Name: Funktionale Oberfläche-Immobilisierung von Genen mit mehrstufigen Strang Verschiebung Lithographie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Lernen Sie die Bephore-Lithographie zur Immobilisierung von Gen-DNA auf Oberflächen für zellfreie Genexpressionsexperimente. Diese reproduzierbare Methode ermöglicht Mehrschritt-Lithografie und Proteinexpression in Mikrokompartimenten.

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Wir bestätigen dankend finanziellen Unterstützung für dieses Projekt von der Volkswagen-Stiftung (Grant Nr. 89 883) und des European Research Council (Grant Agreement Nr. 694410 - AEDNA). M.S.-S. Unterstützung durch die DFG durch GRK 2062 anerkennt.

<ol><li>Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+and+assembly+on+a+biochip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip.</a> Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).</li>
<li>Jaehme, M., Michel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cell-free+protein+synthesis+for+the+crystallization+of+membrane+proteins+-+a+case+study+on+a+member+of+the+glutamate+transporter+family+from+Staphylothermus+marinus%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins - a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus.</a> The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).</li>
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<li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthetic+biology%3A+Thinking+outside+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).</li>
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<li>Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+biochemistry+molecular+purge+valve+module+that+maintains+redox+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance.</a> Nature Communications. 5 (1), 4113(2014).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762(2013).</li>
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<li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+replication%2C+synthesis%2C+and+assembly+of+the+bacteriophage+T7+in+a+single+cell-free+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction.</a> ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).</li>
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<li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li>
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<li>Pohorille, A., Deamer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+cells%3A+prospects+for+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Artificial cells: prospects for biotechnology.</a> Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).</li>
<li>Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+genetic+circuit+interactions+within+and+between+synthetic+minimal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells.</a> Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).</li>
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<li>Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergent+properties+of+dense+DNA+phases+toward+artificial+biosystems+on+a+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+Of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface.</a> Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).</li>
<li>Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+and+nanowire+assemblies+of+condensed+DNA+polymer+brushes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).</li>
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<li>Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Polymer+Brush+Patterning+through+Photocontrollable+Surface-Initiated+DNA+Hybridization+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction.</a> Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).</li>
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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenskonflikte.

Bephore Lithographie ist eine robuste und vielseitige Technik für die gemusterten Immobilisierung von DNA oder RNA. Doch das Verfahren umfasst mehrere Schritte, die - wenn geändert - möglicherweise eine Quelle für Fehler oder Leistung des Systems reduziert.
Ein entscheidender Schritt bei der Herstellung von Bephore-Chips ist die Pegylierung des Substrates, die die Biokompatibilität der Oberfläche bietet. Hier ist die Reinigung Schritt mit einem RCA-Verfahren wichtig, da es auch die Oberfläche ...

