Name: 建立与艾滋病毒相关的肝脏发病机制的双人性化TK-NOG小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 s
Description: 了解利用人脐带血CD34+造血干细胞和人肝细胞构建双人性化TK-NOG小鼠模型的方法。该模型可用于研究HIV-1感染引起的肝脏免疫病理机制及疾病进展。

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本工作由美国国立卫生研究院资助项目R24OD018546（资助对象：L.Y.P. 和 S.G.）支持。作者感谢Weizhe Li博士在手术操作方面的帮助，感谢Amanda Branch Woods理学学士、Yan Cheng在免疫组织化学方面的协助，感谢内布拉斯加大学医学中心（UNMC）流式细胞术研究设施的负责人Phillip Hexley博士、Victoria B. Smith理学学士和Samantha Wall理学学士，以及UNMC高级显微镜核心设施的Janice A. Taylor理学学士和James R. Talaska理学学士提供的技术支持。作者感谢CIEA的Mamoru Ito博士和Hiroshi Suemizu博士提供TK-NOG小鼠，感谢Joachim Baumgart博士提供白消安。作者感谢UNMC的Adrian Koesters博士在稿件编辑方面所做的贡献。

本方案已获得内布拉斯加医学中心大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）&#160;的批准。
注意：在对动物进行实验之前，须获得当地动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 脐带血的处理及人HSPCs的分离
<ol>
	<li>在超净工作台内，所有步骤均需在无菌条件下进行。</li>
	<li>取肝素抗凝管采集的脐带血，加入磷酸盐缓冲液（PBS）将体积补至35 mL。按图示方法将样品叠加于淋巴细胞分离液（LSM）上层 图1 并以400 × g离心LSM与分层CB的混合物 x g 4 °C 下离心 35 分钟，不使用刹车。 
	注意：应小心轻柔地稀释血液，以避免在界面处发生混合。&#160;</li>
	<li>小心移除上层LSM和血浆层，用移液管将白色的血沉棕黄层界面转移至新管中。</li>
	<li>将白膜层重悬于30–40 mL预冷缓冲液（PBS + 0.5% 牛血清白蛋白[BSA] + 2 mM 乙二胺四乙酸[EDTA]）中。用移液器将20 µL细胞悬液与20 µL 0.4%台盼蓝混合，再吸取10 µL混合液加入细胞计数板两个计数室中任意一个的外侧加样口，随后将计数板插入自动细胞计数仪进行细胞计数。 
	注意： 所有步骤均使用冰冻缓冲液，因其有助于保持细胞活性。</li>
	<li>以 300 x g 4 °C下离心10分钟，小心吸除上清液。随后加入300 µL预冷缓冲液。</li>
	<li>加入100 µL人Fc受体封闭试剂和100 µL与单克隆小鼠抗人CD34抗体偶联的微珠，适用于最多1 x 10⁸个细胞8 细胞（参见 材料表）。在 4 °C 下孵育 30 分钟，加入 10 mL 预冷缓冲液洗涤细胞，然后在 300 x g 4 °C 下离心 10 分钟。 
	注意： 根据细胞数量按比例放大，若细胞数量超过 1 x 108 细胞存在。</li>
	<li>小心吸除上清液，将沉淀重悬于500 µL缓冲液中，随后进行磁分离步骤以富集HSPCs。</li>
	<li>放置一个阳性选择LS柱（参见 材料表) 在磁性激活细胞分选磁场中用 3 mL 缓冲液冲洗并使其流过。</li>
	<li>将样本加载至LS柱中，该柱可捕获样本中与人CD34+结合的微珠，让样本在重力作用下流入收集管。</li>
	<li>用缓冲液洗涤柱子3次，并将洗脱液收集到CD34的同一收集管中- 细胞比例</li>
	<li>用5 mL缓冲液冲洗柱子以洗脱CD34+ 细胞转移至新的收集管中。重复该步骤以获得所需的纯度 &#62;90%.</li>
	<li>计数洗脱的 CD34+ 使用台盼蓝染色法在血细胞计数板中对细胞进行计数。计数后，离心 CD34+ 300 × 下的细胞 g 5 分钟后弃去上清液。</li>
	<li>重悬 CD34+ 25 µL PBS 中的细胞，用于立即进行移植注射&#160;或以1-2×10⁶个/mL的浓度将细胞悬浮于冻存液（RPMI 1640培养基 + 50%胎牛血清（FBS）+ 10%二甲基亚砜 [DMSO]）中，进行冻存，以备后续移植使用。 
	注意： 移植前务必重新计数活细胞。</li>
	<li>检测CD34的纯度+ 洗脱后，取50 µL悬浮液，加入10 µL PE标记的抗人CD34抗体，于4 °C孵育30分钟。抗体孵育结束后，用PBS洗涤染色细胞，重悬于100 µL PBS中，随后进行流式细胞术分析。另设一管不加抗体的细胞，用于在流式细胞仪中设定门控。</li>
	<li>采集后，通过在前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）图上选择感兴趣区域，随后在FSC-面积与FSC-高度图上对单细胞进行设门，以分析数据。在单细胞群体中，基于PE通道与SSC-面积图对CD34阳性细胞进行设门。</li>
</ol>
2. 人肝细胞移植前的制备
<ol>
	<li>从液氮中取出冷冻保存的肝细胞，迅速将冻存管浸入水浴中，解冻约 90 - 120 秒。</li>
	<li>打开冻存管盖，将解冻后的肝细胞倒入盛有预温解冻培养基的 50 mL 锥形管中。</li>
	<li>用手轻轻晃动 50 mL 管数秒，使细胞重悬。 
	注意：切勿使用涡旋振荡器。</li>
	<li>在室温下以 100 × g 离心 8 分钟，使细胞沉淀。用含 0.1% BSA 的 PBS 洗涤细胞沉淀，并将细胞与新鲜或解冻的 HSPCs（比例为 10:1）在 PBS 中混合，终体积为每只小鼠 80 µL。</li>
