Name: Herstellung von Decellularized Knorpel abgeleitet Matrix Gerüste (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Lernen Sie die Herstellung dezellularisierter Knorpel-Matrix-Gerüste für die Geweberegeneration. Diese Methode bewahrt native Knorpelkomponenten und fördert die Knorpelbildung in vitro und in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren möchten W. Boot für Hilfe bei der Herstellung der Gerüste zu bestätigen. K.E.M. Benders stützt sich auf die Alexandre Suerman Stipendium vom University Medical Center. R. Levato und J. Malda werden von der niederländischen Arthritis Foundation unterstützt (Finanzhilfevereinbarungen CO-14-1-001 und LLP-12, beziehungsweise).

Für dieses Protokoll wurde Pferde equine Knie Knorpel entnommen, die aus anderen Ursachen als Arthrose gestorben war. Gewebe wurde mit Erlaubnis der Besitzer, im Einklang mit den institutionellen ethischen Regelungen erhalten.
Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Gerüsten aus decellularized equine Knorpel, die für Anwendungen wie in Vitro Zellkultur-Plattformen oder in Vivo Implantation in regenerative Medizin Strategien verwendet werden können. Die enzymatische Behandlungsschritte müssen in der beschriebenen Reihenfolge durchgeführt werden.
1. Gewinnung von Gelenkknorpel aus Spender (Cadaveric) Gelenke
<ol><li>Vor der Ernte Schritt bereiten Sie 1 L des Knorpels Waschlösung, bestehend aus sterilen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), ergänzt mit 100 U/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin und 1 % (V/V) Amphotericin b.</li>
	<li>Tragen Sie Handschuhe und einen Laborkittel während der gesamten Ernteverfahren, da der Spender Krankheitserreger in sich tragen kann.</li>
	<li>Erhalten Sie ein intakt (cadaveric) Gelenk Knorpel isoliert. Hinweis: An dieser Stelle ist die Haut um das Gelenk noch intakt. Equine Knie Knorpel entnommen Pferd wurde in dieses Protokoll verwendet, aber andere Gelenke von anderen Tierarten können auch verwendet werden.</li>
	<li>Entfernen Sie die Haut, die rund um den gemeinsamen Bereich befindet, mit einem Skalpell und eine chirurgische Pinzette. Darüber hinaus entfernen Sie übermäßiges Fett und Muskel Gewebe bei Bedarf ohne Beschädigung der zugrunde liegenden gemeinsamen. Übertragen Sie die vorbereiteten Kadaver optional zum biologischen Sicherheitsschrank</li>
	<li>Ausführen einer Arthrotomie, d.h., eine Trennung des Gelenks, definieren Sie zunächst den Speicherort, wo das Gelenk artikuliert durch Erweiterung und Beugung des Gelenks.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig mehrere Schichten von Fett, Muskeln und Sehnen mit einem Skalpell und chirurgische Pinzette, die Lötstelle zu öffnen.</li>
	<li>Machen Sie einen Schnitt, der Gelenkspalt zu erreichen. Hinweis: Der Gelenkspalt ist mit Gelenkflüssigkeit, die aus dem Hohlraum abtropft, bei der Durchführung eines korrekten Schnitt gefüllt.</li>
	<li>Weiterhin geöffnet, das Gelenk vollständig durch Durchtrennung der Sehnen, die das Gelenk zusammenhalten.</li>
	<li>Den Knorpel für makroskopische Schäden zu überprüfen. Hinweis: Verwerfen Sie wenn der Gelenkknorpel nicht über ein glänzend und glatt aussehen oder offensichtlich Blasenbildung, Risse oder Mängel vorhanden sind, den Knorpel.</li>
	<li>Verwenden Sie ein steriles Skalpell, um den Knorpel aus dem subchondralen Knochen zu entfernen. Schneiden Sie hinunter den subchondralen Knochen, auch die tiefen Zone des Knorpels (Abbildung 1) zu entfernen. Damit den Knorpel nicht austrocknen, regelmäßig Tropfen Sie Knorpel Waschlösung auf den Knorpel. Hinweis: Zu diesem Zeitpunkt spielt die Größe der Knorpel Scheiben keine Rolle.</li>
	<li>Sammeln Sie die Knorpel-Scheiben in 50 mL Röhrchen mit vorbereiteten Knorpel Waschlösung (Abbildung 2A).</li>
	<li>Nach dem Sammeln des Knorpels aus allen Bereichen des Interesses, Snap freeze Knorpel Scheiben in flüssigem Stickstoff für 5 min.</li>
	<li>Die Knorpel-Scheiben in 50 mL Röhrchen übertragen und sofort lyophilize die Knorpel-Scheiben für 24 h in einer Gefriertrocknungsanlage. Stellen Sie das Einfrieren Trockner auf ca. 0,090 Mbar während der Eis-Kondensator-51 ° C (Abb. 2 b) ist.</li>
	<li>Lagern Sie die Knorpel-Scheiben bis zur Weiterverwendung an einem trockenen Ort bei Raumtemperatur. Hinweis: Bis zu dem Punkt der Gerüst-Formation haben die Lösungen und Knorpel nicht vorbereitet und in eine sterile Weise behandelt werden.</li>
</ol>2. Erstellen von Decellularized Knorpel Partikel
<ol><li>Eintauchen der lyophilisierter Knorpel Scheiben in flüssigem Stickstoff.</li>
	<li>Schleifen Sie direkt die Proben entweder manuell oder durch eine Fräsmaschine. Wenn der Knorpel Scheiben von hand Schleifen, verwenden Sie einen Mörser und Stößel und Schleifen Sie die Scheiben ca. 45 Minuten, bis sie pulverisiert (Abbildung 2 und 2D) sind. Beim Schleifen von automatisch verwenden Sie eine Fräsmaschine mit der voreingestellten Geschwindigkeit für ein paar Sekunden bis zu einer Minute, bis die Snap eingefroren Knorpel Scheiben pulverisiert werden. Hinweis: Kühlen Sie durch Zugabe von flüssigem Stickstoff es zum Mörtel oder das Mahlfach der Fräsmaschine vor. Wenn eine Fräsmaschine verwenden, stellen Sie sicher, dass alle Partikel sind Boden und keine Partikel im unteren Teil das Mahlfach bleiben.</li>
	<li>Die Knorpel-Partikel get rid of größere Teile durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 0,71 mm Sieb.</li>
	<li>Lagern Sie die Partikel an einem trockenen Ort bei Raumtemperatur.</li>
</ol>(3) enzymatische Decellularization mit Trypsin 0.25%-EDTA
<ol><li>Bereiten Sie die Verdauung-Lösung, bestehend aus 0,25 % Trypsin mit EDTA ergänzt mit 100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin und 1 % (V/V) Amphotericin b Store die Lösung bei 4 ° C. Hinweis: Trypin ist eine Protease, die Proteine, die in das Knorpelgewebe degradiert. Diese enzymatische Schritt öffnet sich die dichten Knorpel Struktur.</li>
	<li>Die pulverisierte Knorpel Partikel bis zu einem Volumen von etwa 7,5 mL pro Tube 50 mL Röhrchen einfüllen.</li>
	<li>
Inkubieren Sie die Knorpel-Partikel mit der vorbereiteten Verdauung-Lösung bei 37 ° C für 24 h insgesamt, während der Aktualisierung der Aufschlusslösung alle 4 h.
	<ol>
<li>Fügen Sie zunächst 30 mL der Lösung Verdauung zu jeweils 50 mL-Tube, die Knorpel Partikel enthält.</li>
		<li>Dann erneut die Partikel mithilfe eines Wirbel oder pipettieren, so dass alle Partikel, die enzymatische Lösung ausgesetzt sind.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Proben für 4 h bei 37 ° C auf einer Walze.</li>
		<li>Zum Aktualisieren der Aufschlusslösung Zentrifugieren der Rohre für 20 min bei 3113 X g Sedimentation der Knorpel Partikel verursachen. Verwerfen Sie den überstand. Hinweis: Der Überstand wird mit jedem Trypsin Inkubationszeit klarer.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 3.3.1–3.3.4, bis die Teilchen mit der Verdauung-Lösung für 6 Zyklen von 4 h inkubiert worden sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nach dem letzten Zyklus den Überstand nach Zentrifugieren entfernen und die Partikel in 30 mL des Knorpels Waschlösung zweimal waschen. Zentrifugieren Sie die Partikel für 20 min bei 3113 X g zwischen den einzelnen Waschungen.</li>
</ol>(4) enzymatische Decellularization mit Nuklease Behandlung
<ol><li>Bereiten Sie eine 10 mM Tris-HCl-Lösung bei pH 7,5 in entionisiertem Wasser.</li>
	<li>Der Tris-HCl-Puffer, der Nuklease-Lösung zu erhalten fügen Sie 50 U/mL Deoxyribonuclease und 1 U/mL Ribonuklease A hinzu. Hinweis: Dieser Schritt wird durchgeführt, um insbesondere Deoxyribonucleases und Ribonuclease verschlechtern.</li>
	<li>Um den Knorpel Waschlösung aus Knorpel Partikel (Schritt 3.4) zu entfernen, für 20 min bei 3.113 X gZentrifugieren und den Überstand zu entfernen.</li>
	<li>Die Knorpel-Partikel 30 mL der Nuklease-Lösung hinzu und rühren Sie die Partikel durch die Lösung, um sicherzustellen, dass alle Partikel die Nuklease-Lösung ausgesetzt sind.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Proben auf einer Walze für 4 h bei 37 ° c</li>
	<li>Die Nuklease-Lösung durch die Knorpel-Partikel für 20 min bei 3.113 X g Zentrifugieren entfernen und entsorgen des Überstands.</li>
	<li>Waschen Sie die Proben durch Zugabe von 30 mL 10 mM Tris-HCl-Lösung ohne die Deoxyribonuclease und Ribonuklease A auf die Knorpel-Partikel. Aufschwemmen Sie die Partikel und lassen Sie die Proben auf einer Walze für 20 h bei Raumtemperatur.</li>
