Name: Eine unvoreingenommene Ansatz der Probenahme TEM Abschnitte in den Neurowissenschaften (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Erfahren Sie eine unvoreingenommene Elektronenmikroskopie-Methode zur Analyse neuronaler Strukturen in Gehirngewebe. Dieses automatisierte Protokoll ermöglicht präzise Quantifizierung synaptischer Merkmale mit minimaler Benutzerintervention.

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die hier vorgestellten Workflow ermöglicht den Forscher zum Abrufen von Daten auf Ultrastrukturforschung Funktionen auf unvoreingenommene Weise. Dies ist viel weniger Zeit in Anspruch als Volumen Untersuchungen von Schnittserien. Mehrere Anwendungen werden verwendet, um dieses Ziel zu erreichen. Zunächst wird unsere maßgeschneiderte RPS -Software (für Informationen über Verfügbarkeit, kontaktieren Sie bitte den entsprechenden Autor) verwendet, um einzuführen, eine zufällige Bühne-Schicht um die Probenahme Bereich Koordinaten auszuwählen. Dies ermöglicht eine einheitliche systematische Stichproben des ROI. Als nächstes für die Zählung der spezifischen Strukturen angepasst wir die Disector-Methode, wo 2 aufeinanderfolgende Abschnitte mit bekannten Abstand verglichen werden, in neuartiger Weise im Vergleich zu früheren Studien13,14,15 , wie wir es gewohnt unsere maßgeschneiderte RPS-Software für systematische einheitliche Stichproben. Das spart Zeit im Vergleich zu 3D Rekonstruktion ganze Bände von Schnittserien. Die maßgeschneiderte RPS-Software ist speziell für eine Art von Mikroskop entwickelt, die ein limitierender Faktor für die Reproduktion des Workflows ist. Eine Alternative von dieser speziellen Software wäre eine Anwendung, die erlaubt, scripting und ist kompatibel mit anderen Mikroskop-Modellen.
Wir verwendet erfolgreich diesen Ansatz für unsere Vergleichsstudien4,5. Auf ultra-dünnen Abschnitten des neuronalen Gewebes Interessenbereich wurde skizziert und Bilder wurden durch systematische einheitliche Stichproben innerhalb dieses Bereichs. Es muss darauf hingewiesen werden, dass das Gebiet von Interesse, die polymorphen Schicht der dentate Gyrus, ist ein eher kleines Gebiet zu untersuchen, die für unser Ansatz von Vorteil sein könnte. Innerhalb einer zufällig platzierte Disector wir untersuchten die Anzahl der DCV und mehrere Ultrastrukturforschung Merkmale der Synapsen in der DGpl des Erwachsenen Mäusen in SE und EE sowie Erwachsenen WT Mäuse im Vergleich zu Erwachsenen NPY-Knockout-Mäusen untergebracht. Mit unserem Ansatz, die gesammelten Daten zeigten Veränderungen in einigen der untersuchten Parameter. Diese Feststellungen bestätigt diejenigen aus anderen ähnlichen Studien in juvenile Tiere2.
Ein Nachteil der experimentellen Nutzung dieser Workflow könnte sein, dass diese multi-application-Ansatz nicht im Hinblick auf Benutzerfreundlichkeit, ideal ist, da die Benutzer benötigen, um sich bequem mit verschiedenen Benutzeroberflächen (in unserem Fall, das User-Interface, TEM serielle Abschnitt die RPS und SerialEM Software). Lernen, alle Anwendungen auf effiziente Weise zu behandeln ist zeitaufwendig und sollte Rechnung getragen werden. Allerdings ist investieren die Zeit in das Erlernen dieser Workflow verwenden noch deutlich günstiger im Laufe der Zeit die benötigt wird, um ganze Bände mit seriellen Abschnitt TEM zu analysieren. Die Methode der Verwendung eines Disector durch systematische einheitliche Stichproben in den gewünschten Bereich platziert ist ausreichend, um zuverlässige Daten1 ohne die Notwendigkeit, ein hohes Maß an Abschnitte/Volumen untersuchen zu präsentieren.
Um die Ergebnisse unserer Studien zu maximieren, war es wichtig, während der Probenvorbereitung, gut aufpassen, wie die Erhaltung der Gewebe und Strukturen nicht nur entscheidend für die Bewertung der strukturellen Merkmale, sondern auch für den Bereich eindeutig zu identifizieren. Ein entscheidender Faktor, und vielleicht ein weiterer Nachteil dieser Methode ist, dass eine hohe Qualität der ultra-dünne Abschnitte Paare erforderlich ist: Es darf keine Löcher oder Falten, die das Untersuchungsgebiet aus den Abschnitten zu decken und die Schnittdicke muss sein homogene gepflegt. Der Forscher muss gut ausgebildete in ultramicrotomy sein. Pflege muss auch getroffen werden, wenn die Abschnitte in der TEM, imaging, wie in den Abschnitten empfindlich gegenüber Elektronen Strahl Schaden sind und können leicht zerreißen. Darüber hinaus ist es wichtig, die richtige Anzahl von Stichproben Bereiche in den ROI zu wählen. Abhängig von den experimentellen Ziel muss die Vergrößerung des Elektrons Mikrographen sorgfältig eingestellt werden. Für unsere Experimente sind insbesondere zählen Synapsen im Zentralnervensystem, 20 Regionen von Interesse in einem Abschnitt mit einer Fläche von 30.25 µm2 optimal. Es wird empfohlen, das Personal gut in die Funktionen in Frage (in unserem Fall Synapsen, synaptischen Funktionen und DCV) zu erkennen, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Um die Synapsen zu identifizieren, die synaptischen Vesikel müssen erkennbar sein und dies erfordert eine Auflösung von mindestens 10 nm. Hierzu eine Vergrößerung von 5000 X war optimal, aber es muss darauf hingewiesen werden, dass die Vergrößerung abhängig von Hardware-Parameter wie die Art und Position der Kameras und für andere Mikroskop und/oder Kamera-Typen angepasst werden müssten. Es muss auch darauf hingewiesen, dass das Protokoll Anwendungen spezifisch für eine TEM verwendet und Benutzer mit anderen Modellen die Unterschiede in der Einrichtung zu berücksichtigen müssen.