</ol>
3. 人HSPC和肝细胞移植的动物操作、筛选、基因分型及处理
<ol>
	<li>动物操作
	<ol>
		<li>由于严重的免疫缺陷，需在无菌条件下饲养和操作TK-NOG小鼠。</li>
		<li>始终穿戴实验服、手套、鞋套和口罩，以防止感染可能存在的致病微生物。</li>
		<li>手术过程中使用无菌手套和器械，并全程以无菌操作方式处理动物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择用于实验的TK-NOG小鼠
	<ol>
		<li>通过将雌性TK-NOG小鼠与雄性非TK-NOG同窝小鼠交配繁殖来维持TK-NOG品系群体，并通过基因分型筛选转基因子代。 
		注意： 进行基因分型（见步骤3.3），以确定断奶时新生雄性和雌性小鼠中转基因的存在与否。</li>
		<li>选择6至8周龄的雄性小鼠进行移植，因其对GCV介导的表达HSV-TK转基因肝细胞的清除具有高度敏感性21.</li>
		<li>在断奶或手术时对小鼠进行耳标标记以便识别。记录动物的体重和健康状况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用定量实时聚合酶链式反应对HSV-TK转基因的存在进行基因分型
	<ol>
		<li>在断奶时（通常为3至4周龄）进行基因分型。基因分型时，在超净台中剪取小鼠耳组织以保持无菌，随后使用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。</li>
		<li>扩增从耳组织提取的基因组DNA&#160;在20 µL反应体系中，加入1 µL上游引物5'-CCATGCACGTCTTTATCCTGG-3'、1 µL下游引物5'-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3'、0.5 µL FAM探针5′-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3'以及10 µL预混液，于实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪中进行扩增，以检测人白蛋白启动子调控的HSV-TK转基因22.</li>
		<li>设定实时 PCR 程序如下：60 °C 预读阶段 30 s，95 °C 保持阶段 10 min，40 个循环（95 °C 变性 15 s，60 °C 退火延伸 1 min），60 °C 后读阶段 30 s。 
		注意： Ct值低于22被认定为HSV-TK转基因阳性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用更昔洛韦和曲奥舒凡的治疗
	<ol>
		<li>使用27 G针头，在手术前第7天和第5天，每天两次向TK-NOG小鼠腹腔注射更昔洛韦（GCV）（6 mg/kg），每次注射体积为100 µL生理盐水，以清除小鼠体内的转基因实质细胞（如实验策略图所示） 图2)23.</li>
		<li>手术前第3、2、1天，使用27 G针头，以生理盐水配制非清髓性剂量的曲奥舒凡（treosulfan，1.5 g/kg/天），每只小鼠腹腔注射100 µL进行预处理。</li>
		<li>手术前一天，使用5 mm采血针穿刺下颌静脉，采集2至3滴（约100 µL）血液，通过离心（1,500 x g 4 °C 下离心 10 分钟，用于丙氨酸氨基转移酶（ALT）检测，以评估肝损伤程度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术准备
	<ol>
		<li>手术前，使用剪毛器剃除小鼠切口部位（腹壁左侧）周围的毛发。</li>
		<li>使用小鼠麻醉机，在诱导室中将氧气流速调节至1 L/min，异氟烷流速调节至3%–5%。每次将一只小鼠放入诱导室中进行麻醉。</li>
		<li>将无菌延长管的一端（悬液容纳量为 550 µL；参见 材料表 将一端（按规格）连接至30 G针头，另一端连接至1 mL注射器。</li>
		<li>用移液器吸取混合的HEPs和HSPCs悬液（每只小鼠80 µL，见第2节），将注射器安装至重复移液器的卡槽中，并调节分液器使每次按压释放10 µL。</li>
		<li>小鼠麻醉后（通常在3 - 4分钟后），将异氟烷气流切换至鼻罩，并将异氟烷流速调至2% - 3%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠脾内移植人HSPCs与肝细胞
	<ol>
		<li>所有手术步骤均应在层流柜中无菌条件下进行。</li>
		<li>在工作台面上铺上干净的无菌巾，用10%聚维酮碘对每只小鼠身体左侧进行擦拭，随后使用70%异丙醇消毒，然后进行切口操作。</li>
		<li>在腹壁左侧，使用Vanna型剪刀在皮肤、肌肉和腹膜上做一个小切口（长约1～1.5 cm，深约5 mm），切口位置位于肋缘下缘下方约5 mm处，以进入腹腔。</li>
		<li>找到脾脏，用镊子将其轻轻拉至操作区域以便于接触，然后将30 G针头插入脾脏下极。</li>
		<li>松开移液器的推杆，每次分配10 µL，每只脾脏的总量限制在60–80 µL。缓慢撤出针头，使用结扎器以结扎夹夹闭脾脏。</li>
		<li>用无菌 PBS 润湿的棉签将脾脏推回体腔内。&#160;</li>
		<li>使用可吸收缝线缝合腹壁的肌层&#160;间断缝合模式（非连续缝合）。使用不可吸收缝线以间断缝合模式完成皮肤闭合。</li>
		<li>使用温水循环垫以防止小鼠术后体温过低。</li>
		<li>术后10-14天拆除不可吸收缝线。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术后护理