</ol>5. Reinigungsmittel Decellularization
<ol><li>Machen Sie die Reinigungslösung durch Auflösen von 1 % (V/V) Octoxynol-1 mit PBS-Puffer.</li>
	<li>Entfernen Sie die Tris-HCl-Lösung von den Knorpel-Teilchen indem für 20 min bei 3.113 X g Zentrifugieren und den Überstand verworfen.</li>
	<li>30 mL die vorbereitete Reinigungslösung von 1 % auf die Knorpel-Partikel hinzugeben. Aufschwemmen der Knorpel Partikel vorsichtig, um zu vermeiden, Schäumen der Lösung. Hinweis: Dieser Schritt bricht Zellmembranen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Proben auf einer Walze für 24 h bei Raumtemperatur auf einer Walze.</li>
	<li>Die Reinigungslösung durch Zentrifugation für 20 min bei 3.113 X g entfernen und entsorgen des Überstands.</li>
	<li>
Entfernen Sie alle Reste der Decellularization Lösungen gewaschen Sie die Knorpel-Partikel in 6 Zyklen von 8 h 30 ml des Knorpels Waschlösung werden. Durchführen Sie waschen auf einer Walze bei Raumtemperatur.
	<ol>
<li>Um in der nächsten Wäsche zu ändern, die Aufhängung für 20 min bei 3.113 X gZentrifugieren, überstand verwerfen und frischen Knorpel Waschlösung hinzufügen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verlassen der letzten Wäsche in den Rohren und speichern die decellularized Knorpel Partikel bei-80 ° C.</li>
</ol>6. erstellen Gerüste von den Decellularized Partikeln
<ol><li>Wenn die Partikel bei-80 ° C gelagert worden, tauen Sie die geschlossenen Röhren, die den Knorpel Partikel in warmem Wasser enthalten, vor dem Erstellen der Gerüste.</li>
	<li>Übertragen Sie die Knorpel-Partikel mit einer kleinen Kelle auf eine zylindrische Form, z. B. ein Kunststoff Fläschchen mit einem Durchmesser von 8 mm und einer Höhe von 2 cm.</li>
	<li>Beim Platzieren von Knorpel-Partikel in der Kunststoff-Formenbau, drücken Sie alle Luftblasen, um Hohlräume in das Gerüst zu vermeiden, und füllen Sie die Form bis zum Rand zu. Hinweis: Es wird immer schwieriger, die Gerüste aus einer Metallform nach Gerüst Bildung nehmen, die zu Rissen in dem Schafott führen kann.</li>
	<li>Frieren Sie die Formen mit Knorpel Partikel für 10 min bei-20 ° C.</li>
	<li>Lyophilize der Knorpel Gerüste innerhalb ihrer Formen für 24 h in einer Gefriertrocknungsanlage.</li>
	<li>Nach der Gefriertrocknung, nehmen das Gerüst aus der Form (Abbildung 3) und vernetzen sie mit Ultraviolett (UV) Licht im Abstand von 30 cm und 365 nm über Nacht.</li>
	<li>Um die Gerüste für in-vitro-Zellkultur oder in-vivo Implantation verwenden, Sterilisieren Sie die Gerüste mit, zum Beispiel Ethylen Oxid (EtO) Gas. Hinweis: EtO Sterilisation erfolgt durch eine externe Partei.</li>
</ol>(7) Charakterisierung der Decellularized Gerüste mit histologischen Färbungen
Hinweis: Komplette Decellularization zu gewährleisten und den verbleibenden natürlichen Charakter des Knorpels zu visualisieren, führen Sie mehrere histologische Färbungen vor der Verwendung der Gerüste in jedem Experiment, einschließlich Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung, um sicherzustellen Decellularization, Safranin-O Färbung um GAG Restpräsenz zu visualisieren, Kollagen Typ I Immunohistochemistry Unterscheidung zwischen Kollagengehalt und Kollagen Typ II Immunohistochemistry zwischen Kollagengehalt unterscheiden.
<ol><li>Schneiden Sie die Gerüste in dünne Scheiben von ca. 3 mm mit einem Skalpell. Hinweis: Die Gerüste in größeren oder kleineren Größen geschnitten werden, wenn die Dauer der Austrocknung Zyklen angepasst werden.</li>
	<li>Betten Sie die Gerüste in einem Rückgang von 4 % (w/V) Alginat ein und induzieren Sie Vernetzung durch Zugabe von einem ähnlichen Volumen von 3,7 % nicht gepuffert Formalin, die 20 mM CaCl2enthält. Hinweis: Einbetten von Alginat macht die Gerüst Scheiben mehr starr im Vergleich zu den Waschschritten vor Paraffin einbetten. Im Fall, dass die Gerüste Zelle ausgesät haben wurden oder in Vivo implantiert, ist die Einbettung von Alginat nicht erforderlich, da die Zusammensetzung der Gerüste resistent genug durch ECM-Aufnahme durch die Zellen werden.</li>
	<li>Austrocknen der Proben durch Einlagerung in eine abgestufte Ethanol-Reihe, beginnend mit einer einstündigen Zyklen von 70 %, 96 %, 96 %, 100 % und 100 % Ethanol, gefolgt von zwei 1 h-Zyklen von Xylol und endend mit zwei 1 h-Zyklen von Paraffin bei 60 ° C.</li>
	<li>Nach Austrocknung Paraffin-Einbetten der Proben in einer Form und kühlen die Proben ab.</li>
	<li>Schneiden Sie die Proben mit ein Mikrotom in 5 μm dicke Scheiben.</li>
	<li>Rehydrieren Sie vor der Färbung die Proben werden, indem sie in einer Reihe zurückgegebene abgestufte Ethanol. Beginnen Sie mit zwei Wäschen von Xylol für 5 min, gefolgt von 2 Wäschen von 100 %, 95 % und 70 % Ethanol für 3 min pro Waschgang. Schließlich waschen Sie die Proben 3 Mal in Wasser 2 min. lang. Hinweis: Stellen Sie bei der Verwendung von Alginat, um Proben für Paraffin einbetten zu verarbeiten sicher, das Alginat mit 10 mM Zitronensäure vor Rehydratation von Paraffin Abschnitte abwaschen.</li>
	<li>Färben Sie die Proben mit Hämatoxylin und Eosin, Safranin-O, Kollagen I und Kollagen II als vorherigen beschriebenen11.</li>
</ol>(8) Charakterisierung der Decellularized Gerüste mit quantitativen Analysen
<ol><li>Erhalten Sie Papain verdaut die Gerüste wie oben beschrieben11.</li>
	<li>Führen Sie einen Test mit einem Fluoreszenz-basierte DNA Quantifizierung Kit zur Messung der Doppel-Strang DNA-Gehalt von Gerüsten, vollständige Decellularization zu gewährleisten. Das Protokoll des Herstellers zu folgen. Drücken Sie die Menge an DNA pro Trockengewicht des Gerüstes.</li>
	<li>Führen Sie einen blauen Dimethylmethylene-Assay um den Rest der GAGs in das Gerüst zu quantifizieren, wie zuvor beschrieben11. Den Betrag in GAG pro DNA ausdrücken.</li>
</ol>9. Aussaat Decellularized Gerüste
<ol><li>Schneiden Sie sterilisierte Gerüste aus Schritt 6,7 in 3 mm dicke Scheiben.</li>
	<li>Die Gerüste in separaten Brunnen von einem 6-Well-Platte zu übertragen.</li>
	<li>Gerüste mit Zellkulturmedium durch Pipettieren 1 mL des Mediums auf dem Schafott rehydrieren und lassen Sie es für 30 min. Einweichen Knorpelzelltransplantation oder mesenchymalen Stammzellen (MSC) Ausbau Medium verwenden. Hinweis: Verwenden Sie das gleiche Medium für Gerüst Rehydratation für Zellkultur der Zellen, die ausgesät werden. Knorpelzelltransplantation Erweiterung Medium besteht aus Dulbeccos veränderten Medien (DMEM) mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS), 100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin und 10 ng/mL Fibroblasten Wachstumsfaktor-2 (FGF-2). MSC Erweiterung Medium besteht aus mindestens wesentliche mittlere Alpha (MEM) mit 10 % Hitze-inaktivierten FBS, 0,2 mM L-Ascorbinsäure Säure 2-Phosphat, 100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin und 10 ng/mL FGF-2.</li>
	<li>Bereiten Sie 3 x 106 Zellen in 100 μl Medium, welches das erforderliche Volumen für jedes Gerüst mit einem Durchmesser von 8 mm und einer Höhe von 3 mm ist. Hinweis: Für die Aussaat können mehrere Zelltypen aus verschiedenen Arten verwendet werden. Bei Verwendung von Chondrozyten oder mesenchymaler Stromazellen Zellen Isolieren Sie die Zellen wie oben beschrieben11. Bei der Verwendung von Chondrozyten stellen Sie sicher, dass sie nicht hinter der P1-Passage um Minimierung der Anzahl von entdifferenzierten Chondrozyten erweitert wurden. Wenn Sie mesenchymale Stromazellen Zellen verwenden, müssen sie auf ihre Fähigkeit zur Differenzierung der Multi-Linie, wie zuvor beschrieben14getestet werden.</li>
	<li>Pipettieren 50 μL der Zellsuspension auf dem eingeweichter Gerüst vorbereitet und das Gerüst für 1 h bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Vorsichtig drehen Sie das Gerüst auf den Kopf nach unten, pipettieren die restlichen 50 μL der Zellsuspension auf dieser Seite des Gerüstes und 1 h bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Nach der Inkubation der Brunnen 3 mL Medium hinzu, und Kultur der Zelle ausgesät Gerüste bei 37 ° C. Behandeln Sie die Kultur-Platte sanft um die Loslösung der Zellen zu vermeiden.</li>
	<li>Kultur der Gerüste für die Zeit, die für das Experiment benötigt und das Medium 2 – 3 Mal pro Woche zu verändern. Pipettieren langsam und so weit weg von dem Gerüst wie möglich.</li>
	<li>Nach der Kultivierung von Zellen ausgesät Gerüst, Halbierung der Gerüste und für Histologie und biochemische Analysen zu verarbeiten.</li>
</ol>

