Ein dreidimensionales thymisches Kultursystem zur Generierung von murine induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Tumor-Antigen-spezifischen thymischen Auswanderern

Die Erzeugung von iPSC-abgeleiteten thymischen Auswanderern durch eine 3D-Thymische Organkultur ist die erste in vivo-Methode zur Regenerierung einer homogenen Population von Tumorantigen-spezifischen naiven T-Zellen. Die Hauptvorteile sind die iTE sind physiologischer relevant, und diese Methode mehr ist stärker als jede andere in vivo Differentialmethode, um ständig eine bestimmte T-Zellen zu produzieren. iTE ist eine homogene Störung von CD8-Alpha-Beta-Anti-Genous-spezifischen T-Zellen mit einem naiven T-Zell-ähnlichen funktionellen Phänotyp, einschließlich der Fähigkeit zur Proliferation, Remodiformation und Tumorunterdrückung in vivo.

Demonstrieren das Verfahren wird Doktor Rafiqul Islam ein Post-Doc in meinem Labor sein. So beginnen Sie Kultur OP9/DLL1-Zellen in OP9-Medien bei 37 Grad Celsius. Wenn die Zellen 80 bis 95 Prozent Koninfluenza erreichen, waschen Sie sie einmal mit einem X Magnesium, Kalzium und phenolrot frei PBS.

Fügen Sie vier Milliliter Punkt Null fünf Prozent Trypsin und inkubieren bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten. Fügen Sie dann vier Milliliter OP9-Medien und Pipetten hinzu, um die Zellschicht zu trennen und eine einzelne Zellsuspension zu bilden. Übertragen Sie die Zellsuspension durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb in ein 50 Milliliter konisches Rohr.

Zentrifuge bei 300 G und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Aspirieren Sie die Suppurate und setzen Sie die Zellen in 12 Milliliter OP9-Medien wieder aus. Dann zwei Milliliter der OP9/DLL1-Zellsuspension in eine neue 10-Zentimeter-Zellkultur Petrischale geben.

Fügen Sie weitere acht Milliliter OP9-Medien hinzu. Wiederholen Sie diese Passage alle zwei bis drei Tage. Am Tag Null ernten die induzierten pluripotenten Stammzellen als Einzelzellsuspension durch Trypsinisierung.

Sammeln Sie die Zellen und Zentrifuge bei 300 G bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die IPC es bei einer Dichte von 100.000 Zellen pro 10 Milliliter OP9-Medien wieder aus. Dann 100 000 Zellen auf eine konfluente OP9/DLL1 10-Zentimeter-Schale.

Fortsetzung der Inkubation bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid. Am dritten Tag die alten Medien ansaugen und durch 10 Milliliter frische OP9-Medien ersetzen. An Tag sechs waschen je 10 Zentimeter konfluent OP9 Schale mit 10 Milliliter PBS.

Fügen Sie drei Milliliter Punkt Null fünf Prozent Trypsin zu jedem Gericht. Und drei bis fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie vier Milliliter OP9-Medien und sanft Pipetten, um die Zellen zu sammeln.

Passieren Sie die Zellen durch ein 100 Mikrometer Zellsieb und Zentrifuge bei 300 G und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Dann entsorgen Sie den Überstand. Unterbrechen Sie die Zellen in 10 Milliliter Differenzierungsmedien.

Die Zellsuspension auf eine neue 10-Zentimeter-OP9/DLL1-Konverflussschale aufteilen. Fortsetzung der Inkubation bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid. Am neunten Tag die alten Medien ansaugen und durch 10 Milliliter frische Differenzierungsmedien ersetzen.

Die Zellen bei 37 Grad Celsius und fünf Prozent CO2 weiter inkubieren. Am 11. Tag, an dem Kardiomyozyten in iPSC-Kolonien beobachtet werden, verwenden Sie eine Pipette, um nicht haftende Zellen mechanisch zu lösen. Filtern Sie die Zellen fünf Minuten lang durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb und eine Zentrifuge bei 300 G und vier Grad Celsius.

Danach den Überstand ansaugen und die Zellen in 24 Milliliter Differenzierungsmedien wieder aussetzen. Die iPSC es in eine konfluente OP9/DLL1 Sechs-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit fünf Prozent Kohlendioxid.

Sammeln Sie am 15. Tag alle nicht haftenden Zellen und filtern Sie sie durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb. Zentrifuge bei 300 G und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Fahren Sie alle drei bis vier Tage mit dem Übergeben der nicht haftenden Zellen fort, wie zuvor beschrieben.

Nehmen Sie am siebten Tag der DGWO-Behandlung vier neue 10-Zentimeter-Gerichte heraus. Füllen Sie jedes Gericht mit 20 Milliliter n. B. Komplettmedien. Übertragen Sie alle Nitrocellulosemembranen mit Thymianlappen in eine 10-Zentimeter-Schale.

Lösen Sie mit Zangen die einzelnen Lappen von der Membran, sodass sie in Medien getaucht werden können. Inkubieren Sie die Lappen für eine Stunde bei Raumtemperatur. Dann die Thymianlappen auf eine neue 10-Zentimeter-Schale mit komplettem Medium übertragen.