Wir glauben, dass unser Workflow angepasst werden kann für viele andere Anwendungen, die nicht nur in den Neurowissenschaften, sondern in einem breiten Feld von Biologie und Materialwissenschaften (wenn die hohe Auflösung von einem TEM benötigt wird) wenn die Forschungsfrage eine systematische Uniform erfordert Stichproben und die Menge der zu untersuchenden Proben bittet um eine Zeit effiziente Methode zur Analyse. Zum Beispiel sind wir derzeit interessiert bei der Lokalisierung von Eisenspeicher im menschlichen Gehirn. Hierzu haben wir vor kurzem unseren Workflow, um elementare Analyse auf ultra-dünnen Abschnitten in zufällig ausgewählten Bereichen ermöglichen angepasst. Um die Anzahl der Anwendungen zu minimieren, die für den Workflow benötigt werden, hatten wir vor, bewerben Sie sich über die SerialEM Software nur, weil es programmiert werden kann, verschieben Sie die Phase Punkte vorzugeben, die in einer zufälligen ausgewählt werden können. Wir erstellt benutzerdefinierte Skripts zur Steuerung der TEM, mit dem Ziel, den Workflow vollständig automatisieren. Dies erwies sich als machbar, mit Ausnahme der Autofokus im gefilterten bildgebenden Modus, der nicht zu befriedigenden Ergebnissen. Wir nutzten so DM Software für die Fokussierung und für den Erhalt der Energie-gefilterte Bilder.
Zusammenfassend stellen wir Software-Lösungen, die helfen bei der Beschaffung von Elektron Mikrographen auf unvoreingenommene Weise.

In der Elektronenmikroskopie ist es oft schwierig, repräsentative Regionen innerhalb der Abschnitte zu probieren. Wir sind als Beobachter oft voreingenommen, zu betrachten, bestimmte Regionen von Auffälligkeiten der Probe, um unsere Aufmerksamkeit gezogen verhindert eine gut verteilte, unvoreingenommene Auswahl. Sampling Bias kann nur vermieden werden, wenn jeder Teil der Region von Interesse die gleiche Chance, in ein Elektron Mikrograph1enden wird. Es ist möglich, Probenahme Verzerrungen ohne eine Software-Lösung, z. B. zu vermeiden, indem man den Trackball des Mikroskops manuell ohne Blick auf das Bild, um die Sample-Bereiche auswählen, wo die Etappe beendet. Aber dies ist streng genommen keine zufällige Verfahren, da bewusst oder unbewusst, der Benutzer kann einen Einfluss auf die Bewegung der Bühne haben, und darüber hinaus dies keine anspruchsvolle Art ist der Auswahl von Sample-Bereiche. Stichproben wird besonders wichtig, wenn Paare von Abschnitten verwendet werden, um die Anzahl der Strukturen in einem bestimmten Volumen, z. B. für Stereologie1, bewerten die Paare von Abschnitten, einem bekannten Abstand erfordert. Es wäre auch möglich, nur einen einzigen Abschnitt betrachten und schätzen die Zahl der spezifischen Strukturen2, aber mit diesem Ansatz Ermittler tendenziell überschätzen die numerische Dichte der größeren Strukturen, es sei denn, die Strukturen sehr klein sind im Vergleich zu der Schnittdicke. Alternative Ansätze sind Mengen von Gewebe aus Schnittserien zu rekonstruieren und somit erhalten die gewünschten Daten3. Aber das ist sehr zeitaufwändig und keinen Machbaren Ansatz für (größere) vergleichende Studien.
Um diese Probleme zu überwinden, haben wir einen Workflow entwickelt, mit dem die Forscher Proben für den Erhalt der Elektron Mikrographen in regelmäßigen Abständen innerhalb von ultra-dünnen Abschnitten automatisch auswählen können. Die Position des Elektrons Mikrographen ist zufällig, so dass unvoreingenommene Probenahme. Das Konzept eignet sich sowohl zur Bestimmung der numerischen dichten Strukturen (z. B. Synapsen innerhalb einer bestimmten Neuropil Band4,5) und die Abmessungen der strukturellen Merkmale (z. B. die Breite der synaptischen Spalt oder den Durchmesser der postsynaptischen Dichte4,5).