<ol><li>Dunlop, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+for+functional+decline+in+older+adults+with+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+rheumatism%22%5BJournal%5D)">Risk factors for functional decline in older adults with arthritis.</a> Arthritis and rheumatism. 52 (4), 1274-1282 (2005).</li>
<li>Fitzpatrick, K., Tokish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+military+perspective+to+articular+cartilage+defects%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+knee+surgery%22%5BJournal%5D)">A military perspective to articular cartilage defects.</a> The journal of knee surgery. 24 (3), 159-166 (2011).</li>
<li>Flanigan, D. C., Harris, J. D., Trinh, T. Q., Siston, R. A., Brophy, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+chondral+defects+in+athletes%27+knees%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+and+science+in+sports+and+exercise%22%5BJournal%5D)">Prevalence of chondral defects in athletes' knees: a systematic review.</a> Medicine and science in sports and exercise. 42 (10), 1795-1801 (2010).</li>
<li>Martel-Pelletier, J., Boileau, C., Pelletier, J. P., Roughley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+in+normal+and+osteoarthritis+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Best+practice+%26+research.+Clinical+rheumatology%22%5BJournal%5D)">Cartilage in normal and osteoarthritis conditions.</a> Best practice & research. Clinical rheumatology. 22 (2), 351-384 (2008).</li>
<li>Vinatier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+tissue+engineering%3A+towards+a+biomaterial-assisted+mesenchymal+stem+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+stem+cell+research+%26+therapy%22%5BJournal%5D)">Cartilage tissue engineering: towards a biomaterial-assisted mesenchymal stem cell therapy.</a> Current stem cell research & therapy. 4 (4), 318-329 (2009).</li>
<li>Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+matrices+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Decellularized matrices in regenerative medicine.</a> Acta biomaterialia. 74, 74-89 (2018).</li>
<li>Vashi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Outcomes+for+Breast+Cancer+Patients+Undergoing+Mastectomy+and+Reconstruction+with+Use+of+DermACELL%2C+a+Sterile%2C+Room+Temperature+Acellular+Dermal+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+Surgery+International%22%5BJournal%5D)">Clinical Outcomes for Breast Cancer Patients Undergoing Mastectomy and Reconstruction with Use of DermACELL, a Sterile, Room Temperature Acellular Dermal Matrix.</a> Plastic Surgery International. 2014 (704323), 1-7 (2014).</li>
<li>Satterwhite, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abdominal+wall+reconstruction+with+dual+layer+cross-linked+porcine+dermal+xenograft%3A+the+%26%2334%3BPork+Sandwich%26%2334%3B+herniorraphy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+plastic%2C+reconstructive+%26+aesthetic+surgery+%3A+JPRAS%22%5BJournal%5D)">Abdominal wall reconstruction with dual layer cross-linked porcine dermal xenograft: the &#34;Pork Sandwich&#34; herniorraphy.</a> Journal of plastic, reconstructive & aesthetic surgery : JPRAS. 65 (3), 333-341 (2012).</li>
<li>Martinello, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+recellularization+of+human+tendon+scaffolds+using+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+and+collagen+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">Successful recellularization of human tendon scaffolds using adipose-derived mesenchymal stem cells and collagen gel.</a> Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 8 (8), 612-619 (2014).</li>
<li>Benders, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+scaffolds+for+cartilage+and+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration.</a> Trends in biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).</li>
<li>Benders, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+Stromal+Cells+Outperform+Chondrocytes+on+Cartilage-Derived+Matrix+Scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Cartilage%22%5BJournal%5D)">Multipotent Stromal Cells Outperform Chondrocytes on Cartilage-Derived Matrix Scaffolds.</a> Cartilage. 5 (4), 221-230 (2014).</li>
<li>Gawlitta, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+cartilage-derived+matrix+as+substrate+for+endochondral+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Decellularized cartilage-derived matrix as substrate for endochondral bone regeneration.</a> Tissue engineering. Part A. 21 (3-4), 694-703 (2015).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+repair+of+cartilage+defects+with+a+novel+acellular+cartilage+matrix+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Fabrication and repair of cartilage defects with a novel acellular cartilage matrix scaffold.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. 16 (5), 865-876 (2010).</li>
<li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284 (5411), 143-147 (1999).</li>
<li>Meyer, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+reduces+the+immune+response+to+aortic+valve+allografts+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+thoracic+and+cardiovascular+surgery%22%5BJournal%5D)">Decellularization reduces the immune response to aortic valve allografts in the rat.</a> The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 130 (2), 469-476 (2005).</li>
<li>Brown, B. N., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., McCabe, G. P., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+phenotype+and+remodeling+outcomes+in+response+to+biologic+scaffolds+with+and+without+a+cellular+component%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Macrophage phenotype and remodeling outcomes in response to biologic scaffolds with and without a cellular component.</a> Biomaterials. 30 (8), 1482-1491 (2009).</li>
<li>Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+ineffective+decellularization+of+biologic+scaffolds+on+the+host+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response.</a> Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).</li>
<li>Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+tissue+and+whole+organ+decellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An overview of tissue and whole organ decellularization.</a> Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).</li>
<li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice%2C+men+and+elephants%3A+the+relation+between+articular+cartilage+thickness+and+body+mass%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Of mice, men and elephants: the relation between articular cartilage thickness and body mass.</a> PloS One. 8 (2), e57683(2013).</li>
<li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+depth-dependent+characteristics+of+equine+and+human+osteochondral+tissue+from+the+medial+and+lateral+femoral+condyles%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Comparative study of depth-dependent characteristics of equine and human osteochondral tissue from the medial and lateral femoral condyles.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 20 (10), 1147-1151 (2012).</li>
<li>Londono, R., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologic+scaffolds+for+regenerative+medicine%3A+mechanisms+of+in+vivo+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling.</a> Annals of biomedical engineering. 43 (3), 577-592 (2015).</li>
<li>Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+tissue+and+organ+decellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Strategies for tissue and organ decellularization.</a> Journal of cellular biochemistry. 113 (7), 2217-2222 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Das ECM des Gelenkknorpels ist sehr dicht und sehr widerstandsfähig gegenüber verschiedenen enzymatischen Behandlungen. In diesem Artikel beschriebenen mehrstufigen Decellularization-Protokoll befasst sich mit solchen Widerstand und erfolgreich erzeugt decellularized Matrizen. Um dies zu erreichen, erstreckt sich der Prozess über mehrere Tage. Viele Decellularization Prozesse sind für verschiedene Arten von Gewebe18vorgeschlagen worden, und dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Decellula...