	<ol>
		<li>当移植动物苏醒后，以0.1 mg/kg剂量经腹腔注射布托啡诺镇痛剂，连续3天，每天2次。</li>
		<li>每天至少观察动物一次，直至其恢复至正常的生理状态。 
		注意： 检查每只动物的体重，因为部分小鼠术后可能会出现体重下降。小鼠通常在术后1至2周内恢复至原始体重。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 通过ELISA法验证人肝脏的移植效果及通过流式细胞术验证人免疫系统
注意：移植后1个月起，每月分别通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和流式细胞术评估人肝组织和免疫系统的重建情况。
<ol>
	<li>使用采血针从颌下静脉采集血液样本至含EDTA的采血管中，于4 °C条件下以1,500 × g离心10分钟。分离血清，使用人白蛋白ELISA定量试剂盒（见材料表）按照制造商说明书检测人白蛋白水平，以评估移植人肝细胞后小鼠肝脏的植入效率。 
	注意：请勿丢弃沉淀物，将沉淀细胞用于流式细胞术分析，以评估人免疫系统的重建情况。</li>
	<li>将无血清的细胞沉淀重悬于35 µL FACS缓冲液（PBS + 2% FBS）中，并加入5 µL小鼠特异性CD45抗体（浓度0.5 mg/mL）、各5 µL人特异性抗体CD45（0.1 mg/mL）、CD3（0.2 mg/mL）、CD8（0.1 mg/mL）和CD19（0.5 mg/mL），以及各20 µL CD4（0.25 mg/mL）和CD14（0.25 mg/mL），在4 °C避光孵育30分钟，以检测CD34+ HSPCs来源的功能性免疫系统的发育情况。 
	注意：建议额外设置一管未染色细胞作为对照，用于确定染色细胞的设门范围。</li>
	<li>孵育结束后，将染色后的细胞悬液（约100 µL）转移至聚苯乙烯圆底流式管中，加入2 mL 1×裂解缓冲液（见材料表，用蒸馏水将10×裂解缓冲液按1:9稀释），室温孵育10–15分钟以裂解红细胞。 
	注意：通过观察溶液浊度判断红细胞裂解程度。当样品变得透明时，表明裂解已完成。</li>
	<li>裂解完成后，在管中加入3 mL FACS缓冲液，于4 °C以300 × g离心5分钟，收集细胞沉淀。再次加入3 mL FACS缓冲液重悬沉淀，并于4 °C以300 × g离心5分钟，重复洗涤一次。</li>
	<li>用新鲜配制的1%多聚甲醛（PFA）固定细胞，随后在流式细胞仪上获取数据，并使用流式分析软件进行分析。</li>
	<li>分析时，首先在FSC/SSC图上圈选淋巴细胞群体，然后在FSC-area/FSC-height图上进行单细胞设门。</li>
	<li>进一步在单细胞群体中圈选人特异性CD45（hCD45）阳性细胞，并同时包含小鼠特异性CD45（mCD45）设门，以排除来源于小鼠的细胞。根据未染色对照管的设门策略，合理设定染色样本的设门区域。</li>
	<li>圈选hCD45+细胞，以确定CD3+ T细胞和CD19+ B细胞的频率；在T细胞群体中进一步分析CD4和CD8亚群。为评估单核细胞，可在hCD45设门基础上确定CD14+单核细胞的比例。</li>
</ol>
5. TK-NOG 小鼠的 HIV 感染及其对人源肝脏和免疫系统的影响
<ol>
	<li>在指定的生物安全二级实验室中操作HIV-1病毒及所有感染小鼠&#160;设施 
	警告： 高压灭菌所有感染HIV的废弃物，并置于双层生物危害袋中丢弃。出于安全考虑，处理感染HIV的小鼠时应佩戴防割手套。</li>
	<li>始终穿戴个人防护装备（PPE），包括一次性防护服、鞋套、口罩和双层手套，操作病毒时不得脱卸。</li>
	<li>选择人源CD45重建水平超过15%的小鼠+ 细胞（在步骤4.7中检测）以及血清中存在人血清白蛋白用于HIV-1感染（在步骤4.1中检测）。</li>
	<li>向小鼠注射 1 x 103 至 1 × 104 组织培养感染剂量50（TCID₅₀）50HIV-1ADA 以每只小鼠100–200 µL的体积进行腹腔注射。</li>
	<li>5 周后使用异氟烷（异氟烷蒸气浓度&#160;的 &#62;5%).</li>
	<li>安乐死后，通过心脏穿刺采集小鼠血液至EDTA抗凝管中，用于分离血清，通过ELISA检测人特异性白蛋白水平以评估HIV-1对肝脏的影响（见步骤4.1），并获取血细胞，通过流式细胞术分析人免疫细胞的变化情况（见步骤4.2–4.8）。 
	注意： 感染后5周，使用生物分析仪评估小鼠外周病毒载量，以确认其是否感染。</li>
	<li>采血后，取出安乐死小鼠的肝脏。</li>
	<li>进行肝脏切除时，从剑突处开始，在皮肤、肌肉和腹膜上做一条长1.5–2 cm、深0.5 cm的切口，以暴露腹腔。在肝脏与膈肌之间做一垂直于脊柱的切口。提起肝脏，切断其与胃和肠相连的任何膜状组织。</li>
	<li>收集肝脏组织，用4%多聚甲醛固定过夜，随后按照标准免疫组织化学实验方案评估HIV对CK18的影响+ 使用人特异性CK18抗体标记肝细胞8.</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在 HIV 感染患者中，肝脏会受到损害和损伤24。尽管已有少数共移植 CD34+ HSPC 和肝细胞的动物模型，但在 HIV-1 存在的情况下用于研究人类肝脏疾病的实验性小型动物模型仍然极为有限7,12,25。在体外实验中，肝细胞被证实可发生低水平的 HIV-1 感染26。同时携带两类人类细胞的人源化小鼠是一种理想的模型。已有研究表明，在仅重建人类免疫系统的小鼠中，当实验性清除人类调节性 T 细胞时，其肝脏会受到 HIV 感染的影响20,27。然而，小鼠与人类肝细胞在免疫和功能特性上的差异，可能是两者对 HIV-1 及免疫细胞反应不同的根本原因。本综述描述了一种同时重建人类免疫系统和肝脏的实验方案，旨在研究在 HIV-1...