Der Workflow verwendet eine maßgeschneiderte Zufallspunkt Probenahme (RPS) Software (geschrieben in Java-Script mit Scripting-Software im Lieferumfang unser Mikroskop), die Startplätze innerhalb eines vordefinierten Bereichs von Interesse in einem ultra-dünnen Abschnitt automatisch berechnet. Die RPS-Software verschiebt die Bühne des Elektronenmikroskops an diese vordefinierten Punkten, sodass ein Elektron Schliffbild an jeder Stelle erfolgen kann. Zunächst definiert der Benutzer eine Region of Interest innerhalb der Dünnschliff. Als nächstes berechnet die RPS-Software Startplätze innerhalb dieser Region. Die X / y-Koordinaten der ersten Position werden nach dem Zufallsprinzip erstellt, und die restlichen Positionen werden in regelmäßigen Raster Abständen in Bezug auf die erste Position platziert. Da jeder Teil der Region von Interesse die gleiche Chance geprüft wird hat, können minimale Datenerhebung. Dieser Ansatz der Probenahme nennt man auch systematische einheitliche Stichproben (siehe Referenzen6,7 für weitere Details).
Für die Ermittlung der numerischen dichten Strukturen, arbeiten wir mit Paaren aus Abschnitten, die einem bekannten Abstand voneinander entfernt sind. Bewegt sich nach Erhalt eines Elektrons Schliffbild aus dem ersten Abschnitt in eine der vorgegebenen Positionen, TEM serielle Abschnitt Software (Teil des Softwarepakets unser Elektronenmikroskop im Lieferumfang) auf den entsprechenden Punkt im zweiten Abschnitt, um erhalten Sie ein Elektron Schliffbild des entsprechenden Standortes. Dies wird für jeden Standort im vorgegebenen Raster wiederholt. In unserem Ansatz wird ein Disector verwendet, um die Anzahl der Partikel in jedem Paar von Elektronen Mikrographen8,9. Ein Disector besteht aus einem Paar von zählen der Frames, eine für jeden Abschnitt8,9. Die numerische Dichte Objekte richtet sich nach nur zählen von Objekten sichtbar auf dem ersten Abschnitt (oder Referenz) aber nicht auf den zweiten Abschnitt (oder Lookup). Dies ermöglicht, um die numerischen dichten von Objekten in einer schnellen und effizienten Weg8,9zu schätzen. Zusätzlich können einzelne Abschnitte, zweidimensionalen strukturellen Merkmale gemessen werden.
Wir haben diesen Workflow erfolgreich um Unterschiede in der Synapse Zahlen im Hippocampus von Mäusen angereicherten Umgebung (EE) Wohnverhältnisse verglichen mit Standardumgebung (SE) Gehäuse Bedingungen4,5ausgesetzt bewerten angewendet, und auch die Ultrastrukturforschung Unterschiede zwischen Wildtyp (WT) Mäuse und Neuropeptid Y (NPY) KO-Mäusen unter SE und EE5gehalten zu bewerten. Unser Ziel war es, speziell Strukturmerkmale von Neuronen, wie die numerische synaptische Dichte, die Längen von der aktiven Zone in Querschnitten und der postsynaptischen Dichte, die Breite der synaptischen Spalt und die Anzahl der synaptischen Vesikel betrachten, um Änderungen in neuronale Konnektivität und Aktivierung zwischen den verschiedenen experimentellen Bedingungen zu beurteilen. Darüber hinaus waren wir interessiert die numerische Dichte von dichten Kern Vesikeln (DCV) in den Neuronen, die Menge des gespeicherten Neuropeptide in einem bestimmten Bereich des Gehirns bestimmen.
Basierend auf dem Erfolg unseres Ansatzes für die Studien beschriebenen, in unseren nächsten Schritt haben wir unseren Workflow markieren Sie Bereiche für unvoreingenommene elementare Analysen im menschlichen Gehirn Proben angepasst. Dies geschah zu Bild Eisen in Ferritin-Moleküle in Neuronen und Gliazellen gespeichert. Hierzu haben wir eine Skript, das uns erlaubt, die meisten Operationen für eine zufällige Screening-Prozess des Gehirns Abschnitte in einem definierten Bereich zu automatisieren.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital</td><td>SigmaAldrich</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Merck</td><td>1040051000</td><td>1kg</td></tr><tr><td>Glutardialdehyd</td><td>Science Services</td><td>E 16210</td><td>25%; 100ml; </td></tr><tr><td>Cacodylatpuffer</td> in EM-Qualität <td>Merck</td><td>C4945</td><td>250 g; Dimethylarsinsäure Natriumtrihydrat</td></tr><tr><td>Thioninacetat/Ceristain</td><td>Merck</td><td>861340</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Merck</td><td>1000631000</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Natronlauge</td><td>Merck</td><td>1064951000</td><td>1 kg, Pellets</td></tr><tr><td>Osmiumtetraoxid</td><td>Science Services</td><td>E 19110</td><td>10x1g</td></tr><tr><td>TAAB Einbettharz</td><td>Science Services</td><td>TAT001</td><td>500g</td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>Science Services</td><td>TAD024</td><td>100g</td></tr><tr><td>DDSA</td><td>Science Services</td><td>TAD025</td><td>500g</td></tr><tr><td>Uranylacetat-Dihydrat</td><td>Plano GmbH</td><td>19481</td><td>abgereichert, 25g</td></tr><tr><td>Ultrastain 2</td><td>Leica</td><td>16707235</td><td>Bleicitrat</td></tr><tr><td>Toluidinblau