Mängel der Gelenkknorpel im Knie verursacht durch traumatische Ereignisse können zu Unbehagen führen, und vor allem können haben einen großen Einfluss auf das Leben der jungen und aktiven Bevölkerung1,2,3. Darüber hinaus kann Knorpelschäden an einem jungen Alter zu einen schnelleren Wirkungseintritt Arthrose später im Leben4führen. Derzeit ist die einzige Salvage-Therapie für generalisierte Osteoarthritis des Knies Gelenkersatz. Knorpel ist ein Hypocellular, Aneural und avaskuläre Gewebe, ist seine Regenerationsfähigkeit stark eingeschränkt. Regenerative Medizin Ansätze sind daher begehrt zu helfen und die Regenerationsfähigkeit der nativen Gewebe zu stimulieren. Zu diesem Zweck sind Gerüste entwickelt und verwendet als entweder Zellträger oder als eine induktive Material, die stachelt Differenzierung und Regeneration des Gewebes durch den Körper native Zellen5.
Decellularized Gerüste sind weit verbreitet in der regenerativen Medizin6untersucht worden. Es hatte einige Erfolge, beispielsweise bei der Unterstützung der Regeneration der Haut7, Abdominal-Strukturen8und Sehnen9. Der Vorteil der Verwendung decellularized Gerüste ist ihre natürlichen Ursprungs und ihre Fähigkeit, bioaktive Hinweise zu behalten, die sowohl anziehen und Zelldifferenzierung in der entsprechenden Linie für Gewebe-Reparatur-6,-10erforderlich induzieren. Darüber hinaus sind da extrazellulärer Matrix (ECM) eine natürliche Biomaterialien ist und Decellularization eine mögliche Immunantwort verhindert durch Entfernen von zellulären oder genetischen Inhalten, Fragen der Biokompatibilität und biologische Abbaubarkeit überwinden.
Knorpel-abgeleitete Matrix (CDM) Gerüste haben große Chondrogenic im in-vitro-Experimente, wenn mit mesenchymaler Stromazellen Zellen11ausgesät gezeigt. Darüber hinaus haben diese Gerüste das Potenzial, Form Knochengewebe durch Endochondral Verknöcherung auf ektopische Standorte in in-vivo Einstellungen12gezeigt. CDM-Gerüste führt die Bildung von beide Knochen und Knorpelgewebe, diese Gerüste Potenzial für osteochondrale defekt Reparatur neben Knorpelreparatur halten können.
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll adaptiert von Yang Et Al. (2010)13 für die Herstellung von decellularized CDM-Gerüste von Equine ersticken Knorpel. Diese Gerüste sind reich an Kollagen Typ II und frei von Zellen und enthalten Glykosaminoglykane (GAGs) nach Decellularization. In vitro und in vivo Experimente an (Osteo) Chondral defekt Reparatur können mit diesen Gerüsten durchgeführt werden.