自从抗逆转录病毒治疗问世以来，与单纯HIV-1感染相关的死亡率已显著下降。然而，肝病已成为HIV感染者中常见的发病原因1,2。HIV-1感染合并肝炎病毒感染的情况更为普遍，在美国，约有10%至30%的HIV感染者存在此类合并感染3,4,5。
HIV-1 和肝炎病毒的宿主特异性限制了小型动物模型在研究人类特异性传染病或多方面探究 HIV-1 相关性肝病发病机制中的应用价值。允许移植人类细胞和/或组织的免疫缺陷小鼠（称为人源化小鼠模型）是适用于临床前研究的动物模型。6,7,8自21世纪初人源化小鼠问世以来，已有多个针对胆汁淤积性人类肝毒性、人类特异性病原体（包括HIV-1及HIV相关性神经认知障碍、EB病毒、肝炎）及其他传染性疾病的临床前研究在这些小鼠模型中开展6,9,10,11多种用于CD34的鼠类模型+ HSPCs 和/或人肝细胞移植已长期发展并不断改进，用于研究乙型肝炎病毒（HBV）相关肝病的疾病发病机制12,13,14. 多种用于造血干细胞祖细胞（HSPC）和人肝细胞（HEP）移植的模型基于NOG（NOD.Cg-）品系Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13，NSG（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15，Balb/C-Rag2-/- γc-/- (Rag2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/J)12和 fah-/- NOD rag1-/-il2rγnull 小鼠16然而，每种模型都有其自身的优势和局限性；例如，AFC8双人源化小鼠在Balb/C-Rag2背景下用于肝内皮细胞（HEPs）和人类造血干细胞（HSCs）研究-/- γc-/-&#160;背景能够实现免疫细胞和造血干细胞的成功植入，但该模型中缺乏抗原特异性的T细胞和B细胞反应12重建双人源化小鼠的主要问题包括移植效果不理想、缺乏支持不同组织的合适模型、条件不匹配、免疫排斥或移植物-与移植物抗宿主病（GVHD），以及技术上的困难，例如对新生儿进行有风险的操作，以及因代谢异常导致的高死亡率13.
尽管人源化小鼠已用于HIV研究多年17,18,19，但将其用于研究HIV-1所致肝损伤的报道仍较为有限20。我们此前报道了双人源化TK-NOG小鼠模型的建立及其在HIV相关肝病研究中的应用8。该模型可实现肝细胞与免疫细胞的高效植入，并重现HIV感染的致病过程。本文详细阐述了该模型的实验方案，包括人肝细胞移植过程中最关键的步骤。同时描述了成功植入肝细胞（HEPs）并重建TK-NOG小鼠功能性免疫系统所需的人造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的特性。此外，还详细说明了利用该模型研究HIV相关肝脏免疫病理机制的方法。实验采用携带肝特异性单纯疱疹病毒1型胸苷激酶（HSV-TK）转基因的雄性TK-NOG小鼠。表达该转基因的小鼠肝细胞在短暂暴露于无毒剂量的更昔洛韦（GCV）后可被有效清除。移植的人肝细胞可在小鼠肝脏中稳定存留，无需使用外源性药物维持21。同时，小鼠还需预先接受非清髓剂量的曲奥舒凡处理，以在小鼠骨髓中为人类细胞腾出生态位8。将免疫缺陷型TK-NOG小鼠经脾内注射人肝细胞（HEPs）和多能造血干细胞和祖细胞（HSPCs）。随后定期通过血液免疫表型分析和血清中人白蛋白水平检测，分别监测血液和肝脏的重建情况。当小鼠体内人免疫细胞和肝细胞重建水平均成功达到15%以上时，经腹腔注射HIV-1病毒。感染后4至5周即可评估HIV对肝脏的影响。需要特别注意的是，由于使用了HIV-1病毒，在操作病毒及对小鼠进行注射时必须采取所有必要的安全防护措施。

