In Vivo Gezielte Expression von optogenetische Proteinen mit Seide/AAV Filme

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Systemneurowissenschaften zu beantworten. Wie zum Beispiel, wie die Aktivität von neuronalen Ensembles sensorische und kognitive Verarbeitung im Gehirn unterstützt. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es die genaue Ausrichtung von optogenetischen Proteinen wie Chan Rhodopsin und GCaMP auf Hirnregionen von Interesse erleichtert, ohne dass ein separates Virusinjektionsverfahren erforderlich ist.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Ablagerung von Seide und Virus in kleine optische Implantate einige Praxis anwenden kann, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Erstens, mischen aufgetaut AAV und fünf bis sieben Punkt fünf Prozent wässriges Seidenfibroin in einem Verhältnis von eins zu eins in einem 200 Mikroliter PCR-Rohr. Die Lösung mehrmals ein- und ausponieren, um AAV und Fibroin gründlich zu mischen.

Um die Seide/AAV abzulegen, laden Sie eine Injektionspipette mit der Menge der Lösung, die für die Anzahl der Faserimplantate erforderlich ist, plus etwa 30 Prozent extra, um Verluste durch Pipettenverstopfung unterzubringen. Als nächstes montieren Sie einen Ferrule-Halter in ein stereotaxic-Gerät, das mit einem Mikroinjektor ausgestattet ist. Legen Sie den Ferrule-Halter über den Mikroinjektor und tragen Sie die Seide/AAV-Mischung von unten auf.

Manövrieren Sie die Injektionspipette, bis sie die Mitte der optischen Faseroberfläche berührt oder fast berührt, und werfen Sie 10 bis 20 Nanoliter Seide/AAV-Lösung aus. Ziehen Sie dann die Pipette zurück. Beobachten Sie als Nächstes den Bolus von Seide/AAV auf der flachen Oberfläche, die als flüssige Kuppel erscheint, die innerhalb von etwa einer Minute zu einem flachen Film trocknet.

Wiederholen Sie die vorherigen Schritte, bis die gewünschte Menge Seide/AAV hinterlegt ist. Bei der Vorbereitung mehrerer Implantate die Seiden-/AAV-Lösung auf ein Implantat auftragen und dann andere Implantate beschichten, bevor Sie zum ersten zurückfinden. Nach einer Stunde Trocknung den gesamten Ferrule-Halter in eine Vakuumkammer geben und über Nacht bei ca. 125 Torr und vier Grad Celsius vakuumieren.

Bewerten Sie am nächsten Tag die Form und Position des resultierenden Seidenfilms unter einem Hochleistungsmikroskop. Stellen Sie sicher, dass die Folien auf die Spitze der Glasfaseroberfläche beschränkt sind, relativ dünn und symmetrisch. Positionieren Sie die Seiden-/AAV-Injektionspipette am Anfang der Verjüngung an der Seite der Optischen Faser, um sicherzustellen, dass die Pipette die Optische Faser berührt.

20 Nanoliter Seide/AAV auswerfen, um den Beschichtungsprozess zu starten, um sicherzustellen, dass das Tröpfchen an der Glasfaser haftet und an der Schnittstelle von Faser und Pipette verbleibt. Leiten Sie das Tröpfchen vorsichtig gegen Ende der Faserspitze ab, wenn die Seide/AAV trocknet, und halten Sie die Injektionspipette in Kontakt mit dem Trocknenderletlet, um eine Verstopfung der Pipettenspitze zu vermeiden. Wenn der erste Bolus fast vollständig getrocknet ist, werfen Sie weitere 20 Nanoliter aus und leiten Sie das Tröpfchen entlang der Verjüngung weiter.

Wiederholen Sie den vorherigen Schritt, indem Sie kleine Mengen Seide/AAV auswerfen und die Lösung nach und nach an der Seite der Verjüngung trocknen. Bewerten Sie nach dem Trocknen die Form und Position des resultierenden Seidenfilms unter einem Hochleistungsmikroskop. Zum Beschichten von GRIN-Linsenimplantaten Seide/AAV in einer einzigen Injektion auf ein GRIN-Linsenimplantat.

Bewerten Sie nach dem Trocknen die Form und Position des resultierenden Seidenfilms unter einem Hochleistungsmikroskop, um sicherzustellen, dass der Film die Oberfläche der Linse bedeckt. Zum Beschichten von Glas-Kranialfenstern wird ein Fünf-Mikroliter-Tröpfchen Seide/AAV auf die Oberfläche eines drei Millimeter runden Deckelschlupfs von Hand pipette, so dass sich das Tröpfchen ausbreitet, um die gesamte Glasoberfläche zu bedecken. Nach dem Trocknen die seiden/AAV-beschichteten optischen Fasern in einem gekühlten Vakuum-Austrocknungor bei 125 Torr und vier Grad Celsius vor dem Implantieren der Geräte aufbewahren.

Fluoreszenzbilder von fluorophor-markierten optogenetischen Proteinen lieferten ein Maß für das Expressionsausmaß der Seiden-/AAV-Filme, und typische optische Fasern können leicht 200 Nanoliter Seide/AAV aufnehmen. Mit der Praxis können Experimentatoren eine hochzuverlässige Expression um die Spitze implantierter Fasern erreichen. Zwei mögliche Probleme mit beschichteten Schädelfenstern sind unzureichender Ausdruck, und Seidenfolien, die sich nicht auflösen und das Sichtfeld verdecken.

Um den Ausdruck zu erhöhen, kann eine Dutrektomie durchgeführt werden, bevor das Fenster implantiert wird, und/oder die Menge des Virus im Film erhöhen. Der beste Ausdruck wurde mit einer Eins- bis Viermischung aus Seide bzw. Stocktiter AAV erreicht. Die Seide menge in beschichteten Fenstern ist 10 bis 100 Mal größer als bei Faserimplantaten, und der Film ist weniger in Gewebe eingebettet und kann daher nicht den gleichen Proteolytika-Aktivitätsniveaus ausgesetzt sein, die Seidenfilme auflösen können.

Jedoch, das Vorhandensein von etwas Seide ist wichtig, um Ihren Ausdruck unter Fenstern zu erreichen, wahrscheinlich, weil ein Film aus Virus allein wird durch interstitielle Flüssigkeit während der Operation weggewaschen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, seidenbeschichtete Implantate so zuzubereiten und zu lagern, wie wir sie beschreiben. Unsachgemäße Lagerung kann die Eigenschaften von Seidenfilmen verändern oder die Wirksamkeit viraler Expressionsvektoren verringern.

Diese Technik kann für Forscher auf dem Gebiet der Systemneurowissenschaften von großem Nutzen sein, um zu erforschen, wie neuronale Aktivität die sensorische und kognitive Verarbeitung im Gehirn von Säugetieren wie Mäusen, Ratten oder sogar nichtmenschlichen Primaten antreibt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit viralen Expressionsvektoren gefährliche und persönliche Schutzausrüstung sein kann, wie Handschuhe, Schutzbrillen und Labormäntel, sollte immer getragen werden, während der Arbeit mit Adeno-assoziierten Virus.