Mikrofluidische Assay für die Beurteilung der Leukozyten Adhäsion an humanen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Endothelzellen (HiPSC-ECs)

Dieses schrittweise Protokoll bietet eine detaillierte Beschreibung der Versuchsanordnung und Datenanalyse für die Bewertung von Entzündungsreaktionen in HiPSC-ECs und die Analyse der Leukozyten Adhäsion unter physiologischen Fluss.

Diese Methode kann helfen, schlüsselhafte Fragen im bereich der menschlichen pluripotenten Stammzellbiologie über die Funktionalität und Entzündungsreaktionen von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Endothelzellen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine detaillierte Beschreibung des Versuchsaufbaus und der Datenanalyse für die Beurteilung der Leukozytenadhäsion an humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Endothelzellen bietet. Für die mikrofluidische Chipbeschichtung einen sterilen Biochip in eine 10-Zentimeter-sterile Petrischale geben und mit einer 10-Mikroliter-Pipettenspitze 10 Mikroliter frisch zubereitete Fibronectin-Arbeitslösung in jeden Kanal des Biochips injizieren.

Bedecken Sie die Petrischale und legen Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius in eine befeuchtete Kammer. Am nächsten Morgen wird der Biochip in einem 37-Grad-Grad-Celsius-Inkubator vorgewärmt und menschliche induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Endothelzellen aus einer 80 bis 100%konfluenten Zellkultur in der gewünschten Konzentration in einem frischen endotheliaalzellserumfreien Medium wieder ausgesetzt. Als nächstes aspirieren Sie die Fibronectin-Lösung aus allen Kanälen des mikrofluidischen Chips, und mischen Sie die Zellen gründlich, um eine homogene Zellsuspension zu erhalten, bevor Sie eine 10-Mikroliter-Pipettenspitze verwenden, um sechs Mikroliter Zellen in jeden Kanal zu injizieren.

Untersuchen Sie den Biochip unter dem Mikroskop, um zu bestätigen, dass die Zellen gleichmäßig mit einer hohen Zelldichte verteilt sind. Nach 15 Minuten bei 37 Grad Celsius 40 Mikroliter endotheliale Zellserum-freies Medium FULL in die mittleren Reservoirs auf beiden Seiten jedes Kanals geben. Und den Biochip für eine Stunde an den Inkubator zurückgeben.

Fügen Sie dann weitere 50 Mikroliter endotheliale Zellserum-freies Medium FULL in die Reservoirs auf beiden Seiten jedes Kanals ein. Bestätigen Sie bei der Live-Bildgebung der Samenzellen, dass die mikrofluidischen Setups bereit sind, dass die Live-Bildgebungskammer auf 37 Grad Celsius ausgeglichen ist und dass der CO2-Gehalt 5% erreicht hat, platzieren Sie den Biochip in den Mikroskopchiphalter und montieren Sie den Chiphalter auf die Mikroskop-Bildgebungsstufe. Um den Biochip über den Verteiler an die Pumpe anzuschließen, stellen Sie den achtpoligen Adapter in der Nähe der Auslassbehälter des Chips auf und vertiefen Sie alle Pins im Medium, ohne die Stifte vollständig zu verbinden.

Wählen Sie in der mikrofluidischen Pumpensoftware Washout/Connect to Chip aus, und klicken Sie auf Assay Step ausführen, um 30 Mikroliter RPMI-Medium durch jeden Pin auszugeben. Dann den achtpoligen Adapter in den Auslass des Biochips einlegen. Verwenden Sie eine Pipette, um das Medium manuell aus allen Einlassbehältern des Biochips zu saugen, und wählen Sie Washout/Chip Washout und Run Assay Step aus, um einen Kanal nach dem anderen mit 40 Mikroliteren endotheliaalzellzellfreiem Medium Full zu durchdringen, um abgestorbene Zellen und Schutt zu entfernen.

Wenn alle Kanäle gewaschen wurden, ersetzen Sie das Medium aus dem Einlassreservoir des Kanals von Interesse mit 100 Mikroliter menschlicher Leukozyten, die auf 2,5 mal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter Konzentration im RPMI-Medium verdünnt werden. Klicken Sie auf Cell Assay/Step description and Set Current Channel/Step description and set the channel of interest to On and the other seven channels to Off. Wählen Sie Cell Assay Step description and click Run Assay Step.

Ersetzen Sie die verbleibenden Leukozyten im Einlassreservoir durch 100 Mikroliter komplettes RPMI-Medium. Und klicken Sie auf Cell Assay Step Beschreibung und Run Assay Step, um den Kanal für fünf Minuten mit RPMI Medium zu durchdringen, um alle nicht haftenden Leukozyten zu entfernen. Dann erfassen Sie Bilder von mindestens drei bis vier verschiedenen Positionen im Kanal, um die haftenden Leukozyten zu visualisieren.

Um die anhaftenden Leukozyten zu quantifizieren, öffnen Sie die CellProfiler Bildverarbeitungssoftware und importieren Sie die Count Leukocytes Pipeline-Datei. Wählen Sie unter Eingabemodule Bilder aus und ziehen Sie den Ordner mit den Rohbildern der anhaftenden Leukozyten in das Dateilistenfenster. Wählen Sie unter Analysemodule Primäre Objekte identifizieren aus und geben die minimalen und maximalen Durchmesser der haftenden Leukozyten in Pixelanteilen an.

Wählen Sie unter Analysemodule FilterObjects aus. Wählen Sie dann die Filterkriterien aus, und geben Sie den minimal akzeptierten Bereich der Objekte in Pixel ein, und klicken Sie auf Bilder analysieren, um mit der Analyse zu beginnen. Eine optimale humaninduzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Endothelzelldissoziation sollte zu einer einzelzellfreien Suspension ohne Zellklumpen führen.

In der Regel, 15 Minuten nach der Injektion werden die Endothelzellen an der Unterseite des Kanals anhaften und beginnen sich zu verbreiten. Innerhalb einer Stunde nach der Injektion sollten die Endothelzellen eine gut verteilte Monoschicht über den Kanal bilden, an der sie für den Einsatz im Flow-Assay bereit sind. Die Verwendung der kostenlosen Open-Source-Bildverarbeitungssoftware, wie gezeigt, ermöglicht das Filtern von identifizierten Objekten basierend auf einer minimalen Fläche und den Ausschluss falsch identifizierter Objekte wie Zellschrott, Autofluoreszenz oder anderen unspezifischen Fluoreszenzsignalen.

Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Stimulation mit pro-inflammatorischen Zytokinen zu optimieren und primäre menschliche Nabelvenenen-Endothelzellen als positive Kontrolle einzubeziehen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit primären Säugetierzellen und Zelllinien extrem gefährlich sein kann und dass Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Labormantel, Handschuhen und Augenschutz immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.