Zellfreie Genexpression, die Reaktionen von großem Interesse für die verschiedensten Anwendungen in der Biochemie, Biotechnologie und synthetische Biologie sind. Zellfreie Expression von Proteinen war maßgeblich für die Zubereitung von reines Proteinproben, die die Grundlage für zahlreiche Studien in der Strukturbiologie waren. Zum Beispiel zellfreien Systemen erfolgreich die Expression des Proteins komplexe1 oder Membran Proteine2, dienten die sind schwer zu produzieren, mit zellbasierten Ausdruck. Insbesondere zellfreie Genexpression, die Reaktionen auch verwendet wurden, um die Struktur des genetischen Codes, beginnend mit der bahnbrechenden Experimente durch Nirenberg und Matthaei in 19613aufzuklären.
Vor kurzem gab es ein erneutes Interesse an zellfreien Methoden in der Biotechnologie und synthetische Biologie4,5,6. Zellfreie Systeme können mit nicht-biologischen Verbindungen verstärkt werden, und Komponenten der verschiedenen biologischen Ursprungs können leichter7kombiniert werden. Obwohl zellfreien Systemen den scheinbaren Nachteil haben, den sie nicht "wachsen und sich teilen", ist es denkbar, bereiten Sie offene zellfreie Bioreaktoren mit grundlegenden Funktionen des Stoffwechsels und lassen sie synthetisieren Metaboliten mit einfachen Kohlenstoff und Energie Eingänge8. In dem aufstrebenden Gebiet der synthetischen Biologie verspreche zellfreien Systemen, ein berechenbarer "Chassis" für die Umsetzung von synthetischen biologischen Funktionen.
Derzeit, zellfreie gen Ausdruck Reaktionen erfolgen entweder mit Zelle extrahiert (aus verschiedenen Quellen wie Bakterien, Hefe, Insekten), oder Transkription/Translation-Systeme für unterschiedliche Anwendungen (z. B. optimiert wurden prokaryotische vs. eukaryotischen Genexpression, Herstellung von Membranproteinen, etc.). Ein häufig verwendetes Protokoll, für die Vorbereitung der Bakterienzelle Extrakt (allgemein als TXTL bezeichnet) wurde vor kurzem von V. Noireaux und Kollegen9bereitgestellt. Seine biophysikalischen Eigenschaften wurden gründlich gekennzeichnet10, und das TXTL-System wurde bereits erfolgreich eingesetzt, eine Reihe von komplexen biochemischen Aufgaben durchzuführen: z. B. die Montage der funktionalen Bakteriophagen über zellfreie Ausdruck von Phagen Genom11, die Synthese der bakteriellen Protein Filamente12oder die Umsetzung von zellfreien gen Schaltungen13,14.
Beliebt in zellfreien synthetische Biologie ein anderes System ist das reine System, das aus gereinigten Komponenten15,16wieder hergestellt ist. Im Vergleich zu den TXTL-System, enthält es keine Nukleasen oder Protein-Abbau-Maschinen. Beim Abbau von linearen DNA RNA-Moleküle oder Proteine ist weniger ein Problem in der reinen System Verfall Wege sind wirklich wichtig für die Durchführung von dynamischen Funktionen. Um die Wirkung der Exonuclease Verschlechterung der linearen gen Vorlagen im TXTL System (durch RecBCD) zu verringern, hat das Ende schützen GamS Protein hinzugefügt werden. Die TXTL und das reine System sind im Handel erhältlich.
Ein Thema eng mit zellfreien Biologie betrifft die Studie über die Wirkung der Abschottung auf biochemischen Reaktionen, und weiter die Schaffung von künstlichen Zelle Strukturen oder Protozellen17,18,19 ,20. Forschung über künstliche Zellen umfasst in der Regel die Kapselung der eine biochemische Reaktion-System im Inneren vesikuläre Fächer aus Phospholipiden oder andere amphiphilen hergestellt. Während solcher Systeme helfen, um grundlegende Aspekte der Abschottung oder die Entstehung der Zellularität und selbstreplizierende Strukturen zu erkunden, sie konfrontiert die typischen Probleme von geschlossenen Systemen: in Ermangelung von einem funktionierenden Stoffwechsel und entsprechende Membran-Transport-Mechanismen, es ist schwierig, unterteilte Reaktionen laufen über einen längeren Zeitraum hinweg zu - Kraftstoff Moleküle sind aufgebraucht und Abfallprodukte sammeln.
