Name: qKAT: Quantitative Flugbuchungssystem Typisierung von Killer-Zelle Immunoglobulin-Like-Rezeptor-Gene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Erfahren Sie die quantitative KIR-Typisierung mit qKAT für Immunogenetik mittels Real-Time-PCR und Multiplex-Reaktionen. Diese Hochdurchsatzmethode ermöglicht die effiziente Bestimmung von Genkopienzahlen.

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Das Projekt erhielt Fördermittel aus dem Medical Research Council (MRC), der European Research Council (ERC) Programms der Europäischen Union Horizont 2020 Forschung und Innovation (Grant Agreement Nr. 695551) und das National Institute of Health (NIH) Cambridge Biomedizinischen Forschungszentrum und NIH Forschung Blut- und Transplant Research Unit (NIHR BTRU) im Bereich der Organspende und Transplantation an der University of Cambridge und in Partnerschaft mit NHS Blood and Transplant (NHSBT). Die geäußerten Meinungen sind diejenigen der Autoren und nicht unbedingt der NHS, die NIHR, das Department of Health oder die NHSBT.

1. Vorbereitung und Beschichtung aus DNA
<ol><li>Die gDNA-Konzentration mit einem spektralfotometrische oder fluorometrisch Instrument genau zu quantifizieren.</li>
	<li>Verdünnen Sie DNA um 4 ng/µL auf einer 96-Well Deep-Well-Platte. Gehören Sie mindestens eine Kontrollprobe gDNA mit bekannten Ausfertigung eine eigene Nummer und einem nicht-Template-Kontrolle.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die 96-Well-Platten bei 450 X g für 2 min.</li>
	<li>Mit einem Instrument Handhabung von Flüssigkeiten jeder Probe in vervierfacht auf qPCR 384-Well-Platten zu verzichten, so dass jeder gut 10 ng DNA (2,5 µL/Well). Bereiten Sie mindestens zehn 384-Well-Platten, eine für jede qKAT Reaktion.</li>
	<li>Wenn gDNA von mehr als einer 96-Well-Platte verzichtet wird ist, führen Sie eine vollständige Volume-waschen mit 2 % Bleichmittel und Reinstwasser, reinigen Sie die Nadeln der Flüssigkeit Handlingsystem zwischen einzelnen 96-Well-Platte von gDNA Proben.</li>
	<li>Trocknen Sie die DNA durch Inkubation der 384-Well-Platten in einem sauberen Bereich bei Raumtemperatur für mindestens 24 Stunden.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Primer und Sonden
Hinweis: qKAT besteht aus zehn Multiplex-Reaktionen. Jede Reaktion umfasst drei Grundierung Paare und drei Fluoreszenz-markierten Sonden, die zwei KIR -Gene und eine Referenz-gen gezielt verstärken. Die Sonden, die in Jiang Et Al.27 veröffentlicht wurden wurden geändert, sodass die Oligonucleotides jetzt mit ATTO-Farbstoffen beschriftet werden, da sie verbesserten Photostabilität und langes Signal Lebenszeiten bieten. Pre-regelmÄÑig Grundierung Kombinationen sind im Handel erhältlich (siehe Tabelle der Materialien).
<ol><li>Bereiten Sie Primer-Kombinationen für jede Reaktion gemäß den in Tabelle 1angegebenen Verdünnungen vor.</li>
	<li>Bereiten Sie die Sonde Kombinationen für jede Reaktion gemäß Tabelle 1. Jede einzelne Sonde vor der Herstellung der Verbindung zu testen.</li>
</ol>3. Vorbereitung des Master-Mix
Hinweis Die unten genannten Mengen sind für die Durchführung einer qKAT Reaktion auf eine Reihe von 10 x 384-Well Platten.
<ol><li>Sicherstellen Sie, dass die gDNA Proben auf 384-Well-Platten beschichtet vollständig trocken sind. Führen Sie alle Schritte auf dem Eis und halten Sie die Reagenzien von möglichst viel Lichteinfall, da die Fluoreszenz-markierten Sonden Foto und thermosensible sind bedeckt.</li>
	<li>Auftauen der qPCR Puffer, Primer und Sonde Aliquote bei 4 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie auf dem Eis einen master-Mix 10 x 384-Well Platten durch Zugabe von 18,86 mL Reinstwasser, 20 mL qPCR Puffer, 1.000 µL vorgefertigtes Grundierung Kombination und 180 µL vorgefertigtes Sonde Kombination (Tabelle 2).</li>
	<li>Verteilen der master-Mix gleichmäßig über eine 96-Deep-well-Platte mit einer Multi-Kanal-Pipette, 415 µL in jede Vertiefung pipettieren. Halten Sie diese Platte in eine Eisbox aus Licht abgedeckt.</li>
	<li>Mit einem flüssigen Umgang mit Instrument, 9,5 µL des master-Mix in jede Vertiefung von 384-Well-Platte mit getrockneten gDNA verzichten. Die Dichtplatte mit einer Folie und legen Sie es sofort bei 4 ° C. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die restlichen Platten, um sicherzustellen, dass die Nadeln der Handlingsystem Flüssigkeit mit Wasser zwischen jedem Teller gewaschen werden.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie 384-Well-Platten bei 450 X g für 3 min und inkubieren sie bei 4 ° C über Nacht oder zwischen 6-12 h die DNA Aufschwemmen und eventuelle Luftblasen zu zerstreuen.</li>
</ol>4. qPCR Assay
<ol><li>Zentrifugieren Sie nach der Übernachtung Inkubation bei 450 X g für 3 min, verbleibenden Luftblasen zu zerstreuen.</li>