Und für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Wiederholen Sie diese Übertragung und Inkubation zusätzlich zweimal. Mit Zangen, fixieren Sie die thymischen Lappen auf die Schale, während sie die andere Hand verwenden, um einen 100 bis 200 Mikrometer tiefen Schnitt in der Mitte zu machen und den halben Durchmesser des Lappens zu verlängern, um die Migration des T-Zellvorläufers in den Lappen zu erleichtern.

Übertragen Sie die Thymianlappen auf eine neue 10-Zentimeter-Schale, die mit vollständigen Differenzierungsmedien gefüllt ist. Wenn Sie 3D-Kulturplatten mit unteren und oberen Gittern verwenden, füllen Sie beide Gitter mit sterilem PPS, um die Verdunstung und Trocknung der hängenden Tropfen zu verhindern. Als nächstes übertragen Sie 30 Mikroliter kompletter Medien, die einen von DER DGWO behandelten Thymianlappen enthalten, in jeden Brunnen der 3D-Kulturplatte.

Sammeln Sie die nicht haftenden T-Linienzellen aus der OP9/DLL1-Kokultur. Und setzen Sie die Zellen mit einer Dichte von 2.000 bis 5 000 T-Zelllinienzellen pro 20 Mikroliter Medien wieder aus. Fügen Sie 20 Mikroliter der T-Linienzellsuspension zu jedem Thymianlappen in der 3D-Kulturplatte hinzu.

Über Nacht bei 37 Grad Celsius mit fünf prozentig Kohlendioxid inkubieren. Am nächsten Tag stellen Sie die P200 Pipette auf 30 Mikroliter. Pipet die Medien in jedem Gut nach oben und unten mehrmals, um alle Zellen um die thymischen Lappen zu entfernen.

Dann die Medien aus jedem Brunnen aspirieren und ersetzen Sie es von 30 Mikroliter ngesamtmedium. Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie das Medium fünf- bis siebenmal verrohren, entfernen und ersetzen, um alle zusätzlichen unreifen T-Zellen zu entfernen, die nicht in die Lappen migrieren. Bebrüten Sie die Lappen weiter und stellen Sie sicher, dass sie täglich 25 bis 30 Mikroliter Medien wechseln.

Verwenden Sie am vierten oder fünften Tag die Lichtmikroskopie, um die Bildung eines Halos von iPSC-abgeleiteten thymischen Auswanderern um die Lappen zu bestätigen. Sammeln Sie die iTE es täglich, indem Sie Medien ohne Lappenunterbrechung pfeifen. Wechseln Sie die Medien jeden Tag und setzen Sie die Sammlung bis zu ca. 12 Tage fort.

Geerntete iTE sind bereit für molekulare Analysen oder In-vivo-Transplantationsexperimente. In dieser Studie werden co-kultivierte fetale Thymuse so geschnitten, ob iPSC abgeleitete T-Zell-Linienzellen in die thymischen Lappen wandern können. Un-Seeded Kontrolllappen haben eine Gewebearchitektur, die sich durch ein astrozytartiges thymisches Epithelnetz aus endogenen CD3-positiven Zellen auszeichnet.

Thymianlappen, die mit iPSC-abgeleiteten unreifen T-Zellen gesät sind, werden jedoch mit CD3-positiven mononukleären Zellen wieder aufgefüllt, was auf die Migration von iPSC abgeleiteten unreifen T-Zellen in die Lappen hinweist. T-Zellen, die in die thymische Mikroumgebung wandern und reifen, treten anschließend als iTE ab. Die zytometrische Flussanalyse wird dann verwendet, um die phänotypische Charakterisierung verschiedener Zellen zu testen.

Extra thymische T-Zellen zeigen CD4, CD8-Doppelpositive T-Zellen und CD8-Alpha-Einzel-positive T-Zellen ohne Expression des positiven Selektionsmarkers, MHC Class One, während iTE eine homogene Population von CD8 alpha einzelnem positiven MHC-Klasse-One-positiven T-Zell-Phänotyp sind, der ihren erfolgreichen Durchgang durch positive Selektion vor dem Austreten aus dem Thymianlappen angibt. iTE haben Antigen-Spezifität gegen Cognate Peptid. iTE ko-kultiviert mit Antigen präsentierenden Zellen, die mit einem irrelevanten Peptid als Nukleoprotein vorinstalliert sind, zeigen sich nicht in einer zellulären Produktion von Zytokinen.

ITE-Cokultur-Antigen, das Mit karierte Zellen mit Kognatepeptid GP100 präsentiert, produziert jedoch intrazellulär TNF alpha interleukin ii und Interferon gamma. Bitte denken Sie daran, dass die offene Zeilenzellenkultur stark vom ABS-Slot abhängig ist. Generierte iTE können in jedem anderen Assay verwendet werden, der mit herkömmlichen T-Zellen arbeitet.

Zum Beispiel, T-Zell-Clearing-Assay, Zytokin-Produktions-Assay, In-vivo-Tumor-Regressionsstudien, T-Zell-Differenzierungsstudie, et cetera. Diese Technologie kann auf viele immunologische oder solche Projekte angewendet werden. Einschließlich einer T-Zell-Differenzierung, Puls-Timing T-Zell-Reifung und die Erzeugung von antigenspezifischen T-Zellen aus Hämatokrit-Vorläufer oder Stammzelle.

Nach dem Betrachten dieses Videos sollte der Betrachter verstehen, wie man induzierte pluripotente, Stammzell abgeleitete, tumorantigenespezifische thymische Auswanderer mit einem 3D-Thymianorgankultursystem erzeugt.