Eine interessante Alternative zur Abschottung innerhalb dieser Zelle imitiert Fächer ist die räumliche Organisation des genetischen Materials mit photolithographische Methoden. Immobilisierung von "Gene auf einem Chip" wurde erstmals von der Bar-Ziv-Gruppe am Weizmann-Institut vor mehr als zehn Jahren21. Zu den wichtigen Fragen, die gelöst werden mussten waren die unspezifische Adsorption von DNA und die potenziellen Denaturierung der Proteine auf der Chipoberfläche. Bar-Ziv Et Al. entwickelt eine dedizierte Photolithographie Resist bezeichnet "Daisy", bestehend aus einer reaktiven terminal Silan für Immobilisierung der Resist Moleküle auf Siliziumdioxid Oberflächen eine lange Polyethylenglykol (PEG) Abstandhalter war, die versicherte Biokompatibilität und eine Photocleavable Headgroup, die in einem reaktiven Amin bei Bestrahlung mit ultraviolettem (UV) Licht umgewandelt wurde. Es hat sich gezeigt, dass Daisy verwendet werden kann, um gen-Länge DNA-Moleküle (mit einer Länge von mehreren Kilo Basenpaare (Kbp)) auf einem Chip-Oberfläche zu immobilisieren. Aus einem Polymer Physik Standpunkt vertreten die Systeme Polymer Bürsten ein festes Substrat aufgepfropft. Polyelektrolyten aufgrund der DNA ist die Konformation dieser Bürsten osmotische und andere Ionen-spezifische Effekte22,23stark betroffen.
Am wichtigsten ist, hat sich gezeigt, dass Substrat immobilisiert Gene noch funktionsfähig sind und können transkribiert und übersetzt in RNA und Protein. Gen Bürsten sind für RNA-Polymerasen von Lösung24zugänglich, und die komplexe makromolekulare Mischung der Transkription/Übersetzung ist an der Oberfläche nicht denaturiert. Einer der Vorteile der Immobilisierung von genetischen Komponenten auf einem Substrat ist, dass sie in einem offenen mikrofluidischen Reaktorsystem betrieben werden können, die kontinuierlich zugeführt wird, mit kleinen Vorläufer Moleküle und die Abfallprodukte entfernt25 sein kann , 26.
Kürzlich entwickelten wir eine Variante dieser Methode bezeichnet Bephore (für biokompatible Elektronenstrahl und Fotolack)27, die beruhte ausschließlich auf handelsübliche Komponenten und Sequenz-spezifische DNA-Strang Invasion Reaktionen genutzt die Realisierung eines einfach zu implementierende multistep Lithographie-Verfahrens für die Erstellung von Chip-basierte künstliche Zellen. Eine schematische Übersicht des Verfahrens ist in Abbildung 1dargestellt. Es basiert auf DNA-Haarnadel Moleküle mit einer Photocleavable Gruppe, die auf eine biokompatible PEG-Schicht immobilisiert sind. Photocleavage der Haarnadel stellt eine einsträngige Brückenkopf-Sequenz, durch welche, die DNA Moleküle des Interesses (mit der "verdrängt" DIS-Sequenz) angeschlossenen über Brückenkopf-vermittelten Strang Invasion sein können.
Während Bephore möglicherweise einfacher zu implementieren ist, Daisy erlaubt die Realisierung von sehr dicht und sauber "gen Bürsten", die in bestimmten Anwendungen Vorteile hat. Im Prinzip könnte aber Daisy und Bephore Lithographie leicht kombiniert werden. Eine verwandte Lithografie Methode nutzen, die DNA-Strang Verschiebung zur Strukturierung von DNA auf Gold Bürsten wurde zuvor von Huang Et Al.entwickelt, aber war nicht im Zusammenhang mit der zellfreien gen Ausdruck28,29eingesetzt.
Im folgenden Protokoll liefern wir Ihnen eine detaillierte Beschreibung der Herstellung von DNA für zellfreie Genexpression mithilfe der Bephore-Methode Bürsten. Wir beschreiben, wie die gen-Chips werden hergestellt und zeigen die Verwendung von mehrstufigen Foto-Lithografie für die räumlich strukturierten Immobilisierung von Genen auf einem Chip. Wir diskutieren auch die Fertigung der Reaktionskammern und die Anwendung der Mikrofluidik für die Erfüllung der auf dem Chip gen Ausdruck Reaktionen.