	<li>Für Zwecke der Automatisierung, verbinden die qPCR-Maschine (z. B. LightCycler 480) zu einem Mikrotestplatte Handler (siehe Tabelle der Materialien). Programm der Mikrotestplatte Handler, der die Platten in der qPCR-Maschine von einem gekühlten Lagerung Dock zu setzen, der vor Licht geschützt ist. Hinweis Assays sollte, in der Theorie funktionieren, auf anderen qPCR-Maschinen mit passenden optischen Einstellungen.</li>
	<li>Verwenden Sie die folgenden Radsport Bedingungen: 95 ° C für 5 min gefolgt von 40 Zyklen von 95 ° C für 15 s und 66 ° C für 50 s, mit Datenerfassung bei 66 ° C.</li>
	<li>Sobald das abgeschlossen ist, haben Sie die Roboter die Platte von der qPCR-Maschine zu sammeln und legen Sie es im Dock ablegen.</li>
</ol>5. nach einem Testlauf Analyse
<ol><li>Nach Verstärkung, berechnen die Quantifizierung Zyklus (Cq) Werte mit der zweiten Derivative maximale Methode oder die Anpassungspunkte Methode mit der Software der qPCR-Maschine (siehe Tabelle der Materialien), die folgenden Schritte aus.</li>
	<li>Öffnen Sie die qPCR-Software und in der Registerkarte " Navigator " öffnen Sie die gespeicherte Reaktion-Experiment-Datei für eine Platte.</li>
	<li>
Wählen Sie für die Analyse mit der zweiten Derivative maximale Methode die Registerkarte "Analyse", und erstellen Sie eine neue Analyse mit Abs Quant/Second Derivat Max Methode.
	<ol>
<li>Wählen Sie im Fenster Create neue Analyse Berechnungsart: Abs Quant/Second Derivat Max Methode, Teilmenge: alle Proben, Programm: Verstärkung, Name: Rx-DFO (wobei x ist die Anzahl der Reaktion).</li>
		<li>Wählen Sie Filter Kamm und VIC/HEX/Yellow555 (533-580). Dies sorgt dafür, dass die Daten für STAT6 ausgewählt ist.</li>
		<li>Wählen Sie Farbe Entschädigung für VIC/HEX/Yellow555(533-580). Klicken Sie auf berechnen. Wiederholen Sie dies für Fam (465-510) und Cy5/Cy5.5(618-660). Klicken Sie auf Datei speichern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Wählen Sie für die Analyse der Anpassungspunkte Methode Abs Quant/Fit Punkte in der Registerkarte "Analyse aus".
	<ol>
<li>Wählen Sie im Fenster Create neue Analyse Berechnungsart: Abs Quant/Anpassungspunkte Methode, Teilmenge: alle Proben, Programm: Verstärkung, Name: RxF-DFO (wobei x ist die Anzahl der Reaktion).</li>
		<li>Wählen Sie den richtigen Filter und Farbe Entschädigungen für STAT6 und jedes der KIR -Gene (Fam/Cy5). Legen Sie in der Registerkarte " Noiseband " Noise-Band, die Hintergrundgeräusche auszuschließen.</li>
		<li>Legen Sie in der Registerkarte Analyse die Anpassungspunkte 3 und wählen Sie Show Punkte passen. Klicken Sie auf berechnen. Klicken Sie auf Datei speichern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Export der Ergebnisse
<ol><li>In der qPCR-Software, öffnen Sie den Navigator tab. Wählen Sie Ergebnisse Batch Export.</li>
	<li>Öffnen Sie den Ordner, in dem die Experiment-Dateien werden gespeichert und übertragen Sie die Dateien in den rechten Bereich des Fensters. Klicken Sie auf weiter. Wählen Sie den Namen und den Speicherort der Exportdatei.</li>
	<li>Wählen Sie Analyse Abs Quant/Second Derivat Max Methode oder Abs Quant/Anpassungspunkte. Klicken Sie auf weiter. Überprüfen Sie, dass der Name der Datei, die Export-Ordner und die Berechnungsart korrekt sind und klicken Sie auf nächste um den Export zu starten.</li>
	<li>Warten Sie, bis der Export Status Okist. Der Bildschirm bewegt sich automatisch mit dem nächsten Schritt fort. Überprüfen Sie, ob alle ausgewählte Dateien erfolgreich exportiert wurden, dass die Anzahl der Dateien fehlgeschlagen = 0. Klicken Sie auf fertig.</li>
	<li>Verwenden Sie Skripte split_file.pl und roche2sds.pl, individuelle Reaktionen für jede Platte die exportierten Platten aufgeteilt. Hinweis die Skripte werden auf Anfrage/GitHub zur Verfügung gestellt.</li>
</ol>7. Kopieren Sie Zahl Berechnungen
<ol><li>Öffnen Sie die Kopie Nummer Auswerte-Software (z. B. CopyCaller). Wählen Sie Echtzeit-PCR-Ergebnisse-Datei importieren und laden Sie Textdateien, die von roche2sds.plerstellt.</li>
	<li>Wählen Sie analysieren und durchführen Sie die Analyse, indem entweder die Auswahl Kalibrator Probe mit bekannten Exemplarzahl oder am häufigsten Exemplarzahl. Siehe Tabelle 5 für die häufigsten Kopienzahl des KIR -Gene, die in der Regel in europäischen Ursprungs Populationen beobachtet.</li>
</ol>8. Qualitätsprüfungen Daten-
<ol><li>Verwenden Sie R-Skript KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R , Nummer Kopieren von Daten von den Platten in eine Tabellenkalkulation zu kombinieren. Hinweis die Skripte werden auf Anfrage/GitHub zur Verfügung gestellt.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Rohdaten auf der Kopie Zahl Analysesoftware für Proben, die nicht zu den bekannten Gestänge Ungleichgewicht (LD) für KIR -Gene (Tabelle 6) entsprechen.</li>
</ol>

