Name: Nachweis von Endotoxin im Nano-Rezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Erfahren Sie den Nachweis von Endotoxinen in Nanorezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. Diese standardisierte Methode ermöglicht zuverlässige Sicherheitsbewertungen für Nanomedizin-Anwendungen.

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Die Studie wurde unterstützt durch Bundesmittel aus dem National Cancer Institute, National Institutes of Health, vertraglich HHSN261200800001E. Der Inhalt dieser Veröffentlichung spiegelt nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien des Department of Health And Human Services, noch erwähnt von Handelsnamen, kommerzielle Produkte oder Organisationen die Billigung der US-Regierung.

1. Vorbereitung der Nanopartikel-Proben
<ol><li>Die Studie Probe in LAL Grade Wasser vorbereiten.</li>
	<li>Wenn der pH-Wert der Probe außerhalb des Bereichs von 6-8 ist, passen Sie den pH-Wert mit pyrogenfreie-freie Natronlauge oder Salzsäure an.</li>
	<li>Mit LAL Grade Wasser bereiten mehrere Verdünnungen der Studie Probe. Stellen Sie sicher, dass die höchsten Verdünnung maximal gültigen Verdünnung (MVD) nicht überschreitet. Siehe Abschnitt "Diskussion" Einzelheiten zum MVD Schätzung.</li>
</ol>2. Vorbereitung der Reagenzien gemeinsamen zwischen LAL-Formate
<ol><li>Verdünnen Sie konzentrierter Natronlauge Lager mit pyrogenfreie-freie LAL Reagenz Wasser, um eine funktionierende Lösung mit einer Konzentration von 0,1 N. vorbereiten</li>
	<li>Verdünnen Sie konzentrierter Salzsäure Lager mit pyrogenfreie LAL Reagenz Wasser zu und bereiten Sie eine funktionierende Lösung auf eine Endkonzentration von 0,1 N.</li>
	<li>Vorbereitung von Control Standard Endotoxin (CSE)<ol>
<li>Bereiten Sie die CSE gemäß den vom Hersteller mitgelieferten Analysezertifikat. Hinweis: Siehe Abschnitt Diskussion für wichtige Hinweise zu den Angaben in der Bescheinigung. Beziehen sich auf die Tabelle der Materialien für die Details der Katalognummer und Anwendung einer bestimmten CSE-Formulierung in verschiedenen Formaten der LAL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung der LAL-Reagenz<ol>
<li>Bereiten Sie das LAL-Reagenz laut der Bescheinigung der Analyse des Herstellers. Hinweis: Siehe Abschnitt Diskussion für wichtige Details bezüglich LAL Reagenz Vorbereitung. Beziehen sich auf die Tabelle der Materialien für die Details der Katalognummer und Anwendung einer bestimmten LAL Reagenz Formulierung in anderen LAL-Format.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Trübung LAL-Test
<ol><li>Vorbereitung der Kalibrierstandards<ol>
<li>Mit 900 µL LAL Grad Wasser und 100 µL der CSE, bereiten Sie so viele fortgeschrittene Verdünnungen wie notwendig, um die Vorbereitung einer Kalibrierung mit einem Konzentrationsbereich von 0,001 bis 1 EU/mL standard ermöglichen.</li>
		<li>Zuerst beschriften Sie Rohre und fügen Sie 900 μl LAL-Grade Wasser in jedes Rohr. Fügen Sie dann 100 μL 10 EU/mL Solutionn Kalibrierung Standard mit Konzentration von 1EU/mL vorzubereiten.</li>
		<li>Wiederholen Sie die serielle 10-divisibel Verdünnung, wie oben beschrieben, drei unteren Kalibrierstandards vorzubereiten. Vergewissern Sie sich, dass vier Kalibrierstandards von 0,001 bis 1 EU/mL vorbereitet worden sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung der Qualitätskontrollen<ol>
<li>Bereiten Sie eine 0,05 EU/mL Qualitätskontrolle durch die Kombination von 50 µL der Lösung 1 EU/mL CSE mit 950 µL LAL-Grade Wasser. Hinweis: Siehe Abschnitt "Diskussion" für Details zur Vorbereitung der Kontrolle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung der Hemmung/Verbesserung (IEC) Kontrollen<ol>