<table><tbody><tr><td>27 G1/2&quot; 针头</td><td>BD 生命科学</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>30 G1/2&quot; 针头</td><td>BD 生物科学</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 聚苯乙烯&amp;nbsp; 圆底试管 12 mm x 75 mm 型</td><td>康宁</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 mL 无针结核菌素注射器</td><td>BD 生物科学</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS array 生物分析仪&amp;nbsp;</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td>用于检测洗脱CD34的纯度&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; 细胞&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BD FACS array 软件</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td>用于分析获取的 CD34 的软件&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; FACS 阵列上的细胞</td></tr><tr><td>BD FACS 溶血液</td><td>BD 生物科学</td><td>349202</td><td>裂解红细胞</td></tr><tr><td>BD LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>流式细胞术样本采集仪器</td></tr><tr><td>BD&amp;nbsp;Vacutainer 塑料采血管</td><td>BD 生物科学</td><td>BD 367874</td><td>采集脐带血</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白&amp;nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A9576</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺</td><td></td><td></td><td>管制药物与止痛药</td></tr><tr><td>CD14-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555398</td><td>特异性针对人类</td></tr><tr><td>CD19-BV605</td><td>BD 生物科学</td><td>562653</td><td>特异性针对人类</td></tr><tr><td>CD34 微珠试剂盒，人</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-046-702</td><td>用于分离&amp;nbsp;&amp;nbsp; CD34&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; HSPC</td></tr><tr><td>CD34-PE，人源</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-081-002</td><td>用于检测洗脱后CD34纯度的抗体&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; 细胞&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CD3-AF700</td><td>BD Biosciences</td><td>557943</td><td>特异性针对人类</td></tr><tr><td>CD45-PerCPCy5.5</td><td>BD 生物科学</td><td>564105</td><td>特异性针对人类</td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>BD Biosciences</td><td>555349</td><td>特异性针对人类</td></tr><tr><td>CD8-BV421</td><td>BD 生物科学</td><td>562428</td><td>特异性针对人类</td></tr><tr><td>细胞计数板</td><td>伯乐（Bio-rad）</td><td>1450015</td><td></td></tr><tr><td>ChargeSwitch gDNA Mini Tissue 试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>CS11204</td><td>用于从耳组织提取基因组DNA</td></tr><tr><td>Cobas Amplicor 系统 v1.5&amp;nbsp;</td><td>罗氏分子诊断</td><td></td><td>使用生物分析仪测量病毒载量</td></tr><tr><td>棉签&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;McKesson</td><td>24-106-2S</td><td></td></tr><tr><td>细胞角蛋白-18（CK18）</td><td>DAKO</td><td>M7010</td><td>特异于人类</td></tr><tr><td>DMSO（二甲基亚砜）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-5X5ML</td><td></td></tr><tr><td>微孔滑动夹延长管组，固定式公鲁尔锁接头。长度：60 英寸（152 厘米），流体通路容积：0.55 mL，无菌</td><td>BD 生命科学</td><td>30914</td><td>连接至移液器，并加载HSPC和HEP悬液</td></tr><tr><td>FACS Diva 版本 6</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>流式细胞仪软件所需&amp;nbsp; 样本采集</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>FLOWJO 分析软件&lt;br/&gt; v10.2</td><td>FLOWJO, LLC</td><td></td><td>流式细胞术分析软件</td></tr><tr><td>更昔洛韦</td><td>APP Pharmaceuticals, Inc.</td><td>315110</td><td>处方药</td></tr><tr><td>Greiner MiniCollect EDTA 管</td><td>Greiner bio-one</td><td>450475</td><td></td></tr><tr><td>肝细胞解冻培养基&amp;nbsp;</td><td>Triangle Research Labs&amp;nbsp;</td><td>MCHT50</td><td></td></tr><tr><td>Horizon 开放式结扎夹施夹器</td><td>Teleflex</td><td>537061</td><td>用于固定结扎夹</td></tr><tr><td>Hospira 注射用无菌水</td><td>ACE外科用品公司股份有限公司</td><td>001-1187</td><td>用于稀释布托啡诺（镇痛剂）</td></tr><tr><td>人白蛋白ELISA定量试剂盒</td><td>贝赛特实验室</td><td>E80-129</td><td>用于检测小鼠血清中人白蛋白水平</td></tr><tr><td>人肝细胞</td><td>Triangle Research Labs&amp;nbsp;</td><td>HUCP1</td><td>&amp;nbsp;冷冻保存的人类肝细胞，经诱导验证合格&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>直型虹膜剪</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13295</td><td></td></tr><tr><td>柳叶刀</td><td>MEDIpoint</td><td>金rod 5 mm</td><td></td></tr><tr><td>LS柱&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>用于捕获 CD34&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; 微珠（阳性筛选）</td></tr><tr><td>淋巴细胞分离液（LSM）</td><td>MP Biomedicals</td><td>50494</td><td>用于分离&amp;nbsp;&amp;nbsp; 外周血淋巴细胞</td></tr><tr><td>MACS 多功能支架</td><td>美天旎生物技术</td><td>130-042-303</td><td>持有 Quadro MACS 分离器和 LS 柱</td></tr><tr><td>麦克弗森-范纳斯微型解剖弹簧剪</td><td>Roboz外科器械公司</td><td>RS-5605</td><td>用于在皮肤上做切口以暴露脾脏</td></tr><tr><td>显微解剖镊</td><td>Roboz外科器械公司</td><td>RS-5157&amp;nbsp;</td><td>将脾脏从腹腔中拉出</td></tr><tr><td>小鼠 CD45-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>553080</td><td>小鼠特异性的</td></tr><tr><td>PBS（磷酸盐缓冲液）</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td></td></tr><tr><td>Qudro MACS 分离器&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td>包含四列 LS 柱</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>StepOne Plus 实时荧光定量 PCR&amp;nbsp;</td><td>应用生物系统公司</td><td></td><td>使用的仪器&amp;nbsp; 以&amp;nbsp; 基因型</td></tr><tr><td>Stepper系列重复分配移液器 1ml</td><td>DYMAX 公司</td><td>T15469</td><td>用于&amp;nbsp; 分配&amp;nbsp; 以受控方式移植 HSPC 和 HEP 悬液</td></tr><tr><td>Suturevet PGA 合成可吸收缝合线</td><td>Henry Schein 动物健康</td><td>41178</td><td>皮肤和腹膜缝合</td></tr><tr><td>TaqMan 基因表达预混液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>TC20自动化细胞计数仪</td><td>伯乐（Bio-rad）</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>TK-NOG小鼠&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>由日本实验动物中央研究所（CIEA，日本；Mamoru Ito 博士和 Hiroshi Suemizu 博士）提供</td></tr><tr><td>曲奥舒凡</td><td>Medac GmbH</td><td></td><td>由以下提供 &amp;nbsp;Dr. Joachim Baumgart（medac GmbH）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>伯乐（Bio-rad）</td><td>1450022</td><td></td></tr><tr><td>Vannas型显微剪刀，直型，80毫米长</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>1346</td><td>用于切开皮肤以暴露脾脏</td></tr><tr><td>Weck止血夹 传统钛合金结扎夹</td><td>Esutures</td><td>523700</td><td>注射后结扎脾脏</td></tr></tbody></table>