<ol><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+variation+leads+to+considerable+diversity+for+B+but+not+A+haplotypes+of+the+human+KIR+genes+encoding+NK+cell+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Copy number variation leads to considerable diversity for B but not A haplotypes of the human KIR genes encoding NK cell receptors.</a> Genome Research. 22, 1845-1854 (2012).</li>
<li>Nemat-Gorgani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+Selected+Mechanisms+Attenuated+the+Inhibitory+Interaction+of+KIR2DL1+with+C2+%2B+HLA-C+in+Two+Indigenous+Human+Populations+in+Southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Different Selected Mechanisms Attenuated the Inhibitory Interaction of KIR2DL1 with C2 + HLA-C in Two Indigenous Human Populations in Southern Africa.</a> The Journal of Immunology. 200, 2640-2655 (2018).</li>
<li>Norman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-evolution+of+human+leukocyte+antigen+%28HLA%29+class+I+ligands+with+killer-cell+immunoglobulin-like+receptors+%28KIR%29+in+a+genetically+diverse+population+of+sub-Saharan+Africans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Co-evolution of human leukocyte antigen (HLA) class I ligands with killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) in a genetically diverse population of sub-Saharan Africans.</a> PLoS Genetics. 9, e1003938(2013).</li>
<li>Nakimuli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killer+cell+immunoglobulin-like+receptor+%28KIR%29+genes+and+their+HLA-C+ligands+in+a+Ugandan+population%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">Killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes and their HLA-C ligands in a Ugandan population.</a> Immunogenetics. 65, 765-775 (2013).</li>
<li>Bontadini, A., et al. <a target="_blank" href="https://translational-medicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/1479-5876-4-44">Distribution of killer cell immunoglobin-like receptors genes in the Italian Caucasian population.</a> Journal of Translational Medicine. 4, 1-9 (2006).</li>
<li>Graef, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR2DS4+is+a+product+of+gene+conversion+with+KIR3DL2+that+introduced+specificity+for+HLA-A%2A11+while+diminishing+avidity+for+HLA-C%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">KIR2DS4 is a product of gene conversion with KIR3DL2 that introduced specificity for HLA-A*11 while diminishing avidity for HLA-C.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206, 2557-2572 (2009).</li>
<li>Béziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+killer-cell+immunoglobulin-like+receptor+system+at+super-resolution+for+natural+killer+and+T-cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology.</a> Immunology. 150, 248-264 (2017).</li>
<li>Blokhuis, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR2DS5+allotypes+that+recognize+the+C2+epitope+of+HLA-C+are+common+among+Africans+and+absent+from+Europeans%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%2C+Inflammation+and+Disease%22%5BJournal%5D)">KIR2DS5 allotypes that recognize the C2 epitope of HLA-C are common among Africans and absent from Europeans.</a> Immunity, Inflammation and Disease. 5, 461-468 (2017).</li>
<li>Martin, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epistatic+interaction+between+KIR3DS1+and+HLA-B+delays+the+progression+to+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS.</a> Nature Genetics. 31, 429-434 (2002).</li>
<li>Khakoo, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+and+NK+cell+inhibitory+receptor+genes+in+resolving+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infection.</a> Science. 305, 872-874 (2004).</li>
<li>van Bergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR-ligand+mismatches+are+associated+with+reduced+long-term+graft+survival+in+HLA-compatible+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">KIR-ligand mismatches are associated with reduced long-term graft survival in HLA-compatible kidney transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 11, 1959-1964 (2011).</li>
<li>Hiby, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+maternal+killer+-+cell+immunoglobulin-like+receptors+and+parental+HLA+-+C+genotypes+with+recurrent+miscarriage%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Association of maternal killer - cell immunoglobulin-like receptors and parental HLA - C genotypes with recurrent miscarriage.</a> Human Reproduction. 23, 972-976 (2008).</li>
<li>Nakimuli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+KIR+B+centromeric+region+present+in+Africans+but+not+Europeans+protects+pregnant+women+from+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A KIR B centromeric region present in Africans but not Europeans protects pregnant women from pre-eclampsia.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, 845-850 (2015).</li>
<li>van Bergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+reduces+killer+cell+Ig-like+receptor+expression+level+and+frequency+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">HLA reduces killer cell Ig-like receptor expression level and frequency in a humanized mouse model.</a> The Journal of Immunology. 190, 2880-2885 (2013).</li>
<li>Bachanova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+KIR+B+Genotype+Improves+Progression-Free+Survival+of+Non-Hodgkin+Lymphoma+Patients+Receiving+Unrelated+Donor+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Donor KIR B Genotype Improves Progression-Free Survival of Non-Hodgkin Lymphoma Patients Receiving Unrelated Donor Transplantation.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, 1602-1607 (2016).</li>
<li>Cooley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+selection+for+natural+killer+cell+receptor+genes+leads+to+superior+survival+after+unrelated+transplantation+for+acute+myelogenous+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Donor selection for natural killer cell receptor genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia.</a> Blood. 116, 2411-2419 (2010).</li>