<li>Bereiten Sie IEC mit Konzentration von 0,05 EU/mL durch die Kombination von 25 µL 1 EU/mL CSE-Lösung und 475 µL Test Nanomaterials in einer bestimmten Verdünnung. Hinweis: Siehe Abschnitt "Diskussion" für weitere Details.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Versuchsdurchführung<ol>
<li>Lassen Sie das Instrument zum Aufwärmen durch Rechtsdrehen auf ungefähr 30 Minuten im Voraus. Aufbau der Detektion Wellenlänge 660 nm als dies eignet sich für die Trübung LAL.</li>
		<li>Durch die Eingabe von Benutzername und Passwort anmelden.</li>
		<li>Öffnen Sie die Software (Table of Materials), indem Sie auf das entsprechende Symbol auf einem Computerbildschirm.</li>
		<li>Wählen Sie auf dem Startbildschirm Software Daten zu sammeln . Geben Sie die Informationen zur Test-ID und Daten in den entsprechenden Raum in der Registerkarte " Allgemein " auf dem home-Bildschirm.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Registerkarte " Hardware " wählen Sie den Gerätetyp aus ein Dropdown-Menü.</li>
		<li>Aufbau der Detektion Wellenlänge 660 nm ist geeignet für die Trübung LAL durch die Wahl die LAL Trübung Methode.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass eine Seriennummer, System-ID und seriellen Port-Informationen auf dem Bildschirm angezeigt werden. Klicken Sie auf "OK". Klicken Sie auf "OK" ein weiteres Mal um zu bestätigen.</li>
		<li>Geben Sie die Proben-ID in der gleichen Reihenfolge, die die Probe getestet wird. Verwenden Sie Standardschaltflächen zur Eingabe der Negativkontrolle, Kurve und Test Standardproben.</li>
		<li>Bereiten Sie doppelte Rohre für jede Probe und fügen Sie 200 µL (Test im Verhältnis 4:1) oder 100 µL (Test-Verhältnis 1:1) negativ-Kontrolle (Wasser), Kalibrierstandards, Qualitätskontrolle, IEC und Test Nanopartikel in Pre beschrifteten Glasröhrchen.</li>
		<li>Erste Küvette, Wirbel, die es kurz und Einfügen in Test in das Instrument Karussell Schlitz fügen Sie 50 µL (Test im Verhältnis 4:1) oder 100 µL (Test-Verhältnis 1:1) LAL Reagenz hinzu. Wenn das Verhältnis 1:1 verwendet wird, ist das Volumen des LAL Reagenz 100 µL.</li>
		<li>Wiederholen Sie den Vorgang für andere Proben oben beschrieben. Prozesses Proben einzeln nacheinander. Hinweis: Siehe Abschnitt "Diskussion" für weitere Details.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) chromogenen LAL
<ol><li>Vorbereitung der Kalibrierstandards<ol>
<li>Mit 900 µL LAL Grad Wasser und 100 µL der CSE, bereiten Sie so viele fortgeschrittene Verdünnungen wie notwendig, um die Vorbereitung einer Kalibrierung standard mit einer Konzentration von 1 EU/mL zu ermöglichen.</li>
		<li>Mit 900 µL LAL-Grade Wasser und 100 µL 1 EU/mL Kalibrierstandards, bereiten Sie einen zweiten Kalibrierung Standard in einer Konzentration von 0,1 EU/mL.</li>
		<li>Wiederholen Sie die serielle 10-divisibel Verdünnung, wie oben beschrieben, zwei unteren Kalibrierstandards vorzubereiten. Vergewissern Sie sich, dass vier Kalibrierstandards von 0,001 bis 1 EU/mL vorbereitet worden sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung der Qualitätskontrollen.<ol>
<li>Bereiten Sie eine 0,05 EU/mL Qualitätskontrolle durch die Kombination von 50 µL der Lösung 1 EU/mL CSE mit 950 µL LAL-Grade Wasser. Hinweis: Siehe Abschnitt "Diskussion" für Details zur Vorbereitung der Kontrolle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung der Hemmung/Verbesserung (IEC) Kontrollen<ol>
<li>Bereiten Sie 0,05 EU/mL durch die Kombination von 25 μL der 1 EU/mL CSE-Lösung mit 475 μL Test Nanomaterials. Hinweis: Siehe Abschnitt "Diskussion" für weitere Details.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Versuchsdurchführung<ol>
<li>Lassen Sie das Instrument zum Aufwärmen durch Rechtsdrehen auf ungefähr 30 Minuten im Voraus. Aufbau der Detektion Wellenlänge auf 405 nm als dies eignet sich für die Trübung LAL.</li>
