Nachweis von Endotoxin im Nano-Rezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays
30. Januar 2019
Erkennung von Endotoxinen in Nanomaterialien stellt eine der großen Herausforderungen im Bereich der Nanomedizin. Hier präsentieren wir Ihnen eine Fallstudie, die beschreibt den Rahmen, bestehend aus drei verschiedenen LAL-Formaten, mögliche Endotoxin-Kontamination in Nanopartikel zu schätzen.
Diese Methode kann helfen, im medizinischen Bereich über die Sicherheit von Nanoarzneimitteln zu antworten. Der Vorteil dieser Technik ist, dass es Standard ist, und wird weltweit für die Bewertung von Produkten verwendet, Um Nano-Medikamente. Demonstration des Verfahrens, wird Barry Neun, im Nano Technology Characterization Lab sein.
Verwenden Sie für die Kalibrierungsstandardvorbereitung 900 Mikroliter Limulus-Amebocytlysat oder LAL-Wasser. Und 100 Mikroliter Kontrollstandard Endotoxin, um so viele Zwischenverdünnungen wie nötig vorzubereiten, um die Herstellung eines Kalibrierstandards mit einer Konzentration von einer Endotoxineinheit pro Milliliter zu ermöglichen. Mit 900 Mikroliter LAL-Wasser und 100 Mikrolitern der einheit pro Milliliter Kalibrierstandard erstellen Sie einen zweiten Kalibrierstandard bei einer Konzentration von 0,1 Endotoxineinheit pro Milliliter.
Wiederholen Sie dann die serielle Verdünnung um das Zehnfache, um zwei niedrigere Kalibrierstandards vorzubereiten. Um insgesamt vier Kalibrierstandards zu erhalten, die von 0001 bis zu einer Endotoxineinheit pro Milliliter reichen. Zur Herstellung einer 05 Endotoxineinheit pro Milliliter Qualitätskontrolle, kombiniert 50 Mikroliter der einen Endotoxineinheit pro Milliliter der Kontrollstandard-Endotoxin-Lösung, mit 950 Mikroliter LAL-Wasser.
Wählen Sie als Nächstes in der Software die Geräteeinstellungen aus, und erstellen Sie die Vorlage. Wählen Sie Daten sammeln aus, und geben Sie die Test-ID und die Datengruppe auf der Registerkarte Allgemein ein. Wählen Sie auf der Registerkarte Hardware den Gerätetyp und die LAL-Methode aus, und stellen Sie sicher, dass eine Seriennummer, die System-ID und die Informationen zum seriellen Anschluss auf dem Bildschirm angezeigt werden.
Klicken Sie zwei Mal auf okay, um die Instrumentenauswahl und die Kommunikation mit dem Instrument zu bestätigen, und geben Sie die Beispiel-IDs in der gleichen Reihenfolge ein, in der die Samples getestet werden. Verwenden Sie dann die Standardschaltflächen, um die Negative-Steuer-Standardkurve einzugeben, und testen Sie Beispiele. Fügen Sie das entsprechende Volumen negativer Kontrollkalibrierungsstandards und Qualitätskontrolle in doppelte vorbeschriftete Glasröhren ein.
Und fügen Sie das entsprechende Volumen von LAL zum ersten Test-Abscheu hinzu. Wirbeln Sie den Teufel kurz, und legen Sie die Durchstechflasche in die entsprechenden Testschlitze im Instrumentenkarussell. Führen Sie vor dem Beladen der Proben mehrere Verdünnungen des Test-Nanomaterials innerhalb der maximal gültigen Verdünnung durch, wie gezeigt.
Um eine 05 Endotoxineinheit pro Milliliter Hemmungsverbesserungskontrolle vorzubereiten, kombinieren Sie 25 Mikroliter der einen Endotoxineinheit pro Milliliter Kontrollstandard-Endotoxinlösung, mit 475 Mikrolitern des Test-Nanomaterials bei einer gegebenen Verdünnung. Laden Sie nach dem Wirbeln die entsprechenden Steuerelemente für die Innovationsverbesserung und die nicht gespickten Studienproben in das Gerät. Dann aliquot unspiked und die gespickten Nano-Materialien bei einer bestimmten Verdünnung in vorbeschriftete Rohre.
Vor dem Wirbeln und Laden in das Instrumentenkarussell. Um ein Gel-Clot LAL durchzuführen, bereiten Sie die Kontrollstandard-Endotoxin auf eine endgültige Konzentration von vier Lambda vor und kombinieren Sie 100 Mikroliter Standard mit 100 Mikroliter Wasser oder Eine Testprobe, um eine endgültige Konzentration des Kontrollstandards Endotoxin zwei Lambda zu erreichen. Fügen Sie 100 Mikroliter Lysin zu jeder Lambda-Verdünnung hinzu.