Lösung</td><td>Agar</td><td>Scientific AGR1727</td><td>10g</td></tr><tr><td>Pioloform</td><td>Plano GmbH</td><td>R1275</td><td>10g Pulver</td></tr><tr><td>Proylenoxid</td><td>SigmaAldrich</td><td>82320-1L</td><td>1L DPX</td></tr><tr><td>Einbettmedium</td><td>Plano GmbH</td><td>R1320</td><td>Einbettmedium für halbdünne Schnitte auf Objektträger, 50 ml</td></tr><tr><td>Vibratom, Leica VT 1000</td><td>Leica Microsystems, Wien, Österreich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Ultracut UCT, ultramicrotom</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai G2 20</td><td>FEI, Eindhoven, Niederlande</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Megaview Weitwinkelkamera</td><td>Olympus Soft Imaging Solution, M&uuml; nster, Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>US 1000 Digitalkamera</td><td>Gatan, Pleasanton, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM Imaging Analysis Software</td><td>FEI,Eindhoven, Niederlande</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FEI Serial Section Software</td><td>FEI,Eindhoven, Niederlande</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fidschi, ImageJ 1.52e</td><td>National Institute of Health, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPSS 20.0</td><td>SPSS Inc., Chicago, IL, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SerialEM</td><td>Regents der University of Colorado</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPS (Random Point Sampling) Software 0.9a</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disector v1.0.2 (ImageJ Makro)</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EFTEMSerialEM (SerialEM Skript)</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

eine unvoreingenommene ansatz der probenahme tem abschnitte in den neurowissenschaften

An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience

Untersuchungen der Ultrastrukturforschung Funktionen von Neuronen und ihre Synapsen sind nur möglich mit Elektronenmikroskopie. Vor allem für vergleichende Studien über die Änderungen in den dichten und Distributionen solcher Merkmale unbedingt eine unvoreingenommene Probenahme-Protokoll für zuverlässige Ergebnisse. Hier präsentieren wir Ihnen einen Workflow für die Bildaufnahme Gehirn Proben. Der Workflow ermöglicht einheitliche systematische Stichproben innerhalb einer definierten Gehirnregion, und die Bilder können mit einem Disector analysiert werden. Diese Technik ist wesentlich schneller als umfangreiche Prüfung der Schnittserien aber noch einen Machbaren Ansatz zur Abschätzung der dichten und Verteilungen der Ultrastruktur Features präsentiert. Vor dem Einbetten, wurden gefärbten Vibratome Abschnitte als Referenz verwendet, um die Region des Gehirns untersucht, welche geholfen beschleunigen den gesamten Probenvorbereitung verarbeiten zu identifizieren. Dieser Ansatz war für vergleichende Studien untersuchen die Wirkung der Naturbedingungen bereichert-Gehäuse auf mehrere Ultrastrukturforschung Parameter in das Gehirn der Maus verwendet. Basierend auf den erfolgreichen Einsatz des Workflows, wir es zum Zwecke der Elementaranalyse Gehirn Proben angepasst. Wir optimieren das Protokoll in Bezug auf die Zeit der Benutzer-Interaktion. Automatisieren die zeitaufwändigen Schritte durch die Erstellung eines Skripts für die open-Source-Software SerialEM hilft dem Anwender, konzentrieren sich auf das Hauptwerk der elementaren Karten zu erwerben. Wie in der ursprünglichen Workflow wir geachtet, die unvoreingenommene Stichprobenansatz um zuverlässige Ergebnisse zu garantieren.

Hier beschreiben wir einen Workflow, um einen Bereich für TEM auf automatische und unvoreingenommene Weise zu wählen. Der Benutzer wählt den gewünschten Bereich in ein ultra-dünnen Abschnitt unter der TEM und nutzt mehrere Software-Lösungen für den Workflow einschließlich unserer RPS -Software, die berechnet automatisch die Koordinaten der 20 Probenahme Bereiche innerhalb des Bereichs von Interesse. Dann bewegt sich die TEM-Bühne jedes Stichprobenraum für Fotografie. Dies ist möglich, für einzelne Abschnitte zu analysieren und für die Analyse von Paaren von Abschnitten, einem bekannten Abstand zueinander, wodurch Auswahl von Flächen für die Bildgebung ohne Voreingenommenheit des Prüfers.
Dieser Workflow als wertvoll erwiesen, wenn Ultrastrukturforschung Funktionen in Maus Gehirn Abschnitte4,5dokumentiert. In diesen Studien wurde der polymorphen Zellschicht von dentate Gyrus (DGpl) als ein Gebiet von Interesse geprüft. Unsere Methode erwies sich als geeignet für die Prüfung der DG, da ein koronaler Abschnitt der dorsalen GD (Bregma −1.3) in einen ultra-dünnen Abschnitt passt und seine Umrisse sind ohne weiteres bei kleiner Vergrößerung erkannt. Würden andere Hirnregionen untersucht werden, wäre es wichtig, ihre Größe und besondere Kennzeichen vor der Planung der Experimente zu überprüfen.