		<li>Öffnen Sie die Software, indem Sie auf das entsprechende Symbol auf einem Computerbildschirm. Durch die Eingabe von Benutzername und Passwort anmelden.</li>
		<li>Wählen Sie auf dem Startbildschirm Software Daten zu sammeln . Geben Sie Test-ID und Daten-Gruppe in den entsprechenden Raum in der Registerkarte " Allgemein " auf dem home-Bildschirm.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Registerkarte " Hardware " wählen Sie den Gerätetyp aus ein Dropdown-Menü. Wählen Sie das Instrument.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass eine Seriennummer, System-ID und seriellen Port-Informationen auf dem Bildschirm angezeigt werden. Klicken Sie auf "OK". Klicken Sie auf "OK" ein weiteres Mal um zu bestätigen.</li>
		<li>Geben Sie die Proben-ID in der gleichen Reihenfolge, die die Probe getestet wird. Standardschaltflächen zur Negativkontrolle, geben verwenden standard-Kurve und Test-Samples.</li>
		<li>Bereiten Sie doppelte Rohre für jede Probe und fügen Sie 200 µL (Test im Verhältnis 4:1) oder 100 µL (Test-Verhältnis 1:1) negativ-Kontrolle (Wasser), Kalibrierstandards, Qualitätskontrolle, IEC und Test Nanopartikel in Pre beschrifteten Glasröhrchen.</li>
		<li>Erste Küvette, Wirbel, die es kurz und Einfügen in Test in das Instrument Karussell Schlitz fügen Sie 50 µL (Test im Verhältnis 4:1) oder 100 µL (Test-Verhältnis 1:1) LAL Reagenz hinzu. Wenn das Verhältnis 1:1 verwendet wird, ist das Volumen des LAL Reagenz 100 µL.</li>
		<li>Wiederholen Sie den Vorgang für andere Proben oben beschrieben. Prozesses Proben einzeln nacheinander.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(5) Gel-Clot LAL
Hinweis: Dieser Test erkennt das Vorhandensein von Endotoxinen in die Stichprobe anhand der visuellen Beobachtung und Erkennung eines Gerinnsels in das Reaktionsgefäß. Die experimentellen Schritte sind nachfolgend beschrieben. Benutzen Sie ein Bank-Blatt, um die Ergebnisse festzuhalten. Dieses Blatt der Bank ist nicht zwingend, und andere Möglichkeiten der Aufnahme der Untersuchungsergebnisse sind auch akzeptabel. Ein Beispiel für solch ein Blatt der Bank erfolgt in ergänzende Materialien für die Bequemlichkeit eines Lesers. Lambda (l) ist die Empfindlichkeit des Gel-Clot-Assays und 0,03 EU/mL.
<ol><li>Beschriften Sie soviele Reaktionsgefäßen wie notwendig, um die Anzahl der analysierten Proben unterzubringen. Beziehen sich auf die Bank-Blatt für Details über die Anzahl der Wiederholungen, die in Schritt 1, Schritt 2 und Schritt 3 des Assays verwendet.</li>
	<li>Aliquoten 100 μl Wasser, Steuerelemente oder Test Probe pro Röhre.</li>
	<li>Bereiten Sie CSE vor, so dass die Endkonzentration 4λ entspricht.</li>
	<li>Kombinieren Sie 100 μL der Norm genannten mit 100 μl Wasser oder Test Probe die Endkonzentration von CSE 2λ zu erreichen. Wiederholen Sie drei weitere Male, Lambda und halb-Lambda und Lambda-ein Viertel zu erreichen.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Temperatur im Wasserbad 37 ° C.</li>
	<li>Fügen Sie 100 μl der lysate pro Reagenzglas, Wirbel kurz hinzu und platzieren Sie die Zahnstange mit den Rohren in das Wasserbad für 1 h.</li>
	<li>Invertieren Sie das Rohr mit einer fließenden Bewegung.</li>
	<li>Manuell ein Rekordergebnis mit "+" (festen Gerinnsel) oder "-" (keine Gerinnsel oder losen Blutgerinnsel) auf dem Blatt der Bank.</li>
	<li>Fahren Sie mit der Analyse nach USP Wette 854; verwenden Sie das Blatt der Bank als Trägermaterial</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Informationen in diesem Protokoll ist beschrieben worden, vor15,26 und stützt sich auf mehrere regulatorischer Dokumente, herausgegeben von der US Food and Drug Administration (FDA oder FDA) und Vereinigte Staaten Arzneibuch (USP)4 , 5 , 6 , 27, und ist auch auf den NCL Webseite20 Protokolle STE1.2 (Trübung L...