Wirbeln Sie die Rohre kurz, und legen Sie das Rack der Rohre in einem 37 Grad Celsius Wasserbad für eine Stunde. Am Ende der Inkubation, invertieren Sie die Rohre mit einer glatten Bewegung, und zeichnen Sie die Ergebnisse manuell mit Plus für ein festes Gerinnsel, und Minus für kein Gerinnsel, oder ein loses Gerinnsel. In dieser repräsentativen Analyse störte PEGylatd liposomale doxorubicin mit chromogenem LAL bei Verdünnung fünf, jedoch wurde diese Interferenz bei höheren Verdünnungen überwunden.
Die Spike-Wiederherstellung lag zwischen 50 und 200%, als die Formulierung an den Verdünnungen 50 und 500 in der Trübung und chromogenen LAL sowie bei Verdünnung 5 in der Trübung LAL getestet wurde. Bereinigt um den Verdünnungsfaktor waren die Ergebnisse zwischen den Wahnvorstellungen in beiden Aufsätzen konsistent. Darüber hinaus waren die Ergebnisse zwischen den drei Essayformaten konsistent.
Denken Sie daran, dass jede Probe ihren eigenen Bereich von Verdünnungen hat, jedes LAL-Format verwendet seinen Kontrollstandard im Doxin und Lysat, und dass die Rohre verwendet werden, um die Verdünnungen vorzubereiten, und eine Reaktion mit unterschiedlichen für jeden LAL-Essay durchzuführen. Für dieses Verfahren andere Methoden wie Kann durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über Material zu beantworten Nach seiner Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für die Nähte und den Bereich der Nanomedizin, um die medizinischen Anwendungen der Nanotechnologie formulierte Medikamente beim Menschen zu erforschen, und klinische Modelle einschließlich, aber nicht beschränkt auf nicht menschliche Primaten, Kaninchen, Hunde und Ratten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Doxin extrem gefährlich sein kann und die Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.
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Übersicht
Diese Studie befasst sich mit der Herausforderung, Endotoxine in technisch hergestellten Nanomaterialien nachzuweisen, ein zentrales Problem in der Nanomedizin. Sie stellt einen Rahmen vor, der drei verschiedene LAL-Formate nutzt, um eine mögliche Endotoxin-Kontamination von Nanopartikeln zu bewerten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Nanomedizin
- Endotoxin-Detektion
- Sicherheitsbewertung von Nanopartikeln
Hintergrund
- Endotoxine können erhebliche Risiken bei medizinischen Anwendungen von Nanomaterialien darstellen.
- Standardverfahren zur Endotoxinnachweisung sind entscheidend, um die Sicherheit von Nanomedikamenten sicherzustellen.
- Limulus-Amebozyten-Lysat (LAL) ist ein weit verbreitetes Reagenz für die Endotoxinprüfung.
- Das Verständnis der Kontaminationsgrade in Nanopartikeln ist für die Einhaltung behördlicher Vorschriften unerlässlich.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines zuverlässigen Rahmenwerks zur Abschätzung der Endotoxin-Kontamination in technisch hergestellten Nanomaterialien.
- Aufzeigen der Anwendung von LAL-Formaten bei der Bewertung der Sicherheit von Nanopartikeln.
- Bereitstellung einer standardisierten Methode für Forschende auf diesem Gebiet.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Kalibrierstandards unter Verwendung von LAL und kontrolliertem Standard-Endotoxin.
- Erstellung von Zwischendilutionen, um die gewünschten Konzentrationen zu erreichen.
- Demonstration des Verfahrens durch einen qualifizierten Forscher.
- Verwendung von LAL-Reinstwasser für genaue Tests.
Hauptergebnisse
- Der entwickelte Rahmen ermöglicht eine effektive Schätzung der Endotoxin-Konzentrationen in Nanopartikeln.
- Standardisierte Methoden erhöhen die Zuverlässigkeit von Sicherheitsbewertungen.
- Die Demonstration des Verfahrens bestätigt seine Anwendbarkeit in realen Szenarien.
- Die Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung einer sorgfältigen Prüfung in der Nanomedizin.
Schlussfolgerungen
- Die Studie bietet einen wertvollen Ansatz für den Nachweis von Endotoxinen in Nanomaterialien.
- Standardisierte Testmethoden sind entscheidend, um die Sicherheit in der Nanomedizin voranzutreiben.