<li>Barani, S., Khademi, B., Ashouri, E., Ghaderi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR2DS1%2C+2DS5%2C+3DS1+and+KIR2DL5+are+associated+with+the+risk+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+in+Iranians%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Immunology%22%5BJournal%5D)">KIR2DS1, 2DS5, 3DS1 and KIR2DL5 are associated with the risk of head and neck squamous cell carcinoma in Iranians.</a> Human Immunology. 79, 218-223 (2018).</li>
<li>Vilches, C., Castaño, J., Gómez-Lozano, N., Estefanía, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+KIR+genotyping+by+a+PCR-SSP+method+that+amplifies+short+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Facilitation of KIR genotyping by a PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments.</a> Tissue Antigens. 70, 415-422 (2007).</li>
<li>Ashouri, E., Ghaderi, A., Reed, E. F., Rajalingam, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+duplex+SSP-PCR+typing+method+for+KIR+gene+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">A novel duplex SSP-PCR typing method for KIR gene profiling.</a> Tissue Antigens. 74, 62-67 (2009).</li>
<li>Martin, M. P., Carrington, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR+locus+polymorphisms%3A+genotyping+and+disease+association+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">KIR locus polymorphisms: genotyping and disease association analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , 49-64 (2008).</li>
<li>Crum, K. A., Logue, S. E., Curran, M. D., Middleton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+PCR-SSOP+approach+capable+of+defining+the+natural+killer+cell+inhibitory+receptor+%28KIR%29+gene+sequence+repertoires%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Development of a PCR-SSOP approach capable of defining the natural killer cell inhibitory receptor (KIR) gene sequence repertoires.</a> Tissue Antigens. 56, 313-326 (2000).</li>
<li>Houtchens, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+killer+cell+immunoglobulin-like+receptor+genotyping+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry+with+discovery+of+novel+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">High-throughput killer cell immunoglobulin-like receptor genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry with discovery of novel alleles.</a> Immunogenetics. 59, 525-537 (2007).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1046202301912629">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method.</a> Methods. 25, 402-408 (2001).</li>
<li>Traherne, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIR+haplotypes+are+associated+with+late-onset+type+1+diabetes+in+European-American+families%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">KIR haplotypes are associated with late-onset type 1 diabetes in European-American families.</a> Genes and Immunity. 17, 8-12 (2016).</li>
<li>Hydes, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+genetic+determinants+in+the+outcome+of+HCV+infection%3A+Evidence+for+discrete+immunological+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">The interaction of genetic determinants in the outcome of HCV infection: Evidence for discrete immunological pathways.</a> Tissue Antigens. 86, 267-275 (2015).</li>
<li>Dunphy, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2DL1%2C+2DL2+and+2DL3+all+contribute+to+KIR+phenotype+variability+on+human+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">2DL1, 2DL2 and 2DL3 all contribute to KIR phenotype variability on human NK cells.</a> Genes and Immunity. 16, 301-310 (2015).</li>
<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((qKAT%3A+A+high-throughput+qPCR+method+for+KIR+gene+copy+number+and+haplotype+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">qKAT: A high-throughput qPCR method for KIR gene copy number and haplotype determination.</a> Genome Medicine. 8, 1-11 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wir beschrieben eine neue halbautomatische Hochdurchsatz-Methode, genannt qKAT, das erleichtert die Kopie Nummer eingeben, KIR Gene. Die Methode ist eine Verbesserung gegenüber herkömmlichen Methoden wie SSP-PCR, die niedrig-Durchsatz und können nur zeigen das Vorhandensein oder Fehlen dieser höchst polymorphen Gene.
Die Genauigkeit der erhaltenen Kopie Zahl Daten ist abhängig von mehreren Faktoren ab, einschließlich der Qualität und Konzentration-Einheitlichkeit der gDNA Proben und die Qualität der Reagenzien. Die Qualität und Genauigkeit der gDNA Proben über einen Teller sind extrem wichtig, da Schwankungen in der Konzentration auf den Teller legen Fehler bei der Berechnung der Kopienzahl führen können. Da die Assays mit europäischen Ursprungs-Sample-Sets validiert wurden, benötigen Daten von Kohorten aus anderen Teilen der Welt eine gründlichere Prüfungen. Dies soll sicherstellen, dass Instanzen von Allel ausfallende oder nicht-spezifische Primer/Sonden Bindung nicht als Copy Number Variation fehlinterpretiert werden.
Während die Assays wurden entworfen und optimiert, um als Hochdurchsatz-laufen, können sie geändert werden, um weniger Beispiele auszuführen. Vertrauen-Metrik in der Kopie Zahl Analysesoftware ist betroffen, wenn weniger Proben analysieren, aber dies kann verbessert werden, wenn Kontrolle genomische DNA-Proben mit bekannten KIR gen Ausfertigung eine eigene Nummer auf dem Teller enthalten sind und zusätzliche Probe repliziert werden iinklusive.
Für Labors ohne Flüssigkeit/Platte-Handling-Roboter master-Mix mit Mehrkanal-Pipetten verzichtet werden kann und Platten können manuell in das qPCR-Gerät geladen werden.
Das Hauptziel hinter der Entwicklung des qKAT war eine einfache, hohem Durchsatz, hochauflösende und kostengünstige Methode, Genotyp KIRs für Krankheit Assoziationsstudien erstellen. Dies wurde erfolgreich, da qKAT beschäftigt war, bei der Untersuchung der Rolle von KIR in mehrere große Krankheit Assoziationsstudien, einschließlich einer Reihe von Infektionskrankheiten, Autoimmunerkrankungen und Schwangerschaft Störungen4, 24 , 25 , 26.