Ein Endotoxin ist ein Baustein der gramnegativen bakteriellen Zellwand1,2. Es kann aktivieren Immunzellen auf sehr niedrige (Picogram) Konzentrationen1,2. Die proinflammatorischen Mediatoren (Zytokine, Leukotrienen, Eikosanoide, etc.) produziert von den Zellen als Reaktion auf ein Endotoxin sind verantwortlich für Fieber, Hypotonie, Hypertonie und schweren gesundheitlichen Problemen einschließlich Multiorganversagen 1 , 2 , 3. immunvermittelte Nebenwirkungen ausgelöst durch das Endotoxin Schweregrad auf seine Potenz durch die Endotoxin-Zusammensetzung und Struktur bestimmt und in internationalen Endotoxin Units (IUs oder EUs)3gemessen. Die Anzahl dieser Einheiten pro Kilogramm Körpergewicht wird verwendet, um eine pyrogene Schwellendosis von Endotoxin festgelegt. Diese Dosis ist 5 EU/kg für Arzneimittel über alle Routen aber die intrathekale Route verabreicht. Pro Quadratmeter Körperoberfläche, intraokulare Flüssigkeiten, radioaktive Arzneimittel und Produkte verabreicht über intrathekale Route dosiert Medikamente haben eine unterschiedliche pyrogene Schwellendosis, die 100 EU/m2, 0,2 EU/mL, 175 EU/V (wo V ist die Volumen des Produktes für die Verwaltung), und 0,2 EU/kg, bzw.4. Weitere Details über die pyrogene Schwellendosis für verschiedene Medikamente und Geräte werden zur Verfügung gestellt und4,5,6an anderer Stelle erläutert.
Tiere sind sehr unterschiedlich in ihrer Empfindlichkeit gegenüber Endotoxin-vermittelten Reaktionen. Menschen, nicht-menschlichen Primaten und Kaninchen sind unter den meisten extrem empfindlich auf Endotoxine3Arten. Endotoxin-vermittelte Nebenwirkungen bei Patienten zu vermeiden und zu verhindern, dass falsche Schlussfolgerungen der präklinischen Toxizität und Wirksamkeitsstudien, ist es wichtig, genau zu erkennen und zu quantifizieren, Endotoxine in beiden klinischen und präklinischen Grade Formulierungen. Einige derzeit verfügbare Methoden können diese Aufgabe erreichen. Eine davon ist die Probe, Limulus Amoebocyte Lysate (LAL), die häufig, weltweit zu Bildschirm biomedizinische Produkte für die mögliche Endotoxin Verunreinigung sowie verwendet wird zu bakteriellen Infektionen7,8,9zu erkennen. Die lysate aus Amöbozyten bereit ist, die Zellen im Blut von Pfeilschwanzkrebse Limulus Polyphemus präsentieren mit Wohnsitz in der Ostküste des Kontinents Nordamerika7. Interessanterweise gibt es ein paar verschiedene Arten von Pfeilschwanzkrebse (Tachypleus Gigas und Tachypleus Tridentatus) in Asien10. Tachypleus Amoebocyte Lysate (TAL) wird in mehreren asiatischen Ländern verwendet, für den Nachweis von Endotoxin ähnlich wie die LAL in anderen Cuntries10verwendet wird. Die Lysaten (LAL und TAL) enthalten eine Gruppe von Proteinen, die bei Aktivierung Protease-Aktivität zu verleihen. Eines dieser Proteine, die so genannte Faktor C wird bei Kontakt mit Endotoxin aktiviert. Aktivierten Faktor C spaltet Faktor B, die wiederum auch wird eine Protease und bindet sich ein Pro-gerinnende Enzym zu einer Blutgerinnung Enzym herzustellen. Das Ergebnis dieser Kette von Reaktionen ist die Bildung eines Gels, eine Erhöhung der in der Probe Trübung und in Anwesenheit von einem chromogenen Substrat, das Erscheinungsbild der ein farbiges Produkt, das als Grundlage für Gel-Clot, Trübung und chromogenen Tests dienen, bzw.. Zwar gibt es keine verbindlichen LAL-Format, die US Food and Drug Administration (FDA) erklärt in der Anleitung für Papier, Industrie, daß im Falle von Abweichungen in den Testergebnissen zwischen verschiedenen LAL-Formaten, die Entscheidung getroffen wird anhand der Gel-Clot-Assay5 .
Viele gängigen Laborchemikalien (zB., EDTA) und bekannte Droge Produkte (z. B. Penicillin) LAL stören assays11. Der Eingriff wird in der Regel durch Beurteilung der Erholung von der Endotoxin standard versetzt in einer bekannten Konzentration in einer Lösung, die das Testmaterial identifiziert. Wenn die Spitze Erholung weniger als 50 % oder mehr als 200 %, dann das Ergebnis der LAL assay für ist die gegebenen Testmaterial durch Hemmung oder Verstärkung, bzw.4ungültig. Nanotechnologie-basierte Formulierungen sind oft komplex und stören die LAL durch eine Vielzahl von Mechanismen12,13,14. Viele Ansätze sind beschrieben worden, um die Störungen zu überwinden: Probe Rekonstitution in speziellen Puffer und Tensiden, Protein-Inaktivierung durch Erhitzen, Vernichtung von Lipid-basierte hohl Material durch Erhitzen und Ergänzung der Probe mit Selbstbeteiligung zweiwertigen kationen5,12,13,14,15. Alternative Methoden für Situationen, in denen LAL Störungen überwunden werden kann sind auch beschrieben worden: ELISA, ein HEK-TLR4 Reporter Cell line Assay und Massenspektrometrie16,17,18, 19.
Experimentelle Verfahren für die Durchführung von Gel-Clot, Trübung und chromogenen LAL-Assays sind hier beschrieben. Diese Tests sind auch auf die Nanotechnologie Charakterisierung Lab (NCL) Webseite20 in Protokollen STE1.2 (Trübung LAL), STE1.3 (Gel-Clot LAL) und STE1.4 (chromogene LAL). Es wird empfohlen, mindestens zwei verschiedene Formate zur Charakterisierung der gleichen Nano-Formulierung durchzuführen. Wenn Ergebnisse der Trübung und chromogenen LAL nicht einverstanden sind, gelten die Gel-Clot Ergebnisse5. Wenn die Ergebnisse von zwei LAL Formaten nicht einverstanden sind, durchgeführt21zusätzliche Studien mit Monocyte Aktivierung Test (MAT) oder Kaninchen Pyrogentest (RPT), um LAL zu überprüfen sind. Es ist wichtig zu beachten, dass jede Methode Endotoxin-Erkennung und Pyrogenität Bewertung Vorteile und Einschränkungen21,22,23,24 hat. Grenzen des Verfahrens verwendet, um eine gegebene Nanotechnologie Formulierung charakterisieren zu erkennen ist wichtig, wissenschaftliche Rechtfertigung für die Anwendung des Verfahrens für die Nano-Formulierung optimal erhalten.
In dieser Studie wurde pegylierte liposomale Doxorubicin als Modell Nanopartikel Formulierung verwendet. Diese Formulierung wurde 1995 von der US-Zulassungsbehörde FDA genehmigt und zur Behandlung von Krebs-Patienten weltweit25.