<table><tbody><tr><td>Leichengelenk</td><td></td><td></td><td>Dieses kann als Restmaterial beim örtlichen Metzger oder Tierarztzentrum bezogen werden.</td></tr><tr><td>Sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>Flüssigstickstoff</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%), Phenolrot</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 7,5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desoxyribonuklease I aus der Bauchspeicheldrüse des Rinders</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuklease A aus der Bauchspeicheldrüse des Rinders</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (Octoxynol-1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3125</td><td></td></tr><tr><td>Trinatriumcitratdihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>Alginat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>180947</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethylenoxid Sterilisation</td><td>Synergy Health, Venlo, Niederlande</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multipotente Stromazellen/Chondrozyten von Pferdespendern,</td><td></td><td></td><td>MSCs und Chondrozyten können aus Spendergelenken isoliert werden, bei denen es sich um Restmaterial handelt, das vom örtlichen Metzger oder Veterinärzentrum stammt.</td></tr><tr><td>MEM alpha</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>22561</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure 2-phosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>41965</td><td></td></tr><tr><td>Hitzeinaktiviertes Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10735086001</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 (FGF-2)</td><td>R & D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Quantifizierungskit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagenz)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>P7581</td><td></td></tr><tr><td>1,9-Dimethyl-Methylen Blaues Zinkchlorid Doppelsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341088</td><td></td></tr><tr><td>Gefriertrockner</td><td>SALMENKIPP</td><td>ALPHA 1-2 LD plus</td><td></td></tr><tr><td>Analysemühle</td><td>IKA</td><td>A 11 basischer</td><td></td></tr><tr><td>Mörser/Stößel</td><td>Haldenwanger 55/0A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rollenplatte</td><td>CAT</td><td>RM5</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge (für 50 mL Röhrchen)</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Kapsel (zylindrische Form)</td><td>TAAB</td><td>8 mm flach</td><td></td></tr><tr><td>Superlite S UV</td><td>Lumatec</td><td>2001AV</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sieb (Maschenweite 0,71 mm)</td><td>VWR</td><td>34111229</td><td></td></tr><tr><td>Skalpell</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skalpellhalter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleiner Löffel</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von decellularized knorpel abgeleitet matrix gerüste