Bei Menschen, die killer Immunoglobulin-Like-Rezeptor(KIR) Locus auf dem langen Arm von Chromosom 19 innerhalb der Leukozyten Rezeptor-Komplex (LRC) zugeordnet ist. Dieser Locus ist etwa 150 kb in der Länge und umfasst 15 KIR Gene angeordnet Head-to-Tail. Die KIR -Loci, die derzeit bekannt sind sind KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, und zwei Pseudogene, KIR2DP1 und KIR3DP1. Die KIR -Gene kodieren für zweidimensionale (2D) und dreidimensionale (3D) Immunglobulin-ähnliche Domäne Rezeptoren mit kurzen (S; aktivieren) oder lang (L; hemmenden) zytoplasmatischen Endstücke, die durch natürliche Killerzellen (NK) und Teilmengen von T ausgedrückt werden Zellen. Copy Number Variation ausgestellt in der KIR -Locus-Formularen vielfältige Haplotypen mit variabler gen Inhalt1. Non-Allele homologe Rekombination (NAHR), erleichtert durch eine enge Head-to-Tail gen Anordnung und hohe Sequenzhomologie ist der Mechanismus vorgeschlagen, für die Variabilität der Haplotypic verantwortlich. Mehr als 100 verschiedenen Haplotypen wurden in Populationen weltweit1,2,3,4beschrieben. Diese Haplotypen konnte in zwei Hauptgruppen unterteilt werden: A und B Haplotypen. Die A-Haplotyp enthält 7 KIR -Gene: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1und KIR3DL2, die inhibitorische KIR -Gene und die aktivierende KIR sind gen KIR2DS4. Bis zu 70 % der Europäischen stammende Personen, die homozygot für KIR Haplotyp A ausschließlich tragen jedoch eine nicht-funktionale "Löschung" Form der KIR2DS45,6. Alle anderen KIR -gen-Kombinationen bilden Gruppe B Haplotypen, darunter mindestens eine der spezifischen KIR Gene KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, und KIR2DL5, und in der Regel zwei oder mehr aktivierenden KIR -Gene enthalten.
HLA Klasse I Moleküle wurden identifiziert als Liganden für bestimmte hemmende Rezeptoren (KIR2DL1 KIR2DL2, KIR2DL3und KIR3DL1), aktivierenden Rezeptoren (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5, und KIR3DS1), und für KIR2DL4, das ist eine einzigartige KIR , die enthält eine lange zytoplasmatischen Schwänzen wie andere hemmenden KIR-Rezeptoren, sondern hat auch einen positiv geladenen Rest in der Nähe der extrazellulären Domäne ist eine gemeinsame Funktion von anderen aktivierenden KIR -Rezeptoren. Die Kombination von Varianten innerhalb der KIR-Gene und die HLA-Gene beeinflusst Rezeptor Liganden Interaktion dieser Formen möglicher NK Zelle Reaktionsfähigkeit auf der individuellen Ebene7,-8. Nachweis von genetischen Assoziationsstudien hat angedeutet, dass KIR in virale Resistenz (z. B.., humanen Immundefizienz-Virus [HIV]9 und Hepatitis C-Virus [HCV]10) eine Rolle spielt den Erfolg der Transplantation 11, das Risiko einer Schwangerschaft Störungen und Fortpflanzungserfolg12,13, der Schutz vor Rückfall nach allogenen hämatopoetischen Stammzellen Transplantation (HSCT)14,15, 16und das Risiko von Krebserkrankungen17.
Die Kombination von hohen Sequenzhomologie und Allele und Haplotypic Vielfalt präsentiert Herausforderungen in der Aufgabe genau Genotypisierung KIR -Gene. Konventionelle Methoden der KIR -Gene geben zählen Sequenz-spezifische Primer (SSP) Polymerase-Kettenreaktion (PCR)18,19,20, Sequenz-spezifische Oligonukleotid Sonden (SSOP) PCR21, und Matrix assisted Laser desorption Ionisation-Zeit des Fluges Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS)22. Die Nachteile dieser Techniken sind, dass sie nur teilweise Einblick in das Erbgut einer Person zwar auch mühsam zu führen. Vor kurzem wurde Next Generation Sequencing (NGS) angewandt, um die KIR -Locus speziell zu geben. Während diese Methode sehr mächtig ist, kann es teuer sein, und es ist zeitaufwendig, eingehende Analyse und Daten-Kontrollen durchzuführen.
qKAT ist eine Hochdurchsatz-quantitative PCR-Methode. Während herkömmliche Methoden mühsam und zeitaufwändig sind, diese Methode macht es möglich, fast 1.000 genomische DNA (gDNA) Proben in fünf Tagen ausgeführt und gibt die KIR -Genotyp sowie die Kopienzahl gen. qKAT besteht aus zehn Multiplex-Reaktionen, von die jede zwei KIR Loci richtet und ein Referenz-gen einer festen Kopie Zahl in das Genom (STAT6) verwendet für die relative Quantifizierung des Gens KIR kopieren Nummer23. Dieser Test wurde erfolgreich eingesetzt in Studien, bei denen große Population Panels und Krankheit Kohorten auf Infektionskrankheiten wie HCV, autoimmune Erkrankungen wie Typ-1-Diabetes und Schwangerschaft Störungen wie Präeklampsie, sowie eine genetische zugrunde liegenden Studien, die darauf abzielen, die NK Zelle Funktion1,4,24,25,26zu verstehen.