<table><tbody><tr><td><stark>Trübung LAL Assay</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma</td><td>S2770</td><td>Bei Bedarf wird es verwendet, um den pH-Wert der Probe auf einen Wert zwischen 6 und 8</td></tr><tr><td>einzustellen Salzsäure</td><td>Sigma</td><td>H9892</td><td>Bei Bedarf wird es verwendet, um den pH-Wert der Probe auf einen Wert zwischen 6 und 8</td></tr> einzustellen <tr><td>LAL Reagenz</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>T0051</td><td>Dieses Reagenz kann mit Trübung verwendet werden Nur</td></tr><tr><td>Assay Control Endotoxin Standard</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>E0005</td><td>Dieses Reagenz kann mit Trübungs- und Gelgerinnsel-Assays verwendet werden</td></tr><tr><td>LAL-Qualität</td><td>Wasser Associates of Cape Cod</td><td>WP0501</td><td>Dieses Reagenz kann mit jedem LAL-Format verwendet werden</td></tr><tr><td>Glucashield Buffer</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>GB051-25</td><td>Wird verwendet, um falsch-positive Reaktionen von Beta-Glucanen</td></tr> <tr><td>zu verhindernEndotoxinfreie Einweg-Verdünnungsröhrchen aus Glas 12 x 75 mm</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>TB240</td><td>Diese Röhrchen können mit allen drei Assays verwendet werden</td></tr><tr><td>Endotoxinfreie Einweg-Reaktionsröhrchen aus Glas 8 x 75 mm</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>TK100</td><td>Diese Röhrchen können mit Trübungs- und chromogenen Assays verwendet werden</td></tr><tr><td>Pyrogenfreie Spitzen mit Volumina 0,25 und 1,0 mL</td><td>RAININ</td><td>PPT25, PPT10</td><td>Spitzen und Pipetten können Endotoxin adsorbieren und auslaugbare Stoffe freisetzen, die den LAL-Assay beeinträchtigen. Diese RAININ-Spitzen werden verwendet, da ihre optimale Leistung im LAL-Assay verifiziert und bestätigt wurde</td></tr><tr><td>Pyrogenfreie Mikrozentrifugenröhrchen, 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22600044</td><td>Andere gleichwertige Verbrauchsmaterialien können verwendet werden</td></tr><tr><td>Pyrogen-fee Kombitips, 5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30089669</td><td>Andere gleichwertige Verbrauchsmaterialien können verwendet werden</td></tr><tr><td>Repeat-Pipettierer</td><td>Eppendorf</td><td>4982000020</td> Andere <td>gleichwertige Verbrauchsmaterialien können verwendet werden</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>jede Marke</td><td></td><td>Jede Marke kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Kühlschrank, 2-8 C</td><td>jede Marke</td><td></td><td>Jede Marke kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>jede Marke</td><td></td><td>Jede Marke kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Gefrierschrank, -20 C</td><td>jede Marke</td><td>Jede Marke</td><td></td> kann verwendet werden</tr><tr><td>Pyros Kinetix oder Pyros Kinetix Flex Leser</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>PKF96</td><td>Andere Instrumente können verwendet werden. Die in diesem Assay verwendeten LAL-Reagenzien und Endotoxinstandards müssen jedoch möglicherweise optimiert werden. Wenn andere Messgeräte verwendet werden, wenden Sie sich bitte an die Hersteller des Geräts und des LAL-Kits, um Anweisungen zu erhalten</td></tr><tr><td>Chromogener LAL Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyrochrom LAL Reagent</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>CG1500-5</td><td>Dieses Reagenz ist spezifisch für die Chromogenic</td></tr><tr><td>Assay Control Endotoxin Standard</td><td>Associates von Cape Cod</td><td>EC010</td><td>Dieser Standard unterscheidet sich von dem, der für Trübungs- und Gelgerinnsel-LALs verwendet wird. Es ist optimiert für eine optimale Leistung im chromogenen Assay</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma</td><td>S2770</td><td>Bei Bedarf wird es verwendet, um den pH-Wert der Probe auf einen Wert zwischen 6 und 8</td></tr><tr><td>einzustellen Salzsäure</td><td>Sigma</td><td>H9892</td><td>Bei Bedarf wird es verwendet, um den pH-Wert der Probe auf einen Wasserwert zwischen 6 und 8</td></tr><tr><td>LAL</td> einzustellen <td>Associates of Cape Cod</td><td>WP0501</td><td>Dieses Reagenz kann mit jedem Glucashield-Puffer im LAL-Format verwendet werden</td></tr><tr><td></td><td>Associates of Cape Cod</td><td>GB051-25</td><td>Wird verwendet, um falsch-positive Reaktionen von Beta-Glucanen zu verhindern</td></tr><tr><td>Einweg-Endotoxin-freie Glasverdünnungsröhrchen 12 x 75 mm</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>TB240</td><td>Diese Röhrchen können mit allen drei Assays verwendet werden</td></tr><tr><td>Einweg-Reaktionsröhrchen aus endotoxinfreiem Glas 8 x 75 mm</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>TK100</td><td>Diese Röhrchen können mit Trübungs- und chromogenen Assays</td></tr> <tr><td>verwendet werdenPyrogenfreie