建立双人源化tk-nog小鼠模型用于研究hiv相关性肝病发病机制

Establishment of the Dual Humanized TK-NOG Mouse Model for HIV-associated Liver Pathogenesis

尽管感染人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）患者的预期寿命有所延长，但肝病已成为其发病的主要原因之一。HIV-1引起的肝脏免疫病理机制仍不明确。通过移植人肝细胞和人免疫系统的小型异种移植动物模型，可重现该疾病发病过程中的人类生物学特征。本文描述了一种通过移植人肝细胞和CD34+造血干细胞/祖细胞（HSPCs）建立双重人源化小鼠模型的实验方案，用于研究HIV感染患者中观察到的肝脏免疫病理变化。为实现双重重建，雄性TK-NOG（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic）小鼠经腹腔注射更昔洛韦（GCV）以清除小鼠转基因肝细胞，并使用白消安进行非清髓性预处理，这两种处理均有助于人肝细胞（HEP）的植入和人免疫系统（HIS）的发育。通过检测人白蛋白（ALB）水平评估肝脏细胞植入情况，通过流式细胞术检测外周血中人免疫细胞的存在以确认人免疫系统的建立。本方案所建立的模型再现了HIV-1感染所致肝损伤的多个特征。该模型的建立对于研究肝炎病毒共感染以及抗病毒和抗逆转录病毒药物的评价具有重要意义。

通过简单的ELISA和流式细胞术，可分别在每一步轻松监测具有人源肝脏和免疫细胞的双人源化小鼠模型的建立情况。定期进行流式细胞术以评估功能性免疫系统的发育情况，并观察HIV感染对免疫细胞的影响。在双人源化小鼠中，功能性免疫细胞在淋巴细胞门控中的比例可介于15%至90%之间。免疫细胞的代表性亚群以散点图形式展示（图3）。为评估人源肝细胞的移植情况，每月对小鼠血清进行针对人特异性白蛋白水平的ELISA检测。同时移植了HSPCs和HEPs的小鼠，其人特异性白蛋白水平在一个月时介于约7 µg/mL至377 µg/mL之间，并在观察期间（6个月）持续升高（图4）。通过流式细胞术监测HIV感染对双人源化小鼠血液中人源免疫细胞的影响，同时通过人特异性白蛋白ELISA检测肝脏中HEPs的变化。感染5周后，ELISA检测显示HIV-1导致小鼠血清中人源白蛋白水平下降；免疫组织化学分析显示，双人源化小鼠肝组织切片中人源CK18+肝细胞数量减少（<stro...