<table><tbody><tr><td>REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotide</td><td>Sigma</td><td>Sonderanfertigung</td><td>SEQUENZEN: Gelistet in Tabelle 4</td></tr><tr><td>Sonden mit ATTO-Farbstoffen</td><td>markiert Sigma</td><td>Sonderanfertigung</td><td>SEQUENZEN: Gelistet in Tabelle 3</td></tr><tr><td>SensiFAST Sonde No-ROX Kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-86020</td><td>&minus;</td></tr><tr><td>MilliQ Wasser</td><td>&minus;</td><td>&minus;</td><td>&minus;</td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge mit schwingendem Schaufelrotor</td><td>Eppendorf (oder gleichwertig)</td><td>Eppendorf 5810R oder gleichwertiges System</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>OR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuBit Fluorometer</td><td>Life Technologies</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Matrix Hydra</td><td>Thermo Scientific</td><td>109611</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 II Instrument 384-Well</td><td>Roche</td><td>05015243001</td><td></td></tr><tr><td>Twister II Mikroplatten-Handler mit M&eacute; Cour Thermischer Plattenstapler (M&eacute; Caliper</td> <td>Life Sciences</td><td>204135</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Mischer</td><td>Biosan</td><td>BS-010201-AAA</td><td></td></tr><tr><td>Einkanalpipetten (Volumenbereich: 0,5&ndash; 10 & Mikro; L, 2&ndash; 20 & Mikro; L, 20&ndash; 200 & Mikro; L, 200&ndash; 1.000 & Mikro; L; 1-10 mL)</td><td>Gilson (oder gleichwertig)</td><td>F144801, F123600, F123615, F123602, F161201</td><td></td></tr><tr><td>RNase- und DNase-freie Pipettenspitzen, gefiltert (10 & Mikro; L, 20 & Mikro; L, 200 & Mikro; L, 1.000 & Mikro; L, 10 mL)</td><td>Starlab (oder gleichwertig)</td><td>S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001</td><td></td></tr><tr><td>StarTub PS Reagenzreservoir, 55 mL</td><td>STARLAB</td><td>E2310-1010</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>STARLAB</td><td>E1450-0200</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Deep-Well-Platte</td><td>Fisher Scientific</td><td>12194162</td><td></td></tr><tr><td>LC480 384 Multiwell-Platten</td><td>Roche</td><td>04729749001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Siegelfolie</td><td>Roche</td><td>04729757001</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>><SOFTWARE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roche LightCycler 480 Software v1.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1</td><td></td><td></td><td>https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html</td></tr><tr><td>KIR-Haplotyp-Identifikator</td><td></td><td></td><td>http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/</td></tr></tbody></table>

