Identifizierung von Maus und humanen Antikörpers Repertoires durch Sequenzierung der nächsten Generation

In diesem Video beschreiben wir eine einfache und effiziente Methode zur Visualisierung und Analyse eines Antikörperrepertoires auf globaler Ebene. Es ist möglich, ganze B-Zell-Repertoires bei Individuen und ihre dynamischen Veränderungen als Reaktion auf Immunstimulation zu beschreiben. Diese Methode kann angewendet werden, um pathologische Proben von Patienten neu auftretender Virusinfektionen zu analysieren und die Daten mit beispiellosen Einblicken in die Pathogenese der Infektion zu erhalten.

Einer der spannendsten Bereiche für die Anwendung ist eine Impfstoffkontrolle. Die Wirksamkeit von Impfstoffen kann durch die Analyse der Dynamik des globalen Antikörperrepertoires bei durch Impfungen verabreichten Personen bewertet werden. Die Einzelnen sind neu in dieser Methode müssen möglicherweise die PCR-Bedingungen zu optimieren, weil die Effizienz der Antikörper-Gen-Verstärkung hängt von den Arten von Ausgangsmaterialien.

Fla-cher zur Identifizierung von Immunglobulin-Amplika. Es ist wichtig, diese Aktionen visuell zu demonstrieren. Demonstrieren das Verfahren werden Miss Sayuri Yamaguchi und Mr.Hanbing Xue, ein Techniker und Doktorand aus meinem Labor.

Um dieses Verfahren zu beginnen, sezieren Sie das Gewebe von einer acht Wochen alten C57 schwarze Sechsmaus und passieren Sie es durch ein Edelstahlgewebe mit zwei Milliliter PBS, um dispergierte Zellen zu erhalten. Die Zellsuspension in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr und eine Zentrifuge bei 600 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten übertragen. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie dem Pellet 800 Mikroliter ACK-Lysing-Puffer hinzu.

Auf Eis für zwei Minuten bebrüten, um die roten Blutkörperchen im Gewebe zu lysieren. Als nächstes waschen Sie die Gewebezellen dreimal mit drei Milliliter PBS für jede Wäsche. Zentrifugieren Sie wieder bei 600 mal g und vier Grad Celsius für fünf Minuten.

Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 800 Mikroliter Phenol/Guanidinisothiocyanat-Reagenz gründlich in das Pellet und Wirbel. Bei 25 Grad Celsius fünf Minuten lang inkubieren. Dann 200 Mikroliter Chloroform hinzufügen und 15 Sekunden lang manuell schütteln.

Bei 25 Grad Celsius für zwei Minuten inkubieren. Zentrifuge bei 12.000 mal g und bei 25 Grad Celsius, um die Phasen zu trennen. Die obere wässrige Phase auf ein frisches Rohr übertragen.

Fügen Sie ein Volumen von 70% Ethanol hinzu. Wirbel kurz und wenden Sie diese Mischung auf die Kieselsäure-Spin-Säule. Elute die RNA mit 30 bis 100 Mikroliter Wasser.

Danach verwenden Sie ein Fluorometer, um die anfängliche RNA-Konzentration zu quantifizieren. Bewahren Sie die gereinigte RNA bei minus 80 Grad Celsius auf. Synthetisieren Sie zunächst die erste Strang-cDNA von zwei bis 10 Mikrogramm der gesamten RNA-Vorlage mit dem 5'RACE CDS Primer und dem SMART-PCR-Oligonukleotid gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Für das Maus-Immunglobulin verstärkt PCR cDNA mit High-Fidelity-DNA-Polymerase, wobei die universelle Vorwärtsgrundierung und die immunglobulin-klassenspezifischen Reverseprimer verwendet werden, wie im Textprotokoll beschrieben. Für das menschliche Immunglobulin führen Sie die erste PCR mit dem universellen Vorwärtsprimer und immunglobulin klassenspezifischen Reverse primer mit Tag-Sequenzen durch. Schließen Sie die Indexsequenzen für jedes Beispiel nach zweitem PCR mithilfe von Indexsequenzprimern ein.

Als nächstes elektrophorese eines der PCR-Produkte auf einem 2%Agarose-Gel. Visualisieren Sie die DNA-Bänder auf einem UV-Transilluminator und verbrauchen Sie die Gelscheibe, die das Breitband zwischen 600 und 800 Basenpaaren enthält. Fügen Sie 10 Mikroliter Membran-Bindungslösung pro 10 Milligramm Gelscheibe hinzu.

Mischen und bei 50 bis 65 Grad Celsius inkubieren, bis sich die Gelscheiben vollständig auflösen. Dann übertragen Sie die Gellösung auf die Kieselsäuremembran-Spin-Säule. Waschen Sie die Säule einmal mit Waschpuffer und elute die DNA mit 50 Mikroliter nukleasefreies Wasser.