<table><tbody><tr><td>Siliziumwafer mit 50 nm Siliziumdioxid (Bephore-Substrat)</td><td>Siegert Waferdicke</td><td></td><td>(&micro; m): 525 &plusmn; 25, Durchmesser (mm): 100</td></tr><tr><td>Siliziumwafer (für PDMS Master Mold)</td><td>Siegert Wafer Dicke</td><td></td><td>(&Mikro; m): 525 &plusmn; 25, Durchmesser (mm): 76,2 (3")</td></tr><tr><td>Objektträger Nr. 4</td><td>Menzel</td><td></td><td>22 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>Objektträger Nr. 1,5</td><td>Assistent</td><td></td><td>24 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>Biotin-PEG-Silane</td><td>Laysan Bio</td><td></td><td>MW 5.000</td></tr><tr><td>Wasserfreies Toluol</td><td>Sigma Aldrich (Merck)</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>S888</td><td></td></tr><tr><td>DNA</td><td>Integrated DNA Technologies ( IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix mit HF-Puffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M0531S</td><td>PCR-Kit</td></tr><tr><td>Wizard SV Gel und PCR-Aufreinigungssystem&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>Spin-Säulen-PCR-Aufreinigungskit</td></tr><tr><td>PURExpress</td><td>New England Biolabs</td><td>E6800S</td><td>Zellfreies Expressionssystem</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Slygard 184</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>F8771</td><td></td></tr><tr><td>PTFE-Schlauch (ID: 0.8mm, AD: 1.6 mm)</td><td>Bola</td><td>S 1810-10</td><td></td></tr><tr><td>EpoCore 20</td><td>Mikroresist-Technologie&nbsp; GmbH</td><td></td><td>Photoresist</td></tr><tr><td>mr-Dev 600</td><td>Mikrolack-Technologie&nbsp; GmbH</td><td></td><td>Fotolackentwickler</td></tr><tr><td>Ti-Prime</td><td>MicroChemicals</td><td></td><td>Haftvermittler</td></tr><tr><td>Zweikomponenten-Silikonkleber</td><td>Picodent</td><td>Twinsil&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gelbe Folie mit UV-Schutz</td><td>Lithoprotect (via MicroChemicals)</td><td>Y520E212</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Masken für die Fotolithographie</td><td>Zitzmann GmbH</td><td></td><td>64.000 dpi, 180x240 mm</td></tr><tr><td>Aufrechtes Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td>Photolithographie und Fluoreszenzbildgebung</td></tr><tr><td>60x Wasserimmersionsobjektiv</td><td>Olympus</td><td>LumPlanFl</td><td>Verwendet mit Olympus BX51, NA 0,9</td></tr><tr><td>20x Wasserimmersionsobjektiv</td><td>Olympus</td><td>LumPlanFl</td><td>Verwendet mit Olympus BX51, NA 0,5</td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Photometrie</td><td>Coolsnap HQ</td><td>Verwendet mit Olympus BX51</td></tr><tr><td>Lichtquelle</td><td>EXFO</td><td>X-Cite 120Q</td><td>Verwendet mit Olympus BX51</td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Ti2-E</td><td>Fluoreszenz Bildgebung der Genexpression</td></tr><tr><td>4x Objektiv</td><td>Nikon</td><td>CFI P-Apo 4x Lambda</td><td>Verwendet mit Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Andor</td><td>Neo5.5</td><td>Verwendet mit Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td>Lichtquelle</td><td>Lumencor</td><td>SOLA SM II</td><td>Verwendet mit Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td>Käfig-Inkubator</td><td>Okolab</td><td>bold line</td><td>Verwendet mit Nikon Ti2-E</td></tr><tr><td>Druckregler</td><td>Elveflow</td><td>OB1 MK3</td><td></td></tr><tr><td>NanoPhotometer</td><td>Implen</td><td></td><td>DNA-Konzentrationsmessung</td></tr><tr><td>Plasmareiniger</td><td>Diener</td><td>Femto</td><td>200 W, betrieben bei 0,8 mbar mit der Probe in einem Faradayschen Käfig</td></tr></tbody></table>