Spitzen mit einem Volumen von 0,25 und 1,0 ml</td><td>RAININ</td><td>PPT25, PPT10</td><td>Spitzen und Pipetten können Endotoxin adsorbieren und auslaugbare Stoffe freisetzen, die den LAL-Assay beeinträchtigen. Diese RAININ-Spitzen werden verwendet, da ihre optimale Leistung im LAL-Assay verifiziert und bestätigt wurde</td></tr><tr><td>Pyrogenfreie Mikrozentrifugenröhrchen, 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22600044</td><td>Andere gleichwertige Verbrauchsmaterialien können verwendet werden</td></tr><tr><td>Pyrogen-fee Kombitips, 5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30089669</td><td>Andere gleichwertige Verbrauchsmaterialien können verwendet werden</td></tr><tr><td>Repeat-Pipettierer</td><td>Eppendorf</td><td>4982000020</td> Andere <td>gleichwertige Verbrauchsmaterialien können verwendet werden</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>jede Marke</td><td></td><td>Jede Marke kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Kühlschrank, 2-8 C</td><td>jede Marke</td><td></td><td>Jede Marke kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>jede Marke</td><td></td><td>Jede Marke kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Gefrierschrank, -20 C</td><td>jede Marke</td><td>Jede Marke</td><td></td> kann verwendet werden</tr><tr><td>Pyros Kinetix oder Pyros Kinetix Flex Leser</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>PKF96</td><td>Andere Instrumente können verwendet werden. Die in diesem Assay verwendeten LAL-Reagenzien und Endotoxinstandards müssen jedoch möglicherweise optimiert werden. Wenn andere Instrumente verwendet werden, wenden Sie sich bitte an die Hersteller des Geräts und des LAL-Kits, um Anweisungen zu erhalten</td></tr><tr><td>Gel-Clot LAL Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAL Reagent</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>G5003</td><td>Dieses Reagenz ist spezifisch für den Gel-Gerinnsel-Assay</td></tr><tr><td>Control Endotoxin Standard</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>E0005</td><td>Dieses Reagenz kann mit Trübungs- und Gel-Gerinnsel-Assays verwendet werden</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma</td><td>S2770</td><td>Bei Bedarf wird es verwendet, um den pH-Wert der Probe auf einen Wert zwischen 6 und 8</td></tr><tr><td>einzustellen Salzsäure</td><td>Sigma</td><td>H9892</td><td>Bei Bedarf wird es verwendet, um den pH-Wert der Probe auf einen Wasserwert zwischen 6 und 8</td></tr><tr><td>LAL</td> einzustellen <td>Associates of Cape Cod</td><td>WP0501</td><td>Dieses Reagenz kann mit jedem LAL-Format verwendet werden</td></tr><tr><td>Glucashield Buffer</td><td>Associates von Cape Cod</td><td>GB051-25</td><td>Zur Verhinderung falsch-positiver Reaktionen von Beta-Glucanen</td></tr><tr><td>Einweg-Verdünnungsröhrchen aus endotoxinfreiem Glas 12 x 75 mm</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>TB240</td><td>Diese Röhrchen können mit allen drei Assays verwendet werden</td></tr><tr><td>Endotoxinfreie Einweg-Reaktionsröhrchen aus Glas 10 x 75 mm</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>TS050</td><td>Diese Röhrchen sind für die Verwendung mit dem Gel-Gerinnsel-Assay bestimmt</td></tr><tr><td>Pyrogenfreie Spitzen mit einem Volumen von 0,25 und 1 mL</td><td>RAININ</td><td>PPT25, PPT10</td><td>Spitzen und Pipetten können Endotoxine adsorbieren und auslaugbare Stoffe freisetzen, die den LAL-Assay beeinträchtigen. Diese RAININ-Spitzen werden verwendet, da ihre optimale Leistung im LAL-Assay verifiziert und bestätigt wurde</td></tr><tr><td>Pyrogenfreie Mikrozentrifugenröhrchen, 2,0 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22600044</td><td>Andere gleichwertige Verbrauchsmaterialien können verwendet werden</td></tr><tr><td>Pyrogen-fee Kombitips, 5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30089669</td><td>Andere gleichwertige Verbrauchsmaterialien können verwendet werden</td></tr><tr><td>Repeat-Pipettierer</td><td>Eppendorf</td><td>4982000020</td> Andere <td>gleichwertige Verbrauchsmaterialien können verwendet werden</td></tr><tr><td>Mikrozentrifuge</td><td>jede Marke Jede Marke</td><td></td><td>kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Kühlschrank, 2-8 C</td><td>jede Marke</td><td></td><td>Jede Marke kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Jede Marke</td><td></td><td>Jede Marke kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Gefrierschrank, -20 C</td><td>jede Marke</td><td>Jede Marke</td><td></td> kann verwendet werden</tr><tr><td>Wasserbad, 37 C</td><td>jede Marke</td><td></td><td>Jede Marke kann verwendet werden, jedoch ist es wichtig, entweder die Wasserzirkulation auszuschalten oder ein nicht zirkulierendes Wasserbad zu verwenden, da der Wasserfluss die Gerinnselbildung beeinflusst und zu falsch-negativen Ergebnissen führt</td></tr></tbody></table>

