaft, die schließlich die therapeutische Wirkung in vivo bewirken würde.Unser Ziel, verfügbare mehrschichtige Stammzellblattprodukte vorzubereiten, hat unser Team das zelluläre Pol-, Perikard- und Zellblechgerüst entwickelt. Basierend auf dem Gerüst würde der Mehrschichtzellenstarter schnell mit Nonapeptid Hydrogen konstruiert und ein dynamisches Perfusionssystem verwendet, um die Nahrungsversorgung der Stammzelle in vitro zu gewährleisten. Nehmen Sie ein getrocknetes DBP-Gerüst heraus und legen Sie es in die Mitte der schwarzen Basis.Legen Sie einen weißen Spannring auf das DBP-Gerüst und befestigen Sie ihn im Gewebeträger. Stellen Sie sicher, dass das DBP-Gerüst vollständig im Gewebeträger fixiert ist. Fügen Sie 100 Mikroliter Kulturmedien auf dem DBP-Gerüst hinzu.Legen Sie das Gerüst in den 37 Grad Celsius Inkubator und lassen Sie es für 15 Minuten einweichen. Nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator, entfernen Sie die Kulturmedien aus der Kulturschale, waschen Sie die Zellen vorsichtig mit zwei Millilitern warmer PBS. Entfernen Sie alle PBS aus dem Kulturgericht, und stellen Sie sicher, dass keine Flüssigkeit verbleibt.Fügen Sie der Schale zwei Milliliter zu 1,25% Trypsin-Lösung hinzu und brüten Die Zellen drei Minuten lang. Beenden Sie den Trypsin-Effekt, indem Sie zwei Milliliter Kulturmedium hinzufügen. Waschen Sie die Zellen vorsichtig von der Schale.Übertragen Sie die Zellsuspensionen in ein neues 15 Milliliter Zentrifugalrohr. Zentrifugate die Zellen bei 220-facher Schwerkraft für fünf Minuten, und erhalten Zellsedimente. Entfernen Sie den Überstand, und wischen Sie das Zellsediment ab.Setzen Sie die Zellen mit drei Milliliter 10%Saccharose-Lösung aus. Aspirieren Sie 10 Mikroliter Zellsuspension, und die Inhaltszellzahl liest ein Hämozytometer, extrahieren Sie drei Millionen Zellen und übertragen Sie in Ihrem neuen 1,5 Milliliter Zentrifugalrohr. Zentrifugate die Zellen bei 220 mal quadratischen Wurzel für fünf Minuten, vollständig entfernen die Überräube und erhalten die Zellen Sediment.Bereiten Sie 20 Mikroliter 10%Saccharose-Lösung. Die Zellen vorsichtig wieder aufhängen und eine gleichmäßige Suspension erhalten. Fügen Sie 20 Mikroliter Peptid-Hydrogel an der Oberseite der Suspension sanft mischen das Peptid Hydrogel, und die Zellen Suspension mit dem T, nehmen Sie das DBP Gerüst, verlassen Sie den Gewebeträger, und dann sanft die Calculi Median mit einem T.Aspirieren die Mischung die Mischung und gleichmäßig auf das DBP Gerüst hinzufügen.Fügen Sie einen Milliliter Calciumedetat auf den Boden des Gewebeträgers. Fügen Sie dem Kulturgericht vorsichtig vier Milliliter Kulturmittel hinzu und tauchen dann das Zellblatt auf. Legen Sie die Zellen in den Inkubator für zwei Stunden lassen Sie es Kultur.Das dynamische Perfusionssystem umfasst einen Perfusionskulturbehälter, den Gasaustausch und eine Glasflasche. Assembles sind dynamische Perfusionssysteme, wie die Abbildung zeigt. Fügen Sie zwei Hydromilliliter Kultur medians in die Glasflasche.Legen Sie das Zellblatt in die Kammer des Kulturbehälters ein, fügen Sie drei Milliliter Kulturmittel in den Behälter ein, legen Sie die dynamischen Perfusionssysteme in die Inkubatoren und beginnen Sie zu pumpen. Öffnen Sie den Kulturcontainer im bipositiven Liegerad. Nehmen Sie das Zellblatt aus dem Kulturbehälter und legen Sie es in Kulturgericht.Verwenden Sie eine Zange, um den Gewebeträger zu immobilisieren und verwenden Sie zwei weitere Zangen, um den weißen Spannungsring von der schwarzen Basis zu trennen. Schließlich erhalten Sie das mehrschichtige Zellblatt. DBP Gerüst ist transparent.Die SEM-Weiterverkäufe zeigen, dass Colleges erfasst und die Komponenten vollständig reserviert sind. Die Zellblätter können für eine kurze Konservierung durch Zange erhalten und gehalten werden. Diese Zellplatte konnte in 1,5 Milliliter Zylindriformrohr übertragen werden.Als Modell zum Beispiel beginnend mit Zelldarstellungen von BMFC'S sehr positiv für die Stammzellen Marker CD 9O und die CD 29. Nach dem Zellbau bleibt das Verlassen des Zellblattes durch die BMFC nach wie vor hohe Ausdehnungsstufen von CD 90 und CD 29. Die Erstellung der mehrschichtigen Zellstruktur ist der entscheidende Schritt des Protokolls.Die Pfannenzeit erfordert vier Hydrogel, wenn sich der PH-Wert von SA zu neutral ändert, daher ist es wichtig, die Zelle mit Saccharoselösung zu waschen, um die Oberflächenionen zu entfernen. Auch das Volumenverhältnis von Zellsuspension und Panthihydrogel ist kein guter Freund für den Aufbau der temporären Mehrschichtstruktur. Nach der Bildung der 3D-Stammzellstruktur werden Sie sehen, dass das dynamische Perfusionssystem wichtig ist, um die mehrschichtige Struktur zu stabilisieren und die Stammzellviabilitäten aufrechtzuerhalten.Die dynamische Infiltration des Kulturmedians könnte Stammzellen erleichtern, den Zellkontext innerhalb der mehrschichtigen Struktur zu vermehren und zu extrapolieren, auch die dynamischen Kulturthermometer sollten an verschiedene Stammzelltypen angepasst werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