Mit Hilfe eines Fluorometers die gereinigten Amplicons quantifizieren und die Amplicons aus jeder Immunglobulinklasse in gleichen Mengen für die NGS-Sequenzierung bündeln. Danach verwenden Sie eine mikrokapillarbasierte Elektrophorese mit DNA-Größenchip, um die Größe und Konzentration der Bibliotheken zu bestimmen. Speichern Sie die Bibliotheken bei minus 20 Grad Celsius.

Erstellen Sie zunächst eine Beispieltabelle der Sequenzierungsausführung, wie im Textprotokoll beschrieben. Als nächstes tauen Sie eine Reagenzkassette und die Bibliotheken auf. Machen Sie eine 0,2 normale Lösung von Natriumhydroxid und verdünnen Sie die Bibliotheken, um die gewünschten Molkonzentrationen zu erhalten.

Anschließend die Durchflusszelle ausspülen und trocknen und 600 Mikroliter der verdünnten und denaturierten Bibliothekslösung in den Brunnen der Reagenzienpatrone geben und den Sequenzierungslauf starten. Eine Perspektive eines murinen Antikörperrepertoires als Ganzes kann aus Zellen oder Geweben wie Milz, Knochenmark, Lymphknoten oder Blut gewonnen werden. Repräsentative Ergebnisse der IgM-, IgG1-, IgG2c- und Immunglobulin-Leichtkettenrepertoires aus einer naiven Mausmilen-Spleen werden hier gezeigt.

Im V(D)J-Umlagerung durch 3D V(D)J-Plot stellt die Größe jeder Kugel die relative Anzahl der Lesevorgänge dar. Mit anderen Worten, es stellt die Anzahl der Antikörper-mRNAs in ganzen B-Zellen dar. Das 3D-Netz besteht aus 110 Immunglobulin-Schwerketten-V-Genen, 12 Immunglobulin-Schwerketten-D-Genen und vier Immunglobulin-Schwerketten-J-Genen, die so ausgerichtet sind, dass sie ihre Reihenfolge auf dem Chromosom widerspiegeln.

Die 2D-VJ-Plot zeigt das Profil der VJ-Umlagerung im IGL-Repertoire. Die Länge jedes Balkens stellt die relative Anzahl der Lesevorgänge dar. Die X-Achse repräsentiert 101 Immunglobulin-Lichtketten-V-kappa-Gene und drei Immunglobulin-Lichtketten-V-Lambda-Gene, und die Y-Achse stellt vier Immunglobulin-Lichtketten-J-kappa-Gene und drei Immunglobulin-Lichtketten-J-Lambda-Gene dar.

Eine Perspektive eines menschlichen Antikörperrepertoires als Ganzes kann aus verschiedenen Geweben analysiert werden, einschließlich peripherer mononukleischer Blutzellen oder pathologischen Geweben. Die repräsentativen Ergebnisse von IgM, Gesamt-IgG-, Gesamt-IgA-, IgD-, IgE- und IgL-Repertoires aus normalen peripheren mononukleären Blutzellen werden hier gezeigt. Wie das murine Modell wird das Repertoireprofil der V(D)J-Umlagerung auf einem 3D-V(D)J-Plot dargestellt, in dem die Größe jeder Kugel die relative Anzahl der Lesevorgänge darstellt.

Das 3D-Netz besteht aus 56 Immunglobulin-Schwerketten-V-Genen, 27 Immunglobulin-Schwerketten-D-Genen und sechs Immunglobulin-Schwerketten-J-Genen, die in der Reihenfolge ausgerichtet sind, in der sie auf dem Chromosom erscheinen. Das Profil der VJ-Neuanordnung im IgL-Repertoire wird im 2D-VJ-Plot dargestellt, in dem die Länge jedes Balkens die relative Anzahl der Lesevorgänge darstellt. Die X-Achse repräsentiert 41 Immunglobulin-Lichtketten-V-kappa-Gene und 32 Immunglobulin-Lichtketten-V-Lambda-Gene, und die Y-Achse stellt fünf Immunglobulin-Lichtketten-J-kappa-Gene und fünf Immunglobulin-Lichtketten-J-Lambda-Gene dar.

Im Untersuchungsmaterial dieses Protokolls ist eine kleine Anzahl von sortierten Zellen nach Durchflusszytometrie oder sogar Kryosektionen pathologischer Proben verwendbar. Eine sorgfältige Optimierung der PCR-Bedingungen ist jedoch erforderlich. Da die Ausgabeinformationen dieses Protokolls riesig sind, würde die Bioinformatik-Kompetenz helfen, die Struktur des Antikörpernetzwerks zu finden.

Das würde zu einem tiefen Verständnis des Immunsystems führen.