nachweis von endotoxin im nano-rezepturen mit limulus amoebocyte lysate (lal) assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Wenn Sie in pharmazeutischen Produkten, eine gramnegative bakterielle Zellwand Komponente Endotoxin (oft auch als Lipopolysaccharid) kann dazu führen, dass Entzündungen, Fieber, Hypo- oder Hypertonie, und, in extremen Fällen kann zu führen Gewebe und Organ-Schäden, die möglicherweise werden Sie tödlich. Die Beträge von Endotoxin in pharmazeutischen Produkten sind daher streng geregelt. Unter den Methoden für die Endotoxin-Erkennung und Quantifizierung ist der Test Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) weltweit verbreitet. Während der LAL-Test Arzneimittel stören kann, stellen Nano-Formulierungen aufgrund ihrer Komplexität eine besondere Herausforderung dar. Dieses Papier soll eine praktische Anleitung zum Forscher unerfahrenen bei der Abschätzung der Endotoxine in Nanomaterialien und Nanopartikel formuliert Drogen zu bieten. Hier werden praktische Empfehlungen für die Durchführung von drei LAL-Formate einschließlich Trübung, chromogenen und Gel-Clot Assays diskutiert. Diese Tests können zur Endotoxin-Kontamination in Nanotechnologie-basierte Medikamente, Impfstoffe und Adjuvantien herangezogen werden.