funktionale oberfläche-immobilisierung von genen mit mehrstufigen strang verschiebung lithographie

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Immobilisierung von Genen auf lithographically strukturierte Oberflächen ermöglicht die Untersuchung der unterteilte gen Ausdruck Prozesse in einem offenen mikrofluidischen-Bioreaktor-System. Im Gegensatz zu anderen Ansätzen hin zu künstlichen zellulären Systemen erlaubt solch eine Einstellung für eine kontinuierliche Versorgung mit gen-Ausdruck-Reagenzien und gleichzeitige Entleerung von Abfallprodukten. Dies erleichtert die Umsetzung der zellfreien gen Ausdruck Prozesse über einen längeren Zeitraum der Zeit, die für die Realisierung von dynamischen gen regulatorischen rückgekoppelte Systeme wichtig. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von genetischen Biochips mit einer einfach zu bedienenden lithographische Technik basierend auf DNA-Strang Versetzung Reaktionen, die ausschließlich handelsübliche Komponenten verwendet. Wir bieten auch ein Protokoll über die Integration der unterteilte Gene ein Polydimethylsiloxan (PDMS)-basiertes mikrofluidischen System. Darüber hinaus zeigen wir, dass das System mit Totalreflexion (TIRF) Fluoreszenzmikroskopie, vereinbar ist, für die direkte Beobachtung der molekularen Wechselwirkungen zwischen DNA und Moleküle in der Mischung Ausdruck verwendet werden kann.

