Hochauflösende gemustert Biofilm Abscheidung mittels pDawn-Ag43

Wir entwickelten eine Methode namens Biofilm-Lithographie, um Licht auf eine Oberfläche zu leuchten, und Bakterien sammeln sich dort an, wo sich das Licht befindet. Diese Methode wird es uns ermöglichen, Schlüsselfragen in der Biofilmforschung zu beantworten, zum Beispiel, wie räumliche Strukturen die Funktionen der Gemeinschaft beeinflussen. Diese Methode hat viele Vorteile.

Zum Beispiel funktioniert es mit einer sehr hohen Auflösung von 25 Mikrometer, es erfordert keine Oberflächenvormusterung, und funktioniert auch in geschlossenen Fluidi-Geräten. Obwohl diese Methode Einen Einblick in die Struktur-Funktions-Beziehung natürlicher Biofilme geben kann, kann sie auch auf andere Disziplinen wie Biofilmtechnik, Biomaterialien und mehrzellige synthetische Biologie angewendet werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da es wichtige Vorschritte gibt, um die optische Kultureinrichtung und die bakterielle Probe vor der Biofilmmusterung vorzubereiten.

Erstens, verwandeln pDawn-Ag43 Plasmid in den E.coli-Stamm von Interesse, und Platte auf eine LB Agar Platte mit Spektinomycin ergänzt. Impfen Sie eine einzelne Kolonie in LB-Brühe mit Spektinomycin in einer Kulturröhre und wachsen Sie sie in einem schütteren Inkubator bei 250 U/min und 37 Grad Celsius zur exponentiellen Phase an. Nach der Impfung einen 25%glyzerin-Bestand des pDawn-Ag43 transformierten Stammes vorbereiten, indem Sie einen Milliliter 50% steriles Glycerin mit einem Milliliter Kultur in einem Kryo-Rohr mischen.

Lagern Sie den Vorrat in einem Minus von 80 Grad Celsius Gefrierschrank. Als nächstes beginnen Sie mit der Vorbereitung des optischen Aufbaus, indem Sie einen tragbaren Projektor an der Unterseite eines bakteriellen Inkubators platzieren, wobei die Öffnung direkt nach oben an der Decke zeigt, wo die Biofilmkulturkammer angebracht wird. Schließen Sie einen Laptop über das Anzeigekabel an den Projektor im Inkubator an.

Verwenden Sie Klebeband, um eine leere Dummy-Kulturschale an der Decke des Inkubators zu befestigen. Passen Sie den Fokus auf den Projektor an, indem Sie den Fokussierknopf so drehen, dass die Fokussierebene mit der unteren Oberfläche der Anhängeplatte des Biofilm-Kulturgerichts übereinstimmt, die an der Decke des Inkubators befestigt ist. Der Projektor sollte ein scharfes, nicht verschwommenes Bild auf den Boden des Kulturgerichts beleuchten.

Entfernen Sie die Dummy-Kulturschale, sobald die Projektion optimiert wurde. Mit Laptop-Software, weisen Sie den Projektor, um das volle Sichtfeld mit maximaler blauer Beleuchtung zu beleuchten, indem Sie eine volle blaue Folie präsentieren. Messen Sie die Beleuchtungsstärke des Projektors mit einem optischen Leistungsmesser, indem Sie den Photodetektorkopf an der Inkubatordecke platzieren und die Intensität des entsprechenden Leistungsmessers auf eine Lichtwellenlänge von 460 Nanometern kalibrieren.

Passen Sie als Nächstes die Beleuchtungsstärke mit einem einstellbaren Neutraldichtefilter an der Projektoröffnung an. Drehen Sie den Filter, um die vom Leistungsmesser gemessene Beleuchtungsintensität anzupassen, bis die Beleuchtungsintensität in der Mitte des projizierten Blaulichtbereichs 50 Mikrowatt pro Zentimeter quadratisch liest. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Beleuchtungsstärke mit dem kalibrierten Photodetektor an der Inkubatordecke auf ein angemessenes Niveau eingestellt wird.