qkat: quantitative flugbuchungssystem typisierung von killer-zelle immunoglobulin-like-rezeptor-gene

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

Killer Cell Immunoglobulin-Like-Rezeptoren (KIR) sind eine Reihe von hemmende und aktivierende immun Rezeptoren auf natürlichen Killer (NK) und T-Zellen, die durch eine polymorphe Cluster von Genen auf Chromosom 19 kodiert. Ihre besten charakterisierten Liganden sind die humanen Leukozyten-Antigen (HLA)-Moleküle, die in großen Histocompatibility complex (MHC) Locus auf Chromosom 6 kodiert sind. Es gibt deutliche Hinweise, dass sie eine bedeutende in der Immunität, Reproduktion und Transplantation Rolle, macht es wichtig, Techniken zu haben, die genau Genotyp kann ihnen. High-Sequenzhomologie, sowie Allele und Kopie Nummer Variation, erschweren jedoch es Design-Methoden, die präzise und effizient Genotyp alle KIR -Gene. Traditionelle Methoden sind in der Regel in die Auflösung der gewonnenen Daten, Durchsatz, Wirtschaftlichkeit und der Zeitaufwand für die Einrichtung und Betreuung der Versuche begrenzt. Wir beschreiben eine Methode namens quantitative KIR halbautomatische Eingabe (qKAT), das ist eine Hochdurchsatz-multiplex Real-Time Polymerase Kettenreaktion-Methode, die die gen Heftnummern für alle Gene in der KIR -Locus bestimmen kann. qKAT ist eine einfache Hochdurchsatz-Methode, die KIR Kopie Nummer Feindaten, bereitstellen kann, die weiter verwendet werden können, um die Variationen in der strukturell polymorphen Haplotypen abzuleiten, die sie umfassen. Diese Kopie Zahl und Haplotyp Daten können für Studien über groß angelegte Krankheit Verbände, Populationsgenetik sowie Untersuchungen zur Expression und funktionelle Wechselwirkungen zwischen KIR und HLAvorteilhaft.

Quantitative Killer Cell Immunoglobulin-Like-Rezeptor (KIR) halbautomatische Eingabe (qKAT) ist eine einfache, hohem Durchsatz und kostengünstige Methode zur Nummer Typ KIR -Gene für ihre Anwendung in Bevölkerung und Krankheit Assoziationsstudien zu kopieren.

qKAT: Quantitative Flugbuchungssystem Typisierung von Killer-Zelle Immunoglobulin-Like-Rezeptor-Gene