Anwendung des hier beschriebenen Workflows zeigte, dass EE Gehäuse die Breite der synaptischen Spalt in der DGpl4, in Bezug auf standard-Gehäuse Bedingungen deutlich erhöht. Darüber hinaus wurde die Anzahl der Rumpfkern Vesikel in der EE-beherbergt Tiere4, unter Angabe der Änderungen im Haushalt von Neuropeptiden deutlich verringert. Beim WT und NPY-Knockout-Mäusen unter EE Bedingungen gehalten wurden, stieg die Zahl der Neuronen/µm³ in der DGpl sank die Dichte des DCV in Bezug auf SE-Gehäuse5. Im Gegensatz dazu führte NPY Ko zu einem deutlichen Anstieg der synaptischen Vesikel in den Reserve-Pool (nicht angedockte synaptischen Vesikel) unabhängig von Bedingungen5Gehäuse. Die Wirkung von EE auf die Breite der synaptischen Spalt wurde in der NPY KO-Gruppe, die wiederum eines signifikanten Unterschied zwischen EE untergebracht WT und NPY KO Mäusen5aufgehoben. Zusammen mit Verhaltensstudien des WT und NPY Ko Tiere gehalten unter beide Arten von Mobilfunk-Sendemasten, dies bedeutet eine entscheidende Rolle von NPY für die neurobiologischen Auswirkungen von EE5.
Zur Visualisierung der Eisen im menschlichen Gehirn gespeichert, wurde ein Skript kompiliert für SerialEM Software, zufällig zu wählen, dass die Punkte des Erwerbs von innerhalb eines ganzen ultradünnen, mit dem Ziel der Erlangung einer Energiepreis Elektron Schliffbild an jedem dieser Punkte gefiltert . Nach dem Laden der Abschnitt in dem Elektronen-Mikroskop, das Script ausgeführt die Stabilisierung des Abschnitts (zB., die "Probe-kochen" Routine) über Nacht. Das Skript dann nach dem Zufallsprinzip ausgewählt, eine Reihe von Punkten, die vom Benutzer über die markierten mit einem Gitter in Abbildung 3vordefiniert. Durch die Herstellung einer Test-Schliffbild und Überprüfung der Graustufen, überprüft das Skript befänden die gewählten Punkte auf einen sichtbaren Teil des Abschnitts, Ablehnung der Punkte, die auf Raster Bars gelandet. Die meisten der Workflow wurde durch das Skript mit minimaler Interaktion des Benutzers behandelt. Jedoch war es nicht möglich Energie gefiltert Mikrographen (mit diesem Setup), automatisch zu erfassen, da gab es zu wenig Licht für den Autofokus-Routine des SerialEM. Daher haben wir auf DM Software umgestellt, sobald das Skript hatte zog die Bühne an jedem Punkt im Mittelpunkt von hand angepasst und ein LUTETIUM-Bild aus Eisen gemacht. Ein Beispiel für ein LUTETIUM Eisen Bild von Post-Mortem Gehirn ist in Abbildung 4dargestellt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig1.jpg"> Abbildung 1. Abbildung des Workflows. (A) die wichtigsten Schritte von der Probenvorbereitung werden angezeigt (in Richtung des Pfeils): Vibratome Abschnitte (i), embedding(ii), semi-dünn und ultra-dünne Abschnitte (Iii) schneiden und fangen Paare von ultra-dünnen Abschnitten auf Kupfer Gittern (iv). (B) Nutzung der Software und maßgeschneiderte RPS-Software des Lieferanten Mikroskop Probenahme Bereich Koordinaten erstellen, die die Aufnahme Standorte zu bestimmen. Die Eckpunkte der Abschnitte sind in der Mikroskopie-Software hinterlegt und der ROI ist skizziert (identifiziert mit Hilfe der semi-dünne Abschnitte) (i); ein Raster von Bereichen Probenahme über den ROI erzeugt wird, eine zufällige Verschiebung (roter Pfeil) wird eingeführt in x und y. Die Verschiebung ist kleiner als der Abstand zwischen den Bereichen Probenahme, (schwarze Pfeile), so dass anstelle der schwarzen Quadrate, die keine Verschiebung, die blauen Quadrate, die nach dem Zufallsprinzip verschoben sind, verwendet werden, um die Aufnahme Standorte (Ii); nur Stichproben Bereiche innerhalb der Grenzen des ROI (als schwarze und blaue Quadrate gezeichnet) sind für die Aufnahme verwendet. Mikrographen erfolgt im Abschnitt "Reference" (schwarze Quadrate) und an entsprechenden Stellen im Abschnitt Lookup (blaue Quadrate) (Iii). (C) ein Schliffbild erfolgt an jedem Stichprobenraum bei ausreichender Vergrößerung; eine Montage bestehend aus mehreren zusammengeführten Bilder erfolgt bei Bedarf (in diesem Fall 2 x 2 Bilder wurden zusammengeführt) (i); Counting Rahmen erzeugt und als Overlay in der Abbildung gezeigt, Strukturen im Rahmen und auf die "Akzeptanz-Linien" (gestrichelte Rahmenlinien) gezählt werden, nicht jedoch auf die "verbotenen Linien" (aus massivem Linien) (Ii). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig2.jpg"> Abbildung 2 . Ultrastrukturforschung Messparameter auf einem Paar von ultra-dünnen Abschnitten mit einem unvoreingenommenen Counting Rahmen. (A) Überblick über die ImageJ-Fenster für zählen und Analyse zelluläre Strukturen verwendet. Linke Seite zeigt das Elektron Schliffbild mit dem zählen Rahmen als Overlay. Auf der rechten Seite: ImageJ-Benutzeroberfläche (blaues Rechteck) mit Drop-Down-Menü (oben) und die Symbolleiste (siehe unten); das ObjectJ-Objekt-Editor (grünes Rechteck); die ObjectJ Tools -Fenster (orange Rechteck) wo die Instrumente zur Messung der ausgewählt werden kann und wo die Messungen dokumentiert sind ObjectJ Ergebnisfenster (schwarzes Rechteck). (B) Detail eine deutliche Synapsen angezeigt, auf das Elektron Schliffbild (Synapsen auf beiden Abschnitten - Pfeile; Synapse nur auf die Lookup-Abschnitt-Pfeilspitzen). Diejenigen sind gekennzeichnet mit dem Multipoint-Tool (roter Kreis) aus der Symbolleiste in ImageJ. (C) die Namen und Messparameter der synaptischen Funktionen werden über die ObjectJ Toolsdefiniert. Das Marker-Tool und die Funktion von Interesse sind ausgewählt und die Umrisse gezeichnet im Bild von links-Maus-Klicks entlang der Struktur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig3.jpg"> Abbildung 3. Sampling-Bereiche für elementare Zuordnung innerhalb einer ROI für Energie gefiltert Transmissions-Elektronenmikroskopie auswählen. SerialEM wird verwendet, um eine Zielregion auswählen und eine hohe Anzahl von Stichproben Bereiche im regelmäßigen Abstand (rosa Kreuze in den Bildern A und B) vorzuschlagen. Ein Skript wählt dann nach dem Zufallsprinzip Sampling Bereiche (von diesen vorgegebenen Koordinaten) für den Erwerb. Probenahme-Gebieten mit schlechter Beleuchtung werden zur Vermeidung von Raster-Bars und das Skript beendet, sobald 20 gut beleuchteten Probenahme Bereiche innerhalb der ROI ausgewählt wurden abgelehnt. (A) Überblick über den gesamten Bereich der Interesse, dargestellt durch ein Polygon mit einer hohen Anzahl von möglich Probenahme Bereiche mit x. (B) Detail von A zeigt die Probenahme Bereiche vor zufälligen Auswahl markiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58745/58745fig4.jpg"> Abbildung 4. Beispiel für elementare Karte (LUTETIUM) Erwerb. (A) Hellfeld-TEM Mikrograph der Gegend um Erwerb Punkt. Ein nach dem Zufallsprinzip ausgewählter Bereich wurde verwendet, um eine elementare Karte zu bekommen und wird von einem schwarzen Rechteck markiert. (B) LUTETIUM Pre-edge Fenster Bild gemacht in den zufällig ausgewählten Bereich. (C) LUTETIUM Post-edge Fenster Bild in der gleichen Gegend gemacht. (D) elementare Karte von Eisen des gleichen Gebietes (M-Kante). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58745/58745fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Wir stellen einen neuartige Workflow für Elektronenmikroskopie Untersuchungen von Hirngewebe. Die Methode ermöglicht dem Benutzer, neuronale Funktionen auf unvoreingenommene Weise zu prüfen. Für die Elementaranalyse präsentieren wir auch eine Skript, die meisten des Workflows für randomisierte Stichprobe automatizes.

Eine unvoreingenommene Ansatz der Probenahme TEM Abschnitte in den Neurowissenschaften

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative ...

Ein unvoreingenommenes Probenahmeprotokoll ist für die Elektronenmikroskopie von entscheidender Bedeutung. Wenn Sie es auf numerische Dichte von Synapsen oder anderen Strukturen in einem bestimmten Gehirnbereich quantifizieren möchten, ist der Hauptvorteil unserer Technik, dass sie unvoreingenommen ist und es ermöglicht, automatisch Elektronenmikroskopie mit minimalem Benutzereingriff zu erzeugen. Diese Technik ist auch in anderen Forschungsbereichen, wie der Neurowissenschaften, wertvoll, wo sie bei der Beurteilung der Stärke eines neuronalen Netzwerks eingesetzt werden kann.Um unser Protokoll anzuwenden, ist es notwendig, Erfahrung in elektronenmikroskopischen Techniken zu haben, wie z. B. Probenvorbereitung und Betrieb eines Übergangselektronenmikroskops. Demonstriert unser Verfahren zeigt Dr.Stefan Wernitznig, ein Post-Doc aus meinem Labor. Dieses Protokoll besteht aus der Vorbereitung von Gehirnproben für die Elektronenmikroskopie, schneiden Paare von dünnen Abschnitten.Als Nächstes wird beschrieben, wie automatisch eine definierte Anzahl von Elektronenmikroskopen in einem Interessengebiet erzeugt wird. Anschließend wird ein Zählrahmen verwendet, um die numerische Dichte von Strukturmerkmalen zu bewerten. Um zu beginnen, sezieren, fixieren, korrigieren und betten Sie Proben von Interesse in das Einbetten von Harz ein, indem Sie zusammen mit dem begleitenden Textprotokoll folgen.Legen Sie die Probe dann auf ein Ultramikrotom und produzieren Sie 55 Nanometer ultradünne serielle Abschnitte. Platzieren Sie die Abschnitte auf einem Schlitzgitter mit den Abmessungen von einem Millimeter mal zwei