本方案提供了一种可靠的方法，用于建立同时具有人类免疫系统和肝细胞的人源化小鼠模型。双重建免疫缺陷小鼠实现 通过 人肝细胞和CD34的脾内注射+ 造血干细胞易受人类免疫缺陷病毒-1感染，并可重现HIV感染者患者中观察到的肝脏损伤。

建立双人源化TK-NOG小鼠模型用于研究HIV相关性肝病发病机制

尽管感染人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）患者的预期寿命有所延长，肝病已成为导致……的常见原因

本方案的总体目标是利用人类造血干细胞和肝组织，构建具有功能性人类免疫系统和肝脏的人源化小鼠模型。该方法有助于解答遗传性肝脏人源化小鼠研究中的关键问题。该方法为研究人类中观察到的由HIV引起的免疫病理学提供了强有力的工具。演示该过程的人员包括病理科和微生物学部门的主管孙一敏（Yimin Sun），以及研究技术员王卫民（Weimin Wang）和爱德华·马卡罗夫（Edwrd Makarov）。首先，将采集在肝素化试管中的脐带血转移至无菌超净工作台。加入 PBS，使体积增加至 35 毫升。将样品加在淋巴细胞分离液上层，在4°C条件下以400 × g离心35分钟，无刹车。随后，小心移除上层血浆层，并使用移液管将白色的血沉棕黄层界面转移至新试管中。用30至40毫升冰浴缓冲液重悬血沉棕黄层。用移液器将20微升细胞悬液与20微升0.4%台盼蓝混合。取10微升该混合液加入细胞计数板两个计数室中任意一个的外侧加样口，将计数板插入自动细胞计数仪中进行细胞计数。在4摄氏度条件下，以300 × g离心10分钟。小心吸除上清液，加入 300 微升预冷缓冲液。每 1 亿个细胞加入 100 微升人 FC 受体阻断试剂和 100 微升与 MicroBeads 偶联的单克隆小鼠抗人 CD34 抗体。在 4 摄氏度下孵育 30 分钟。加入 10 毫升预冷缓冲液洗涤细胞，于 4°C 以 300 × g 离心 10 分钟。小心吸去上清液，将沉淀重悬于 500 微升预冷缓冲液中。随后，将 LS 正向选择柱置于磁性激活细胞分选装置中，用 3 毫升预冷缓冲液冲洗柱子。将样本加入LS柱中，该柱可截留样本中与人CD34阳性细胞结合的MicroBeads，让样本在重力作用下流入收集管。用冰浴缓冲液洗涤柱子三次，并将流出液收集至同一收集管中。随后，用5毫升冰浴缓冲液冲洗柱子，将CD34阳性细胞洗脱至新的收集管中。重复该步骤，直至纯度超过90%。接下来，使用台盼蓝染色液和血细胞计数板对分离出的CD34阳性细胞进行计数。计数后，以300 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于125 µL PBS中，立即用于移植注射。为检测 CD34 阳性洗脱液的纯度，取 50 µL 悬液，加入 10 µL PE 标记的抗人 CD34 抗体，在 4°C 下孵育 30 分钟。随后，用 PBS 洗涤细胞并重悬，进行流式细胞术检测。数据采集后，按照文本方案中所述步骤进行分析。首先，按照文本方案取出并解冻冷冻保存的肝细胞。然后，取下生物盖，将解冻后的肝细胞倒入含有预温解冻培养基的50毫升锥形管中。用手轻轻晃动管子数秒钟，使细胞悬浮均匀。在室温下以100 × g离心8分钟，沉淀细胞。用含0.1% BSA的PBS洗涤细胞沉淀，并将细胞重悬于PBS中，与新鲜或冻存复苏的HSPCs混合，每只小鼠终体积为80 µL。首先，将一根无菌延长管的一端连接至30号针头，另一端连接至1 mL注射器。用含有混合HEPs和HSPCs的悬液填充注射器。将注射器安装至重复分配移液器的卡槽中，并调节分配器，使每次按压分配10 µL。按照文本方案所述剃除每只小鼠的毛发，并用10%聚维酮碘擦拭每只小鼠身体左侧，随后用70%异丙醇擦拭。使用Vannas型剪刀，在腹壁左侧的皮肤、肌肉和腹膜上做一个小切口，切口位置位于肋骨下缘约5毫米处，以进入腹腔。找到脾脏后，用镊子将其轻轻拉至操作区域以便于操作，并将30号针头插入脾脏下极。接着，松开移液器的推杆，每次注入10微升液体，每只脾脏注射总量限制在60至80微升之间。缓慢撤出针头，使用结扎器以结扎夹夹闭脾脏。然后用浸有无菌PBS的棉签将脾脏推回体腔内。采用间断缝合方式缝合腹壁的肌肉层。使用不可吸收缝线，采用间断缝合方式完成皮肤闭合。将所有所需材料转移至指定的生物安全二级以上设施。在操作病毒期间，始终穿戴个人防护装备，包括一次性全身防护服、鞋套、口罩和双层手套（含防切割手套）。选择人源CD45阳性细胞重建率超过15%且血清中存在人白蛋白的小鼠用于HIV-1感染。每只小鼠腹腔注射1,000至10,000个组织培养感染剂量的50型HIV-1 ADA病毒，注射体积为100至200 µL。安乐死后，按照文本方案所述步骤取出每只小鼠的肝脏。收集肝脏并在4%多聚甲醛中固定过夜。可通过非常简单的ELIZA和流式细胞术分别在每一步轻松监测人源化肝细胞与免疫细胞双人源化小鼠模型的建立情况。通常采用流式细胞术评估功能性免疫系统的发育情况，并观察HIV感染对免疫细胞的影响。在双人源化小鼠中，功能性免疫细胞的发育水平可占淋巴细胞门控的15%至90%。为评估人肝细胞的移植效果，每月对小鼠血清进行人特异性白蛋白水平的ELIZA检测。同时移植了HSPCs和HEPs的小鼠，在移植一个月时，其人特异性白蛋白水平约为每毫升7微克至每毫升377微克，并在观察期间持续升高。通过流式细胞术监测HIV感染对双人源化小鼠血液中人免疫细胞的影响，并通过人特异性白蛋白ELISA检测肝脏中HEPs的变化。感染五周后，HIV-1导致双人源化小鼠血清中人白蛋白水平下降，且肝脏组织切片中人CK18阳性肝细胞减少。与感染前同一小鼠的水平相比，HIV感染小鼠的血液和肝脏中CD4与CD8的比值通常降低。分离血沉棕黄层时，应小心地将血液叠加于淋巴细胞分离液上方。手术过程中，应轻柔地握住脾脏，并将针头插入脾脏下极。在分离造血干细胞后，必须检测CD34阳性造血干细胞的纯度，以避免混入CD3阳性细胞以及不同供体肝细胞的急性注射。由于人源化小鼠表现出人类免疫系统和肝脏的生理特征，因此所开发的小鼠模型可用于研究艾滋病病毒（HIV）及生理感染和肝硬化的发病机制。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