Dies ermöglicht eine genaue Abstimmung der Beleuchtungsstärke durch Drehen des Neutraldichtefilters. Zeichnen Sie nun beliebige Muster mit der Präsentationsprojektorsoftware auf dem Laptop und zeigen Sie diese Muster mit dem Projektor an der Decke des Inkubators an. Vor der Beleuchtung einen pDawn-Ag43-Stamm aus dem Glycerinbestand auf eine LB-plus-spec Agarplatte zu ziehen.

Lassen Sie die Kolonien über Nacht bei 37 Grad Celsius wachsen. Impfen Sie eine Kolonie von pDawn-Ag43-Bakterien von einer Agarplatte in LB-plus-spec Brühe, und wachsen Sie die Kultur über Nacht zu stationären Phase in einem schütteren Inkubator bei 250 U/min und 37 Grad Celsius. Am folgenden Tag subverdünnen Sie die Kultur im Verhältnis eins zu 1.000 in LB-Brühe mit Spektinomycin.

Lassen Sie die subverdünnte Kultur in einem zitternden Inkubator bei sechs Stunden bei 250 U/min und 37 Grad Celsius bis zur späten exponentiellen, frühen stationären Phase wachsen. Es ist wichtig, die Nachtkultur zurückzuverdünnen und vor der Beleuchtung zu einer späten exponentiellen Phase zu wachsen. Dadurch wird sichergestellt, dass die Bakterien bei der Induktion zuverlässig gesund und aktiv sind.

Nach der Inkubation subverdünnt die spätexponentielle Phasenkultur im Verhältnis eins zu 100 mit zuvor hergestellten M63-Medien, ergänzt durch 50-Mikrogramm pro Milliliter-Spektinomycin. Dann führen Sie die Verdünnung in ein Biofilm-Kulturgericht ein. Da die Proben nun zur Beleuchtung bereit sind, kleben Sie die Kulturschale an die Decke des Inkubators, um sicherzustellen, dass die Oberfläche an der Unterseite der Schale für die Beleuchtung von unten durch den Projektor transparent ist.

Nach dem nächtlichen Wachstum der Biofilmproben das Kulturgericht aus dem Brutkasten entfernen. Die Schale wird Biofilmbakterien an seiner unteren Oberfläche befestigt, wo es beleuchtet wurde, sowie planktonische Bakterien in den flüssigen Medien oben dispergiert. Entsorgen Sie die planktonischen Zellen, indem Sie die flüssigen Medien aus der Kulturschale entfernen.

Als nächstes spülen Sie die Probe zweimal mit PBS ab, um die verbleibenden planktonischen Zellen durch sanftePipettieren in PBS und anschließender Aspiration zu entfernen. Wenn die Zellen fluoreszierend markiert sind, stellen Sie die Proben direkt mit fluoreszenzmikroskopie ab. Wie hier zu sehen, wurden pDawn-Ag43 Bakterien verwendet, um Biofilme zu erzeugen, die in Polystyrol-Brunnenplatten mit Projektorbeleuchtung gemustert sind.

Biofilme können mit kristallvioletter Färbung oder alternativ durch Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von fluoreszierenden Bakterien visualisiert werden. Fluoreszierende Biofilmproben können auch mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet werden, um Bilder des Biofilms in 3D zu erhalten. Hochauflösende Musterung ist möglich, indem eine Filmfotomaske verwendet wird, um die Biofilmprobe mit gemusterter Ausleuchtung auszuleuchten.

Beispiele für Musteraufweise auf Glas- und PDMS-Oberflächen sowie beiliegende PDMS-Kulturkammern werden hier gezeigt und veranschaulichen die verschiedenen Arten von Umgebungen, in denen pDawn-Ag43-Muster angewendet werden können. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, zuerst pDawn-Ag43 in Ihren Interessenstamm umzuwandeln, dann Ihren Projektor richtig zu fokussieren und zu kalibrieren und schließlich die erforderlichen Kultur- und Rückverdünnungsschritte zu befolgen, um Ihre Bakterien auf die Beleuchtung vorzubereiten. Nach dieser Methode können andere Techniken eingesetzt werden, z. B. die Langzeitüberwachung von Biofilmen unter verschiedenen Kulturbedingungen.

Auf diese Weise können wir verstehen, wie sich eine Biofilmstruktur auf ihre Funktion auswirkt. Diese Technik wird weit verbreitet sein, zum Beispiel für die synthetische Biologie und Materialforschung, um Biofilme für verschiedene Anwendungen zu entwickeln.