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Osteochondrale Defekte fehlen ausreichende intrinsische Reparatur Kapazität, funktionell gesunde Knochen und Knorpel Gewebe zu regenerieren. Insofern hat Knorpel Forschungsschwerpunkt auf die Entwicklung der regenerativen Gerüste. Dieser Artikel beschreibt die Entwicklung von Gerüsten, die vollständig aus natürlichen Knorpel extrazelluläre Matrix, aus einem equine Spender stammen. Mögliche Anwendungen der Gerüste sind produzieren Allografts für Knorpelreparatur, dienen als Gerüst für osteochondrale Tissue engineering und Bereitstellung von in-vitro-Modellen um Gewebeanordnung zu studieren. Von einem Gewebe, die Spenderzellen werden entfernt, aber viele der natürlichen bioaktiven Cues werden gedacht, um beibehalten werden. Der wesentliche Vorteil der Verwendung einer natürlichen Gerüst im Vergleich zu einem synthetisch hergestellten Gerüst ist, dass keine weiteren Funktionalisierung von Polymeren Laufwerk osteochondrale Geweberegeneration erforderlich ist. Die Knorpel-abgeleitete Matrix-Gerüste können für Knochen und Knorpel Geweberegeneration in in vivo und in vitro-Einstellungen verwendet werden.

Decellularization CDM Gerüste muss immer bestätigt werden, mit histologischen Färbungen sowie die Verwendung von DNA-Quantifizierung, um die Menge an DNA-Reste zu messen. Unzureichende Decellularization kann zu unerwünschten Immunreaktionen führen, die Einfluss auf die Ergebnisse in in-vivo Einstellungen15,16,17. Für diese spezifische Decellularization-Methode, DNA war unter den Erfassungsbereich...

Decellularized Knorpel stammenden Gerüste als ein Gerüst, um Führer Knorpelreparatur sowie ein Mittel lässt sich um osteochondrale Gewebe zu regenerieren. Dieses Papier beschreibt den Decellularization Prozess im Detail und enthält Vorschläge, diese Gerüste in in-vitro-Einstellungen zu verwenden.