Millimetern, beschichtet mit Piola-Form. Dann die ultradünnen Abschnitte auf den Schlitzgittern mit 2%uranylacetat für 30 Minuten gegenstainieren, gefolgt von Bleicitrat für 30 Sekunden bei Raumtemperatur.Legen Sie das Raster in das TEM und untersuchen Sie die Abschnitte auf dem Raster mit dem TEM mit einer geringen Vergrößerung, um die Qualität der Abschnitte zu orientieren und zu bewerten. Starten Sie dann die TEM Serial Section-Software, wählen Sie Abschnitt aus, und wählen Sie Einfügen aus, um die Eckpunkte für den Referenz- und Nachschlageabschnitt hinzuzufügen. Folgen Sie den Anweisungen des Popup-Fensters.Beginnen Sie mit dem Referenzabschnitt, und fahren Sie dann mit dem Nachschlageabschnitt fort. Stellen Sie sicher, dass die Kanten des Abschnitts parallel zum nächsten Abschnitt sind, da die Punkte eins und zwei eingegeben werden. Als Nächstes visualisieren Sie den Referenzabschnitt unter geringer Vergrößerung, um den Interessenbereich zu identifizieren.Verschieben Sie die Mikroskopstufe mithilfe der TEM-Bildanalyse im Referenzabschnitt auf mehrere Eckpunkte des ROI, um einen Umriss des ROI zu erstellen. Zeichnen Sie die Koordinaten des resultierenden Polygons mit der Random Point Sampling-Software auf. Drücken Sie dazu im Dialogfeld der Random Point Sampling-Software an jedem Punkt des Polygons, der zum Umreißen des ROI im Abschnitt erforderlich ist, Koordinaten hinzufügen.Als Nächstes definieren und geben Sie eine geeignete Größe für die Stichprobenbereiche und Abstände zwischen den Bereichen in die Random Point Sampling-Software ein. Drücken Sie dann Raster berechnen, um Koordinaten systematisch, einheitlich und zufällig für die Positionen des Mikrographen innerhalb des Polygons zu generieren. Speichern Sie die Samplingpunkte in den Referenz- und Suchabschnitten mithilfe der Random Point Sampling-Software und der TEM Serial Section-Software.Dies sind die Koordinaten der Montagen, die danach aufgezeichnet werden. Drücken Sie in der Random Point Sampling-Software zur nächsten Position, um die Mikroskopstufe auf die x-, y-Koordinaten jedes Samplingbereichs im Referenzabschnitt zu verschieben. Wählen Sie dann Location aus, und wählen Sie Einfügen aus, um diese Koordinaten in der TEM Serial Section-Software im Referenzabschnitt zu importieren.Wiederholen Sie dies für alle Koordinaten. Um die Koordinaten aus dem Referenzabschnitt in den Suchabschnitt zu spiegeln, wählen Sie Abschnitt aus, und wählen Sie Zum Abschnitt gehen aus. Geben Sie die Nummer des Nachsuchabschnitts im Dialogfeld ein.Wechseln Sie für die Aufzeichnung der Montagen zwischen dem Referenz- und dem Nachschlageabschnitt, wie zuvor beschrieben, und ändern Sie die Position im Referenzabschnitt mit der Position, und gehen Sie zur Nummer. Wählen Sie die nächste Koordinate im Dialogfenster aus. Wechseln Sie für die SerialEM-Montagen zu jeder Sampling-Koordinate zu Datei und wählen Sie im Dropdown-Menü Neue Montage aus.Wählen Sie im Dialogfenster die richtige Anzahl von Kacheln und den Prozentsatz der Überlappung aus. Für die vorliegende Studie reicht eine Vergrößerung von 5000 aus, um die synaptischen Merkmale der Studie zu erkennen. Aber das begrenzte Sichtfeld der CCD-Kamera erforderte die Herstellung von Montagen von zwei mal zwei Bildern.Die Montagen werden an SerialEM hergestellt. Bevor Sie jede Montage aufzeichnen, richten Sie den Fokus neu oder aktivieren Sie die Autofokus-Option in der Aufnahmesoftware. Wählen Sie den Ordner aus, um die Montagedatei zu speichern, und starten Sie die Aufzeichnung der Montage, indem Sie im Untermenü "Montage" links in SerialEM auf Start drücken.Starten Sie den Mikrodissektor, und definieren Sie die Größe des Zählrahmens und die Anzahl der Segmente nach Bedarf. Zählen Sie die Synapsendichte mithilfe des Dissektormakros. Beschränken Sie mit dem Multi-Point-Tool in der Symbolleiste die Synapsen, die sich mit den beiden verbotenen Linien des Dissektors schneiden, aber zählen Synapsen auf den entgegengesetzten Annahmelinien.Markieren Sie jede Synapse innerhalb des Zählrahmens, die im Referenzabschnitt sichtbar, im Suchabschnitt jedoch nicht sichtbar ist, mit einer ovalen Auswahl. Um Synapseparameter zu messen, wählen Sie nur die Synapsen mit einem synaptischen Spalten aus, der im Querschnitt orientiert ist, der sich auf dem Referenzabschnitt befindet. Dies sollte sich innerhalb der gleichen Bildrahmen befinden, die für den Dissektor verwendet werden.Gehen Sie als Nächstes zu Plugins und dann zu Analysieren und starten Sie das Plugin ObjectJ aus dem Dropdown-Menü. Öffnen Sie ein neues Projekt aus dem Dropdown-Dialogfeld ObjectJ, das