建立与艾滋病毒相关的肝脏发病机制的双人性化TK-NOG小鼠模型

本文描述了利用人源化小鼠产生和表征肿瘤特异性T细胞的方法。将人胸腺组织和基因修饰的人造血干细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，从而重建工程化的人类免疫系统，以实现在体内研究抗肿瘤免疫应答。...

利用BLT人源化小鼠作为基于干细胞的基因治疗肿瘤模型

本视频展示了一种用于评估口服联合抗逆转录病毒疗法（oral...

利用人源化小鼠模型研究口服联合抗逆转录病毒疗法治疗 HIV-1 感染

本视频展示了一种构建双人源化小鼠模型的方法，该模型同时具有人免疫系统和人肝细胞。该方法包括将人肝细胞和造血干细胞与祖细胞移植到转基因免疫缺陷小鼠体内。...

开发含有人肝细胞和免疫细胞的人源化小鼠模型

该视频展示了一种利用基于干细胞的工程化免疫系统构建人源化小鼠模型的技术，以抵抗人类免疫缺陷病毒（HIV）。将人类胎儿胸腺组织和经过基因工程改造的造血干细胞（HSCs）植入重度免疫缺陷小鼠的肾包膜下。这些表达针对HIV的嵌合抗原受体（CARs）的HSCs被混合于一种胶状蛋白质混合物中，以促进其与胸腺组织的共定位。术后，HSCs分化为多种人类免疫细胞，从而形成功能性人类免疫系统对抗HIV的人源化小鼠模型。...

构建具有抗HIV工程化免疫系统的人源化小鼠模型

本方案描述了构建人源化骨髓/肝/胸腺小鼠模型的方法，该模型基于干细胞工程技术，可产生针对HIV感染的免疫反应。...

基于干细胞的工程化免疫系统在人源化小鼠模型中抵抗HIV感染

本方案提供了一种通过向经辐射处理的新生NSG小鼠肝内注射人源造血干细胞来建立人源化小鼠（hu-NSG）的方法。hu-NSG小鼠可感染HIV，并对联合抗逆转录病毒治疗（cART）具有响应，是研究HIV复制与潜伏的理想病理生理模型。...

人源化 NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) 小鼠模型在 HIV 复制与潜伏研究中的应用

本文介绍了三种用于研究人源化小鼠中 HIV...

人源化免疫缺陷小鼠模型中的慢性、急性及再激活HIV感染

我们建立了一种基于干细胞移植、阴道内人类免疫缺陷病毒暴露以及液滴数字PCR...

用于阴道内HIV暴露及HIV感染治疗研究的人源化NOG小鼠

本文介绍了一种利用嵌合型HIV病毒（EcoHIV）建立新型大鼠主动HIV感染模型的实验方案，该模型对于深入理解HIV-1在脑组织中的病毒储存库，以及研究HIV相关性神经认知功能障碍及其共病（如药物滥用）具有重要意义。...

一种大鼠的EcoHIV脑部感染模型

本方案描述了一种新型的口服联合抗逆转录病毒药物递送方法，该方法在人源化小鼠中成功抑制了HIV-1...

HIV-1感染人源化小鼠的口服联合抗逆转录病毒治疗

了解利用人脐带血CD34+造血干细胞和人肝细胞构建双人性化TK-NOG小鼠模型的方法。该模型可用于研究HIV-1感染引起的肝脏免疫病理机制及疾病进展。

建立双人源化TK-NOG小鼠模型用于研究HIV相关性肝病发病机制

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