Herstellung von Decellularized Knorpel abgeleitet Matrix Gerüste

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

Diese Methode bietet eine Möglichkeit, Gerüste aus nativem Gewebe zu erstellen, die für die Knorpelregeneration verwendet werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass Komponenten des einheimischen Knorpels in den Gerüsten konserviert werden, die die Knorpelbildung und -regeneration in vitro und in vivo fördern können. Obwohl diese Methode Knorpel aus Pferde-Stifle-Gelenke verwendet, Knorpel von allen anderen Gelenken kann auch verwendet werden.Um zu beginnen, erhalten Sie ein intaktes kadaverisches Gelenk für Knorpelisolierung und entfernen Sie die Haut überschüssiges Fett und Muskelgewebe, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Als Nächstes definieren Sie die Stelle, an der sich das Gelenk artikuliert, indem Sie eine Verlängerungsbiegung des Gelenks durchführen. Machen Sie einen horizontalen Schnitt, um die Gelenkhöhle zu erreichen.Als nächstes machen Sie einen vertikalen Schnitt, um den Gelenkbereich zu öffnen. Die Gelenkhöhle wird mit Synovialflüssigkeit gefüllt, die wahrscheinlich aus der Höhle tropft, wenn sie einen korrekten Schnitt durchführt. Öffnen Sie das Gelenk weiterhin vollständig, indem Sie übermäßiges Fett, Muskeln und Sehnen entfernen und die Sehnen durchschneiden, die das Gelenk zusammenhalten.Prüfen Sie den Knorpel sorgfältig auf makroskopische Schäden. Wenn der Gelenkknorpel kein glänzenderglattes Aussehen hat oder Wenn Beweise, Blasenbildung, Spalten oder Defekte vorhanden sind, entsorgen Sie den Knorpel und fangen Sie wieder an. Verwenden Sie ein steriles Skalpell, um den Knorpel aus dem Knochen zu entfernen.Schneiden Sie den ganzen Weg bis zum subchondralen Knochen, um den tiefen Zonenknorpel zu entfernen. Sammeln Sie die entfernten Knorpelscheiben in 50 Milliliter-Rohren mit zuvor vorbereiteter Knorpelwaschlösung. Während der Verarbeitung, regelmäßig tropfen Knorpel Waschlösung auf den Knorpel, um zu verhindern, dass der Knorpel austrocknen.Nachdem Sie den Knorpel aus allen Interessengebieten gesammelt haben, die Knorpelscheiben in flüssigem Stickstoff für fünf Minuten einfrieren. Dann die Knorpelscheiben in 50-Milliliter-Rohre geben und die gefrorenen Scheiben sofort in einen Gefriertrockner geben. Lyophilisieren Sie die Knorpelscheiben 24 Stunden lang mit dem Gefriertrockner.Nach Fertigstellung die gefriergetrockneten Knorpelscheiben an einem trockenen Ort bei Raumtemperatur aufbewahren. Für die manuelle Verarbeitung einen Mörtel vorkühlen und mit flüssigem Stickstoff bewerfen, dann die lyophilisierten Knorpelscheiben in den Mörtel legen und unterTauchen und flüssigen Stickstoff. Die Proben ca. 45 Minuten direkt von Hand mahlen, bis sie ausreichend pulverisiert sind.Alternativ können Sie die Proben automatisch mit einer Fräsmaschine mahlen, indem Sie zunächst den Schleifraum der Fräsmaschine durch Zugabe von flüssigem Stickstoff vorkühlen. Dann fügen Sie die lyophilisierten Knorpelscheiben und fräsen Sie die Probe mit ihrer voreingestellten Geschwindigkeit für ein paar Sekunden bis zu einer Minute. Stellen Sie sicher, dass alle Partikel geschliffen sind und keine Partikel im Boden des Schleifraums verbleiben.Schließlich folgen Sie zusammen mit der Dezellularisierungstechnik, die im begleitenden Textprotokoll beschrieben ist, bevor Sie Gerüste bilden. Die Knorpelpartikel mit einem kleinen Etikett in eine zylindrische Kunststoffform übertragen. Drücken Sie alle Luftblasen heraus, um Hohlräume im Gerüst zu vermeiden und die Form vollständig zu füllen.Um Hohlräume im Gerüst zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass Luftblasen ausgepresst werden, während die Form mit Knorpelpartikeln gefüllt wird. Nach der Bildung die Form für 10 Minuten bei minus 20 Grad Celsius einfrieren. Dann lyophilisieren Sie die Knorpelgerüste innerhalb der Form für 24 Stunden in einem Gefriertrockner.Nach der Lyophilisierung das Gerüst vorsichtig aus der Form entfernen. Stellen Sie das Gerüst unter eine 365 Nanometer Wellenlänge UV-Licht und kreuzen Sie es über Nacht. Bilden Sie Gerüstscheiben, indem Sie sterilisierte Gerüste in drei Millimeter dicke Scheiben schneiden.Dann die Gerüste in separate Brunnen einer sechs Brunnenplatte übertragen. Fügen Sie einen Milliliter Chondrozyten-Erweiterungsmedium auf das Gerüst und lassen Sie sie für 30 Minuten rehydrieren. Während die Gerüste rehydrieren, bereiten Sie die Zellen und Pipette 50 Mikroliter der vorbereiteten Zellsuspension auf dem vorgetränkten Gerüst vor.Dann das Gerüst für eine Stunde bei 37 Grad Celsius bebrüten. Wenn Sie Chondrozyten verwenden, stellen Sie sicher, dass sie nicht über den ersten Durchgang hinaus erweitert wurden, um die Anzahl der differenzierten Zellen zu minimieren. Nach einer Stunde den Teller zur Kulturhaube zurückgeben und das Gerüst vorsichtig umdrehen.Die restlichen 50 Mikroliter Zellsuspension auf dem Gerüst anpfeifen und eine weitere Stunde bei 37 Grad Celsius bebrüten. Nach der Inkubation drei Milliliter Medium mit Gerüsten in die Brunnen geben. Vermeiden Sie das Pipettieren des Mediums direkt auf das Gerüst und behandeln Sie die Kulturplatte sanft, um eine Ablösung der Zellen zu vermeiden.Bringen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius an den Brutkasten und die Kulturzelle abgetretene Gerüste zurück. Eine Kombination aus historlogischer Färbung und DNA-Quantifizierung wurde verwendet, um zu zeigen, dass die in diesem Artikel vorgestellten Methoden zu einer ausreichenden Knorpelgerüstdezellularisierung führen. Die resultierenden Gerüste enthielten keine Zellen zusammen mit nicht nachweisbaren DNA-Werten.Sie haben auch keine Glykosaminoglykane und sind reich an Kollagen II. Hier wird die Neomatrixbildung auf Gerüsten beobachtet, die mit mesenchymalen Stammzellen abgetreten wurden, die vier Wochen lang kultiviert wurden. Die Bildung von Glykosaminoglykanen ist nach vier Wochen reichlich vorhanden. Nach dem Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig zu untersuchen, ob die Dezellularisierung erfolgreich war, bevor Sie sie in einer Anwendung verwenden.Nach diesem Verfahren können zusätzliche biochemische Analysen wie Western Blot Analyzer durchgeführt werden, um spezifische Fragen über das Vorhandensein anderer Komponenten wie Wachstumsfaktoren zu beantworten. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Gewebetechnik, um Strategien für die Knorpelregeneration mit dezellularisiertem Gewebe aus allogenen und syngenischen Quellen zu erforschen. Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen eines Labormantels und Handschuhe sollten immer getroffen werden.

fabrication-of-decellularized-cartilage-derived-matrix-scaffolds

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Video demonstriert das Verfahren der Herstellung von Mikrocarriern aus extrazellulärer Matrix durch Elektrospraying. Diese Microcarrier simulieren die native gewebespezifische Mikroumgebung und sind in Langzeit-3D-In-vitro-Zellkulturmodellen stabil.