ein Fenster öffnet, in dem der Benutzer Strukturen mit dem Markerwerkzeug umreißen und markieren kann. Verwenden Sie zunächst das Markerwerkzeug, um die Länge der präsynaptischen Membran und die postsynaptische Dichtelänge zu messen, indem Sie eine Linie entlang der Struktur zeichnen.Erhalten Sie dann die mittlere Breite des synaptischen Spalten, indem Sie ein Polygon zeichnen, das sowohl die prä- als auch die postsynaptische Membran abdeckt. Um die Anzahl der angedockten Vesikel zu bestimmen, zählen Sie alle Vesikel, die einen maximalen Abstand von der präsynaptischen Membran eines Vesikeldurchmessers oder weniger haben. Bestimmen Sie dann die Anzahl der abgedockten Vesikel, indem Sie die Vesikel mit einem maximalen Abstand von einem Vesikeldurchmesser von angedockten oder anderen ungedockten Vesikeln an derselben Synapse zählen.Eine angepasste Version des Protokolls ermöglicht elementare Analysen an unvoreingenommen erhaltenen Stellen innerhalb des ultradünnen Abschnitts. Starten Sie dazu im TEM-Bildgebungsmodus SerialEM und eröffnen Sie ein neues Projekt. Öffnen Sie dann den Navigator, und überprüfen Sie die Einstellungen für die Kamera in Kamera- und Skriptsteuerelementen für die Ansicht und Aufzeichnung und Startansicht.Um eine Eckkarte des ultradünnen Abschnitts zu erstellen, wählen Sie Punkte hinzufügen im Navigator-Fenster aus. Legen Sie dann die Eckpunkte an den Rändern eines ultradünnen Abschnitts fest. Bewegen Sie die Bühne zu einem Eckpunkt, indem Sie die rechte Maustaste gedrückt halten.Wenn eine Ecke des Abschnitts erreicht ist, fügen Sie einen Eckpunkt mit einem linken Mausklick hinzu. Wiederholen Sie den Vorgang, um drei weitere Eckpunkte hinzuzufügen. Stellen Sie sicher, dass im Navigator-Fenster das Feld C für Eckpunkte für die gespeicherten Punkte angekreuzt ist.Um die Eckmontage zu starten, gehen Sie in der SerialEM-Menüleiste zu Navigator und wählen Sie im Dropdown-Menü Montaging Grids und Setup Corner Montage aus. Wählen Sie Polygon hinzufügen im Navigator-Fenster und skizzieren Sie den Interessenbereich mit mehreren Rechten Mausklicks. Wählen Sie als Nächstes im Dropdown-Menü Navigator die Option Punkteraster hinzufügen aus, und definieren Sie einen Abstand zwischen den Punkten.Starten Sie das EFTEMSerialEM-Skript, folgen Sie den Skriptbefehlen, geben Sie die Anzahl der Rasterpunkte ein, wie im Navigator gezeigt, und geben Sie die Anzahl der Erfassungspunkte ein. Legen Sie dann den Beleuchtungsschwellenwert fest, damit das Skript Rasterleisten vermeiden kann. Folgen Sie den Skriptbefehlen, und verschieben Sie die Bühne manuell, um das Sichtfeld um ein Viertel der Rasterleiste abzudecken.Geben Sie gemäß dem angezeigten Wert einen Schwellenwert für die Beleuchtung ein, der höher als der angezeigte Wert ist. Warten Sie, bis die Punkte für die Erfassung ausgewählt sind und die Kochroutine abgeschlossen ist. Dies dauert lange und kann über Nacht durchgeführt werden.Nachdem Sie eine elementare Karte mit elementspezifischen Einstellungen eingerichtet haben, erwerben Sie eine elementare Karte. Der unvoreingenommene Sampling-Ansatz ist nützlich für das Zählen und Analysieren synaptischer Merkmale in bestimmten Hirnregionen. Darüber hinaus ermöglicht das EFTEMSerialEM-Skript für die SerialEM-Software die zufällige Auswahl der Erfassungspunkte innerhalb eines ganzen ultradünnen Abschnitts mit dem Ziel, an jedem dieser Punkte einen energiegefilterten Elektronenmikroskop zu erhalten.Das Skript wählte nach dem Zufallsprinzip eine Anzahl von Punkten aus, die vom Benutzer aus den mit einer Benotung markierten Punkten vordefiniert wurden. Durch die Erstellung eines Testmikroskops und die Überprüfung seiner Notenebenen überprüfte das Skript, ob sich die ausgewählten Punkte auf einem sichtbaren Teil des Abschnitts befanden, und lehnte die Punkte ab, die auf Gitterstäben landeten. Der großteil der Workflows wurde vom Skript mit minimaler Interaktion des Benutzers verarbeitet.Mit dem hier gezeigten Beispiel gab es jedoch zu wenig Licht für die Autofokus-Routine von SerialEM. Sobald das Skript die Bühne auf jeden Punkt verschoben hat, wurde der Fokus angepasst und eine Elementarkarte aus Eisen erstellt. Es ist wichtig, die Interessenregion sorgfältig auszuwählen und sicherzustellen, dass die gleiche Anzahl von Probenahmestellen in jeden Interessenbereich fällt.Vergessen Sie nicht, dass viele der Chemikalien, die für die Probenvorbereitung verwendet werden, giftig sind. Tragen Sie also einen Labormantel und Schutzhandschuhe und arbeiten Sie unter einer Rauchschutzhülle.

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