In diesem Protokoll, zeigen wir die Herstellung eines Mikroaktor Reihe von vertikal versetzt zum Thema, die die Technologie basiert, und wie diese Basistechnologie können modifiziert werden, um High-Throughput-mechanisch dynamischen Zellkultur in beiden zweidimensionalen und dreidimensionalen Kultur durchzuführen Paradigmen.

Mikrofabrizierten Plattformen für Mechanisch Dynamische Cell Culture

Dieses Video zeigt die Entwicklung und Differenzierung menschlicher neuronaler Stammzellen innerhalb eines dreidimensionalen Gerüsts. Eine Lamininbeschichtung auf dem Gerüst fördert die Zelladhäsion, während ein wachstumsfaktorfreies neuronales Medium die Zelldifferenzierung in neurale Vorläuferzellen induziert, die ihre Prozesse innerhalb einer porösen Architektur in mehrere Richtungen ausdehnen und eine dreidimensionale Kultur...

Differenzierung menschlicher neuronaler Stammzellen in 3D-Kultur mit Hilfe eines porösen Gerüsts

Um hochorganisierte Strukturen aus komplexem Gewebe zu erzeugen, muss man mehrere Materialien und Zelltypen zu einem integrierten Komposit zusammenfügen.  Dieses kombinatorische Design umfasst organspezifische geschichtete Zellblätter mit zwei unterschiedlichen biologisch abgeleiteten Materialien, die eine starke fibröse Matrixbasis enthalten, und Endothelzellen zur Verbesserung der Bildung neuer Gefäße.

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Wir beschreiben die Herstellung von mikrostrukturierten Hydrogelplatten mit einem einfachen Prozess, der in einer freistehenden Form zusammengesetzt und manipuliert werden kann. Unter Verwendung dieser modularen Hydrogel-Platten kann ein einfaches makroskaliertes 3D-Zellkultursystem mit einer kontrollierten zellulären Mikroumgebung erzeugt werden.

Bau von Modular Hydrogel Blätter für mikrostrukturierten Makro skaliert 3D Cellular Architektur

Die Entwicklung und Analyse von tragenden Geweben mit heterogenen Zellpopulationen ist immer noch eine Herausforderung. Hier beschreiben wir eine Methode zur Herstellung von zweischichtigen Alginat-Hydrogel-Scheiben als Plattform für die Co-Kultur verschiedener Zellpopulationen innerhalb eines Konstrukts.

Layered Alginate Konstrukten: Eine Plattform für Co-Kultur von heterogenen Zellpopulationen

Chondrogenese aus Stammzellen erfordert Feinabstimmung der Kulturbedingungen. Hier präsentieren wir einen magnetischen Ansatz für Zellen Kondensation, ein wesentlicher Schritt Chondrogenese zu initiieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass dynamische Reifung in einem Bioreaktor mechanische Stimulation auf die Zellkonstrukte und verbessert knorpelige extrazelluläre Matrixproduktion gilt.

3D Magnetic Stem Cell Aggregation und Bioreactor Ausreifung für Knorpelregeneration

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur 3D-Kultur-Systeme selbst Montage Peptid Gerüste zur Förderung der Differenzierung der entdifferenzierten menschlichen Gelenkknorpel Chondrozyten Knorpel-ähnliches Gewebe zu erhalten.

Kultivierung von Säugerzellen in dreidimensionale Peptid Gerüste

Wir beschreiben eine Methode, um Geräte für die 3D-Kultur zu konstruieren und mit Zellen und multikellulären Organoiden zu experimentieren. Dieses Gerät ermöglicht die Analyse von zellulären Reaktionen auf lösliche Signale in 3D-Mikroumgebungen mit definierten Chemoattractged-Steigungen. Organoide sind besser als einzelne Zellen, wenn es um die Erkennung schwacher lauter Eingänge geht.

3D-Analyse von multizellulären Reaktionen auf tschoattraktive Verläufe

Darin demonstrieren wir ein dreistufiges Organoidmodell (zweidimensionale [2D]-Expansion, 2D-Stimulation, dreidimensionale [3D]-Reifung), das ein vielversprechendes Werkzeug für die Sehnengrundlagenforschung und eine potenziell gerüstfreie Methode für das Tendon Tissue Engineering bietet.

Demonstration einer selbstorganisierten Zellblattkultur und manuelle Generierung eines 3D-Sehnen-/Ligamenten-ähnlichen Organoids unter Verwendung humaner dermaler Fibroblasten

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Etablierung eines dreidimensionalen Kokulturmoduls von Epithelzellen unter Verwendung nanofaseriger Membranen

Lernen Sie die Konstruktion mehrschichtiger mesenchymaler Stammzell-Blätter mit einem dynamischen Perfusionskultursystem. Diese Methode verbessert die Nährstoffversorgung und die therapeutische Wirksamkeit in vivo.

Bau eines vielschichtigen mesenchymale Stammzellen-Blatt mit einem 3D dynamische Kultursystem

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