Zweistufige Lithographie: Abbildung 5 zeigt das Ergebnis der lithographischen Schritten auf einem Objektträger mit überlappenden Mustern Eindringmittel beschrifteten DIS Stränge.
Ausdruck eines fluoreszierenden Proteins aus einer gen-Bürste: Abbildung 6 zeigt den Ausdruck der fluoreszierenden Proteins YPet von immobilisierten DNA. An mehreren Stellen in der Zeit, dass w...

Wir beschreiben ein einfaches lithographischen Verfahren für die Immobilisierung von gen-Länge DNA-Molekülen auf einer Fläche, die zur zellfreien gen Ausdruck Experimente auf Biochips durchführen können.

Funktionale Oberfläche-Immobilisierung von Genen mit mehrstufigen Strang Verschiebung Lithographie

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

DNA-Biochips sind eine attraktive Forschungsplattform für die selbstresynthetische Biologie, die ursprünglich von der BASF-Gruppe entwickelt wurde und den Betrieb von In-vitro-Genkreisläufen über einen längeren Zeitraum ermöglicht. Mit diesem Protokoll hoffen wir, diese Technologie einer breiteren Palette von Forschern zur Verfügung zu stellen. Unsere Methode, die als bephore Lithographie bezeichnet wird, stellt eine Strategie zur Immobilisierung der DNA dar, die auf der DNA-Strangverschiebungsreaktion basiert.Die Stärke dieser Technik liegt in ihren mehrstufigen lithographischen Fähigkeiten, ihrer einfachen Reproduzierbarkeit und der kommerziellen Verfügbarkeit aller Komponenten. Ähnlich wie bei anderen Biochip-Lösungen kann bephore mit verschiedenen Technologien kombiniert werden. Zum Beispiel können funktionelle Genbürsten in Mikrokompartimenten zur Proteinexpression zusammengesetzt werden.Zunächst bereiten Sie eine RCA-Mischung vor, indem Sie fünf Teile Wasser mit einem Teil einer 30%ammoniak Lösung in einem Glasbecher mischen. Erhitzen Sie die Mischung auf 70 Grad Celsius auf einer heißen Platte unter Rühren. Sobald es 70 Grad Celsius erreicht, fügen Sie einen Teil 30% Wasserstoffperoxid.Legen Sie dann einen Siliziumwafer mit einem Durchmesser von 100 Millimetern in die Lösung, um organisches Material und Partikel daraus zu entfernen. Nach 30 Minuten das Substrat herausnehmen, gründlich mit Wasser aus einer Waschflasche abspülen und mit einer Stickstoffpistole trocknen. Gehen Sie sofort mit der PEGylation des Substrats fort.Um dies zu erreichen, zuerst biotin-PEG-Silane in trockenem Toluen auf 5 Milligramm pro Milliliter verdünnen, und Wirbel die Lösung, bis es gut gemischt ist. Mit dem Substrat in einem Glas Petrischale platziert, langsam Pipette die Lösung auf das Substrat, die gesamte Oberfläche abdecken, aber vermeiden Sie, dass die Lösung über die Kante fließen. Sobald die Oberfläche bedeckt ist, schließen Sie die Petrischale, und fügen Sie dann eine zusätzliche Abdeckung hinzu.Nach 30 Minuten die Abdeckung entfernen und etwa 40 Milliliter Isopropylalkohol in die Petrischale geben. Dann nehmen Sie das Substrat heraus, spülen Sie es wieder gründlich mit Isopropylalkohol ab und trocknen Sie es mit einer Stickstoffpistole. Wenn Sie trocknen, lagern Sie das Substrat im Dunkeln, bis es benötigt wird.Bereiten Sie ein Substrat vor, indem Sie einen Glasschneider oder ein Skalpell verwenden, um einen Zentimeter mal einen Zentimeter Stücke zu bilden. Fügen Sie dann eine einfache Ausrichtungsmarkierung hinzu, indem Sie einen kurzen Kratzer von der Mitte in Richtung einer Kante des Substrats machen. Blasen Sie alle kleinen Partikel vom Chip mit einer Stickstoffpistole.Als nächstes mischen Sie zwei Tröpfchen eines Zweikomponenten-Silikonklebers, und tragen Sie den Kleber auf die Oberfläche des Chips auf, so dass der Bereich um die Spitze des Kratzers leer bleibt. Dort sorgt der Kleber für eine hydrophobe Barriere, die wässrige Lösungen auf dem Chip hält. Dies erleichtert nachfolgende Waschschritte und reduziert die Menge an DNA, die für Inkubationen benötigt wird.In einem späteren Schritt kann der Kleber leicht abgeschält werden. In den folgenden Schritten wird photokleavable DNA nur in einer gelben Lichtumgebung behandelt. Bedecken Sie den Chip mit ca. 10 Mikrolitern einer Bephore-Mischung bei Raumtemperatur, und legen Sie den Chip in eine Box, die teilweise mit Wasser gefüllt ist, um die Verdunstung zu reduzieren.Waschen Sie den Chip nach einer Stunde mehrmals mit PBS, um alle ungebundenen Bephore-Mix zu entfernen. Als nächstes fügen Sie 10 Mikroliter der Passivierungsmischung zum Chip hinzu. Waschen Sie den Chip nach zwei Stunden mehrmals mit PBS, um die ungebundenen Passivierungsmittel zu entfernen.Schneiden Sie eine gedruckte Fotomaske auf die entsprechende Größe, um einen geeigneten Maskenhalter zu passen. Legen Sie es an der Position des Feldstopps ein, und verwenden Sie die Ausrichtungsmarkierungen, um die Maske im Halter auszurichten. Wenn das Substrat auf der Mikroskopie-Bühne platziert ist, legen Sie einen roten Filter in den Beleuchtungspfad ein und konzentrieren Sie sich auf die Substratoberfläche.Navigieren Sie dann zum Bereich des Substrats, der freigelegt wird. Als Nächstes legen Sie den Maskenhalter ein, blockieren die Beleuchtung, und wechseln Sie zum UV-Filter. Öffnen Sie bei geringer Lichtintensität den Verschluss, und verwenden Sie die Kamera, um die Maske schnell auf das Substrat zu fokussieren.Wenn das