Das Beispiel von Daten nach der Prüfung dieser Formulierung in LAL-Tests ist in Tabelle 1dargestellt. Pegyliertem liposomalen Doxorubicin mischte sich mit chromogenen LAL bei Verdünnung 5. Jedoch wurde diese Störungen durch höhere Verdünnungen überwinden. Spike Erholung war zwischen 50 und 200 %, wenn diese Formulierung bei Verdünnungen 50 und 500 in Trübung und chromogenen LAL sowie bei Verdünnung 5 Trübung LAL getestet wurde. Wenn durch den Verdünnungsfaktor angepasst, ...

Erkennung von Endotoxinen in Nanomaterialien stellt eine der großen Herausforderungen im Bereich der Nanomedizin. Hier präsentieren wir Ihnen eine Fallstudie, die beschreibt den Rahmen, bestehend aus drei verschiedenen LAL-Formaten, mögliche Endotoxin-Kontamination in Nanopartikel zu schätzen.

Nachweis von Endotoxin im Nano-Rezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Diese Methode kann helfen, im medizinischen Bereich über die Sicherheit von Nanoarzneimitteln zu antworten. Der Vorteil dieser Technik ist, dass es Standard ist, und wird weltweit für die Bewertung von Produkten verwendet, Um Nano-Medikamente. Demonstration des Verfahrens, wird Barry Neun, im Nano Technology Characterization Lab sein.Verwenden Sie für die Kalibrierungsstandardvorbereitung 900 Mikroliter Limulus-Amebocytlysat oder LAL-Wasser. Und 100 Mikroliter Kontrollstandard Endotoxin, um so viele Zwischenverdünnungen wie nötig vorzubereiten, um die Herstellung eines Kalibrierstandards mit einer Konzentration von einer Endotoxineinheit pro Milliliter zu ermöglichen. Mit 900 Mikroliter LAL-Wasser und 100 Mikrolitern der einheit pro Milliliter Kalibrierstandard erstellen Sie einen zweiten Kalibrierstandard bei einer Konzentration von 0,1 Endotoxineinheit pro Milliliter.Wiederholen Sie dann die serielle Verdünnung um das Zehnfache, um zwei niedrigere Kalibrierstandards vorzubereiten. Um insgesamt vier Kalibrierstandards zu erhalten, die von 0001 bis zu einer Endotoxineinheit pro Milliliter reichen. Zur Herstellung einer 05 Endotoxineinheit pro Milliliter Qualitätskontrolle, kombinie

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Video beschreibt das turbidimetrische Format des Limulus-Amöbozyten-Lysat- oder LAL-Assays zur Abschätzung der Endotoxin-Kontamination in PEGylierten liposomalen Doxorubicin-Nanoformulierungen. Die Trübung der Lösung nach der Reaktion des Endotoxins mit dem LAL-Reagenz hilft bei der Abschätzung des Endotoxins in der Probe.

Turbidimetrischer Limulus-Amöbozyten-Lysat-Assay: Eine Technik zum Nachweis und zur Quantifizierung von Endotoxin-Kontamination in nanoformulierten Arzneimitteln

Dieses Video beschreibt einen Gel-Gerinnsel-Assay zur Bestimmung des Vorhandenseins von bakteriellen Endotoxinen in Nanoformulierungen unter Verwendung von Limulus Amöbozyten-Lysat, das aus den Blutzellen von Pfeilschwanzkrebsen gewonnen wird. Der Assay hilft bei der Prüfung auf Endotoxin-Kontamination von pharmazeutischen Produkten, einschließlich nanobasierter Formulierungen.

Gel-Gerinnsel-Limulus-Amöbozyten-Lysat-Assay: Eine Methode zum Nachweis von bakteriellem Endotoxin in Nanopartikelformulierungen

Dieses Video zeigt einen Assay zur Untersuchung der Toll-like Rezeptor (TLR)-abhängigen Aktivität der Transkriptionsfaktoren Kernfaktor-kappa-B (NF-κB) und Aktivatorprotein-1 (AP-1) in Makrophagen. Die TLRs lösen bei der Erkennung von schadensassoziierten molekularen Mustern (DAMPs) eine proinflammatorische Signalkaskade aus, die NF-κB und AP-1 aktiviert. Die manipulierten Reportermakrophagen produzieren bei Aktivierung von NF-κB und AP-1 ein sezerniertes embryonales alkalisches...

Ein Assay für die TLR-abhängige NF-&kcy;B/AP-1-Transkriptionsfaktor-Signalgebung in Makrophagen

Dieses Video zeigt einen Reporterzell-basierten Assay zum Screening potenzieller bioaktiver Nanopartikel, die die Signalübertragung des Toll-like-Rezeptors (TLR) hemmen. Der Assay beinhaltet die Einführung von Lipopolysacchariden (LPS), gemischt mit Peptid-Gold-Nanopartikel-Hybriden, in Reportermakrophagen, die die Reporterproteine exprimieren – sezernierte embryonale alkalische Phosphatase (SEAP) und Luciferase. Die Reduktion des LPS-induzierten TLR-Signals, das durch die Hybride vermittelt...

Ein Assay zum Screening bioaktiver Nanopartikel auf die Hemmung der Toll-like-Rezeptor-Signalgebung

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Wir stellen hiermit ein Protokoll vor, um am Krankenbett die Endotoxinaktivität menschlicher Vollblutproben zu messen. Der Endotoxin Activity Assay ist ein einfacher Test und kann ein nützlicher Biomarker bei kritisch kranken Patienten mit Sepsis sein.

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Erfahren Sie den Nachweis von Endotoxinen in Nanorezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays. Diese standardisierte Methode ermöglicht zuverlässige Sicherheitsbewertungen für Nanomedizin-Anwendungen.

Nachweis von Endotoxin im Nano-Rezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

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