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

Diese Methode kann wichtige Fragen über NK-Zellrezeptorgenetik wie Haplotyp-Vielfalt und wie diese mit Krankheiten zusammenhängt beantworten. Die visuelle Demonstration dieser Methode hilft, das Protokoll in Ihrem Labor festzulegen, einschließlich des Automatisierungsprozesses und der Datenanalyse. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass qKAT, im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden, die für quantitative skir automatisierte Typisierung steht, hochdurchsatzig ist und gen copy number liefert.qKAT kann Einblicke in die Krankheitsassoziation geben. Die Implikationen dieser Technik können für die Therapie bei Virusinfektionen wie HIV und Hepatitis C, bei Krebs, bei Stammzelltransplantationen und Schwangerschaftsstörungen nützlich sein. qKAT kann auch bei der Untersuchung der Populationsgenetik sowie bei der Erforschung von Expression und funktionellen Wechselwirkungen zwischen KIR- und HLA-Molekülen angewendet werden.qKAT besteht aus 10 Multiplex-Reaktionen, die speziell auf Exons der beiden KIR-Gene und ein Referenzgen abzielen. In diesem Protokoll sind spezifische Primer so konzipiert, dass sie die Allele des gegebenen Gens und pcR-Ergebnisse in kurzen Amplicons erkennen. Danach werden dual-labelierte spezifische Hydrolysesonden verwendet, um die PCR-Verstärkung in Echtzeit zu überwachen.Die Kopiernummernanalyse verwendet die relative Quantifizierung der ZIEL-KIR-Gene zu einem Referenzgen. qKAT ist so konzipiert und eingerichtet, dass es sich um eine Hochdurchsatztechnik handelt. Daher kann jede Reaktion an knapp 1.000 Proben durchgeführt werden.Die folgenden Schritte zeigen die Schritte, die bei der Vorbereitung und Beschichtung jeder 96-Well-DNA-Platte erforderlich sind. Zunächst, nach der Quantifizierung der DNA, verdünnen Sie die DNA in einer 96-Well-Tiefbrunnenplatte. Schließen Sie mindestens ein Steuerelementbeispiel mit einer bekannten Kopiernummer und ein Nicht-Vorlagensteuerelement ein.Zentrifugieren Sie die Platte bei 450 g für zwei Minuten. Geben Sie dann jede Probe in Quadruplicate in 384-well qPCR-Platten. Danach trocknen Sie die DNA in einem sauberen Bereich bei Raumtemperatur 24 Stunden lang an der Luft.Um eine qKAT-Reaktion für 10 384-Well-Platten einzurichten, zuerst den qPCR-Puffer, Primer und Sonde Aliquots bei vier Grad Celsius auftauen. Bereiten Sie den Master-Mix auf Eis gemäß dem Textprotokoll vor. Verwenden Sie dann eine Mehrkanal-Pipette, um den Master-Mix gleichmäßig über eine 96-Well-Tiefbrunnenplatte zu verteilen.Mit den getrockneten gDNA-Proben 9,5 Mikroliter des Master-Mix in jeden Brunnen der Platte geben. Danach die Platte mit Folie versiegeln und sofort bei vier Grad Celsius aufbewahren. Denken Sie daran, eine kurze Wasserwäsche durchzuführen, um die Nadeln des Flüssigkeitshandhabungssystems zu reinigen, wenn der Dosiermaster auf mehr als einer 384-Well-DNA-Platte gemischt wird.Zentrifugieren Sie die Platte mit den gDNA-Proben drei Minuten lang bei 450 g. Dann inkubieren Sie die Platte bei 4 Grad Celsius, um die DNA wieder aufzuhängen und Luftblasen abzuleiten. Nachdem Sie die Platte über Nacht inkubiert haben, wiederholen Sie die Zentrifugation, um Luftblasen abzuleiten.Legen Sie dann die Platte in das gekühlte Speicherdock. Schließen Sie die qPCR-Maschine an einen Mikroplattenhandler an. Dann programmieren Sie den Mikroplattenhandler entsprechend dem Textprotokoll.Sobald der Lauf abgeschlossen ist, lassen Sie den Roboter die Platte von der qPCR-Maschine abholen und in das Auswurfdock legen. Öffnen Sie nach Abschluss der Verstärkung die qPCR-Software. Öffnen Sie unter der Registerkarte Navigator die gespeicherte Reaktionsexperimentdatei für eine Platte.Öffnen Sie als Nächstes das Fenster Neue Analyse erstellen, und wählen Sie die entsprechenden Einstellungen für die 2. Derivative Max-Methode aus. Wählen Sie dann Filtercomb aus, und stellen Sie sicher, dass die für STAT6 gesammelten Daten ausgewählt sind. Wählen Sie die entsprechende Farbkompensation aus.Klicken Sie auf Berechnen, und klicken Sie dann auf Datei speichern. Um die Daten mit der Methode Punkte anpassen zu analysieren, öffnen Sie das Fenster Neue Analyse erstellen, und wählen Sie die entsprechenden Einstellungen für die Methode Punkte anpassen aus. Wählen Sie dann die richtigen Filter und Farbkompensationen für STAT6 aus.Legen Sie das Rauschband fest, um das Hintergrundrauschen auszuschließen. Danach öffnen Sie die Registerkarte Analyse, und legen Sie die Anpassungspunkte auf drei fest, und wählen Sie Punkte anpassen aus. Speichern Sie Änderungen und wiederholen Sie die Schritte mit den entsprechenden Einstellungen für Fit Point und 2nd Derivative Analysis für die KIR-Gene.Öffnen Sie die Registerkarte Navigator in der qPCR-Software, und wählen Sie Ergebnisse Batch-Export aus. Öffnen Sie dann den Ordner mit den Experimentdateien, und übertragen Sie sie auf die rechte Seite des Fensters. Klicken Sie auf Weiter, und wählen Sie den Namen und Speicherort der Exportdatei aus.Wählen Sie danach den Analysetyp des Interesses aus, und klicken Sie auf Weiter. Stellen Sie sicher, dass der Name der Datei, der Exportordner und der Analysetyp korrekt sind, bevor Sie auf Weiter klicken, um den Exportvorgang zu starten. Wenn sich der Exportstatus in OK ändert, wird der Bildschirm automatisch zum nächsten Schritt verschoben.Stellen Sie sicher, dass alle ausgewählten Dateien erfolgreich exportiert wurden, und klicken Sie auf Fertig. Verwenden Sie dann die Skripte im Textprotokoll, um die exportierten Platten in einzelne Reaktionen aufzuteilen und die Dateien in eine Software zu konvertieren, die durch die Kopiernummernanalysesoftware lesbar ist. Öffnen Sie anschließend die Kopiernummernanalysesoftware, und wählen Sie PCR-Ergebnisdatei in Echtzeit importieren aus, um die von den Skripts erstellten Textdateien zu laden.Wählen Sie schließlich Analysieren aus, und führen Sie die Analyse durch, indem Sie die häufigste Beispielkopienummer auswählen. In diesem Protokoll wurde die halbautomatische Typisierung (qKAT) verwendet, um Zahlentyp KIR-Gene zu kopieren. Die häufigste Kopiernummer für KIR2DL4 war zwei Kopien, während die häufigste Kopiernummer für KIR3DS1 Null war.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es äußerst wichtig, sicherzustellen, dass die DNA genau quantifiziert wird, alle Schritte auf Eis durchzuführen und sicherzustellen, dass die Reagenzien vom Licht bedeckt sind. Es ist auch wichtig, die Rohdaten für Proben, die nicht den bekannten LD-Regeln für KIR-Gene entsprechen, gründlich zu überprüfen. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die Sequenzierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. das Vorhandensein von Fusionsgenen oder die Identifizierung neuartiger Allele.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Methode den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Immungenetik, um die Rolle von KIR in der NK-Zellbiologie, Krankheitsresistenz und menschlicher Fortpflanzung zu erforschen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

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In diesem Video demonstrieren wir eine auf Durchflusszytometrie basierende Technik zur Bestimmung des Anteils von Zytokin-induzierten Killer-T-Zellen, CIK-Zellen, die aus einer mononukleären Zellkultur aus dem peripheren Blut expandiert wurden.

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Schnelle glykoqualitative Bewertung rekombinanter Proteine mit einem vollautomatischen System

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qKAT: Quantitative Flugbuchungssystem Typisierung von Killer-Zelle Immunoglobulin-Like-Rezeptor-Gene

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