Substrat nun ausgerichtet ist und die Maske im Fokus steht, blockieren Sie den Lichtpfad zur Kamera und beleuchten Sie das Substrat mit hoher Lichtintensität für die gewünschte Belichtungszeit. Nach der Exposition entfernen Sie die Probe aus dem Mikroskop und entfernen Sie vorsichtig so viel Puffer wie möglich aus dem Substrat, ohne es zu trocknen. Fügen Sie dann 10 bis 20 Mikroliter DNA mit der Sequenz zur Befestigung an der Oberfläche hinzu.Legen Sie das Substrat in eine nasse Box, um es vor dem Trocknen zu bewahren, und brüten Sie die DNA für zwei Stunden bei Raumtemperatur auf dem Substrat. Um die kompartummierte Genexpression auf einem invertierten Mikroskop zu beobachten, bereiten Sie zunächst die beiden Teile des Probenhalters getrennt vor. Beginnen Sie mit dem Kleben eines Bephore-Chips mit einer immobilisierten Genbürste auf den Chiphalter mit doppelseitigem Klebeband.Als nächstes fügen Sie etwas Vakuumfett um das zentrale Loch des unteren Teils des Halters, und legen Sie den Spanhalter. Montieren Sie nun den oberen Teil des Halters. Schneiden Sie einen dünnen PDMS-Chip mit so kleinen Fächern wie möglich, so dass ein Kanal zur Seite offen bleibt, um später den Austausch von Abfällen und Vorläufermolekülen durch Diffusion zu ermöglichen.Platzieren Sie den PDMS-Chip unmittelbar nach der Behandlung in der Mitte des Glasschlittens, wobei die Fächer nach oben zeigen. Dann backen Sie das Glas mit dem PDMS für eine Stunde bei 70 Grad Celsius. Kurz vor der Montage des gesamten Probenhalters den Glasschlitten wie bisher mit dem PDMS-Chip zu behandeln.Fügen Sie dann etwas Vakuumfett um das große Loch des oberen Halters hinzu und legen Sie den Glasschlitten mit dem PDMS darauf. Drücken Sie das Glas vorsichtig auf das Fett. Entfernen Sie den Puffer vorsichtig vom Chip und waschen Sie ihn einmal mit 10 Mikrolitern Selbstausdruckssystem.Als nächstes fügen Sie 60 Mikroliter Selbstausdruckssystem auf den Chip, und entfernen Sie den Zweikomponenten-Silikonkleber von den Rändern. Fügen Sie nun 20 Mikroliter des Expressionssystems auf das PDMS ein. Nachdem Sie das Tröpfchen auf das PDMS legen, überprüfen Sie schnell im stereoskopischen Mikroskop, ob die Fächer gut nass und ohne Luftblasen sind.Wenn es Luftblasen gibt, versuchen Sie, sie wegzuwaschen. Um die beiden Teile des Halters zu montieren, und um Kammern und DNA-Pinsel auszurichten, arbeiten Sie unter einem stereoskopischen Mikroskop. Immobilisieren Sie den unteren Halter mit einem Greifarm, so dass die beiden Schrauben und Flügelmuttern mit beiden Händen leicht zugänglich sind.Setzen Sie den oberen Halter in den unteren Halter ein, und senken Sie ihn, bis die Tröpfchen des Zellfreien Ausdrucks systems verschmelzen. Überprüfen Sie dann, ob sich die Fächer und die Ausrichtungsmarkierung in einem ähnlichen Bereich in der XY-Ebene befinden. Von unten die Wingnuts verschrauben, bis sie die Unterseite des Halters berühren.Ziehen Sie beim Ausrichten der Fächer und des Chips in der XY-Ebene die Wingnuts vorsichtig fest. Dieser Schritt erfordert einige Erfahrung und hängt von der Konstruktion des Probenhalters ab. Das PDMS sollte nur mit sanfter Kraft auf den Chip gedrückt werden.Als nächstes einen Schwamm in das Anti-Verdunstungsgehäuse mit Wasser sprühen und den Halter in die Box einlegen. Dann füllen Sie eine Fünf-Milliliter-Spritze mit Zweikomponenten-Silikonkleber, und verwenden Sie es, um die Box zu versiegeln. Übertragen Sie schließlich die Box an ein temperaturgesteuertes Mikroskop und stellen Sie die DNA-Pinsel und die Reaktion mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie ab.Ein zweistufiger lithographischer Prozess, der hier auf einer bephore Glasrutsche durchgeführt wird, ergibt sich überlappende Muster fluoreszierend markierter DNA-Stränge. Bei dieser Demonstration der On-Chip-Genexpression wird die DNA in der Kammer auf der linken Seite immobilisiert. Wenn das gelbe fluoreszierende Protein YPet dem Expressionsmix ausgesetzt ist, wird es aus der immobilisierten DNA synthetisiert.Um die Aktivität des Genexpressionssystems zu bewerten, wird die Wiederherstellung der Fluoreszenz nach einem Bleichschritt beobachtet. Nach zwei Stunden erholte sich die Fluoreszenzintensität schnell. Nach vier und sechs Stunden erholte sie sich jedoch nicht, was darauf hindeutet, dass die Reaktion ohne eine neue Zufuhr des Ausdrucksmixes um Stunde vier endete.Obwohl die Genexpression in einem geschlossenen System begrenzt ist, kann sie über längere Zeiträume aufrechterhalten werden, indem die Expressionskompartimente über Mikrofluidik mit zusätzlichen Vorläufermolekülen versorgt werden. Die Bephore-Methode wird verwendet, um Oligonukleotide oder Genlängen-DNA zu immobilisieren, die angewendet werden können, um Systeme interagierender DNA-Pinsel für die Selbst-Re-Gen-Expression zu konstruieren. Die Technik kann auch für andere Anwendungen in der Biophysik verwendet werden, wie z. B. Fluoreszenzstudien mit Einzelmolekülen.Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie in der Lage sein, Bephore-Biochips aus Wafern oder Glasdias herzustellen und in Ihre Forschungsprojekte zu integrieren.

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Biotechnik

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