Herstellung von Biogerüsten durch Elektrospraying: Eine Technik zur Erzeugung von Microcarrier-Gerüsten, die aus der extrazellulären Matrix von dezellularisiertem Gewebe gewonnen werden

Die Knorpelreparatur stellt eine ungelöste medizinische Herausforderung dar und zellbasierte Ansätze zur Entwicklung von menschlichem Gelenkknorpel sind eine vielversprechende Lösung. Hier beschreiben wir dreidimensionale (3D) biomimetische Hydrogele als ideales Werkzeug für die Expansion und Reifung menschlicher Gelenkchondrozyten.

3D-Hydrogel Scaffolds für Articular Chondrozyten-Kultur und Knorpel-Generation

Chondrogenese aus Stammzellen erfordert Feinabstimmung der Kulturbedingungen. Hier präsentieren wir einen magnetischen Ansatz für Zellen Kondensation, ein wesentlicher Schritt Chondrogenese zu initiieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass dynamische Reifung in einem Bioreaktor mechanische Stimulation auf die Zellkonstrukte und verbessert knorpelige extrazelluläre Matrixproduktion gilt.

3D Magnetic Stem Cell Aggregation und Bioreactor Ausreifung für Knorpelregeneration

Die gewebespezifischen extrazellulären Matrix (ECM) ist ein wichtiger Vermittler der Zellfunktion. Dieser Artikel beschreibt Verfahren zur Synthese von reinem ECM-derived Schaumstoffen und Microcarriern , die ohne die Notwendigkeit für eine chemische Vernetzung für Anwendungen in der modernen 3D in vitro Zellkulturmodellen oder als Pro-regenerative bioscaffolds in Kultur stabil ist.

Die Herstellung von extrazellulären Matrix-derived Foams und Mikroträgern als gewebespezifische Zellkultur und Delivery-Plattformen

Hier stellen wir Ihnen und Kontrast zwei Protokolle zum Pflanzengewebe decellularize verwendet: ein Waschmittel-basierten Ansatz und einem Reinigungsmittel-freie Ansatz. Beide Methoden hinterlassen die extrazelluläre Matrix von Pflanzengewebe verwendet, die dann als Gerüste für Tissue-engineering-Anwendungen genutzt werden können.

Zwei Methoden zur Decellularization von Pflanzengewebe für Tissue-Engineering-Anwendungen

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von Polycaprolactons (PCL) Filament mit eingebetteten Polymilchsäure (PLA) Säure Mikrosphären die decellularized Matrizen (DM) für den 3D-Druck von strukturellen Gewebetechnik Konstrukte enthalten.

Neuartiges Verfahren für den 3D-Druck Decellularized Matrizen

Das Ziel dieses Protokolls ist Produktion der gesamten extrazelluläre Matrix Fasern für Wunde Reparatur gezielt die für präklinische Evaluierung im Rahmen eines Implantates, regenerative Gerüst geeignet sind. Diese Fasern hergestellt durch die Kultur der Fibroblasten auf Hohlfaser-Membranen und durch Auflösung der Membranen extrahiert.

Produktion von Fasern der extrazellulären Matrix über Opfer Hohlfaser-Membran Zellkultur

Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau eines Schicht-für-Schicht-Janus-Basis-Nanomatrix-Gerüsts (JBNm) durch nacheinander Hinzufügen von Janus-Basis-Nanoröhren (JBNts), Matrilin-3 und Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1). Der JBNm wurde hergestellt und charakterisiert; Darüber hinaus zeigte es eine ausgezeichnete Bioaktivität, die Zellfunktionen wie Adhäsion, Proliferation und Differenzierung fördert.

Herstellung und Charakterisierung von Schicht-für-Schicht-Janus-Basis-Nano-Matrix zur Förderung der Knorpelregeneration

In dieser Arbeit wird eine neue Methode zur Synthese von Hydrogelen aus dezellularisierter extrazellulärer Knorpelmatrix (DC-ECM) vorgestellt. DC-ECM-Hydrogele haben eine ausgezeichnete Biokompatibilität und bieten eine hervorragende Mikroumgebung für das Zellwachstum. Daher können sie ideale Zellgerüste und biologische Verabreichungssysteme sein.

Synthese von Hydrogelen aus dezellularisiertem Knorpel mit extrazellulärer Matrix

Die dezellularisierte Milzmatrix (DSM) bietet vielversprechende Anwendungen im Bereich des Tissue Engineering in der Leber. Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Vorbereitung des DSM von Ratten, das die Entnahme von Rattenmilz, ihre Dezellularisierung durch Perfusion und die Bewertung des resultierenden DSM zur Bestätigung seiner Eigenschaften umfasst.

Herstellung einer dezellularisierten Milzmatrix aus Ratten

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von 3D-Knochenkonstrukten unter Verwendung menschlicher Osteozyten, die in Methacrylgelatine-(GelMA)-Hydrogelen eingebettet sind und mit einer decellularisierten extrazellulären Matrix ergänzt werden. Die Methode ist kostengünstig, skalierbar und kompatibel mit einfachen Laborgeräten und bietet eine translationale Plattform zur Untersuchung von Prozesse muskuloskelettaler Erkrankungen.

Eine 3D-Knochenkulturplattform mit menschlichen Osteozyten und einer dezellularisierten extrazellulären Matrix zur Modellierung muskuloskelettaler Erkrankungen

Lernen Sie die Herstellung dezellularisierter Knorpel-Matrix-Gerüste für die Geweberegeneration. Diese Methode bewahrt native Knorpelkomponenten und fördert die Knorpelbildung in vitro und in vivo.

Herstellung von Decellularized Knorpel abgeleitet Matrix Gerüste

Weitere Videos entdecken