- Weitere Forschung ist erforderlich, um diese Methoden zu verfeinern und umfassende Sicherheitsbewertungen sicherzustellen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Der Nachweis von Endotoxinen ist ein entscheidender Schritt in der Qualitätskontrolle bei der Entwicklung von Nanomedikamenten, da Nanoformulierungen die Standardtests stören und die Produktsicherheit beeinträchtigen können. Der LAL-Test bietet ein standardisiertes, weltweit anerkanntes Verfahren zur Quantifizierung von Endotoxin-Kontaminationen in nanopartikulären Arzneimitteln, Impfstoffen und Adjuvantien. Ein zuverlässiger Endotoxin-Test unterstützt die Einhaltung behördlicher Vorschriften und reduziert Risiken bei der präklinischen Entwicklung, indem entzündungsauslösende Gefahren bereits früh im Entdeckungsprozess identifiziert werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von Sicherheitsprofilen von Nanomaterialien durch den Nachweis endotoxininduzierter inflammatorischer Artefakte, die Target-Validierungsstudien verfälschen könnten.
- Operativer Wert: Bietet einen standardisierten Workflow, um echte pharmakologische Effekte von endotoxinvermittelten falsch-positiven Ergebnissen in frühen Screening-Phasen zu unterscheiden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Herstellung qualifizierter biologischer Systeme für nachgeschaltete Screening-Verfahren, indem niedrige Endotoxin-Konzentrationen in nanoformulierten Substanzbibliotheken bestätigt werden.
- Operationaler Wert: Liefert quantitative, reproduzierbare Ergebnisse über verschiedene LAL-Testformate hinweg – Trübung, chromogen und Gel-Clot – und ermöglicht dadurch die Standardisierung von Assays sowie den Vergleich zwischen verschiedenen Plattformen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Stellt sicher, dass krankheitsrelevante Systeme nicht durch endotoxinvermittelte Entzündungen beeinträchtigt werden, und bewahrt so die mechanistische Entlastung von Risiken in translationsnahen Modellen.
- Operationaler Wert: Erleichtert risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem eine konsistente Quantifizierung von Endotoxinen über alle Chargen von Substanzen in Forschung, präklinischer und klinischer Phase hinweg bereitgestellt wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der LAL-Test ist in die Kontinuum von der Entdeckung bis zur präklinischen Phase als Sicherheitskontrolle eingebettet, die auf die frühe Synthese von Nanomaterialien folgt und der biologischen Bewertung in Krankheitsmodellen vorausgeht.
- Entdeckungsbiochemie: Bestätigt, dass die beobachtete biologische Aktivität in Target-Validierungsassays nicht auf Endotoxin-Kontamination zurückzuführen ist, und unterstützt so die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen.
- Screening: Liefert standardisierte Endotoxin-Messungen, die eine zuverlässige Bewertung von Verbindungen und die Auswahl von Hits in nanoformulierten Bibliotheken ermöglichen.
- Analytik: Erzeugt quantitative Endotoxin-Einheiten/mL-Auswertungen aus drei LAL-Formaten, wodurch Teams Kontaminationsgrade zwischen verschiedenen Formulierungen und Verdünnungsreihen vergleichen können.
- Translationale Forschung: Verbindet die Sicherheitsbewertung von Nanomaterialien mit der präklinischen Kontinuität, indem sichergestellt wird, dass Testsubstanzen die Endotoxin-Schwellenwerte vor In-vivo-Studien einhalten.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für die Endotoxin-Testung, die in verschiedenen Projekten der Nanomedizin sowie in der Entwicklung von Impfstoffen und Adjuvantien eingesetzt werden kann.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanische Unklarheiten, indem Endotoxin als störender Faktor in pharmakologischen und immunologischen Assays eliminiert wird.
- Operativer Wert: Gewährleistet Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der Endotoxin-Detektion über verschiedene LAL-Formate und Nanomaterialtypen hinweg.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Entwicklungsprojekten durch frühzeitige Sicherheitsdaten und verringert späte Ausscheiden biologischer Wirkstoffe sowie Kapitalineffizienzen.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikobasierte Priorisierung von Nanoformulierungen anhand quantifizierter Endotoxinprofile und der Leistung bei der Wiederfindung von Endotoxin-Spikes.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in den Prinzipien der Endotoxin-Assays, im Umgang mit Nanomaterialien und in Strategien zur Minderung von Störungen.
- Setzt den Zugang zu LAL-Reagenzien, kalibrierten Geräten (z. B. Mikroplattenlesegeräte, Inkubatoren) sowie endotoxinfreiem Wasser und Laborverbrauchsmaterial voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen hinsichtlich Verdünnungsprotokollen, Einbeziehung von Kontrollen (negativ, positiv, Inhibierung/Verstärkung) und der Interpretation der Ergebnisse über die verschiedenen Testformate hinweg – Trübung, chromogen und Gel-Clot.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen für unterschiedliche Eigenschaften von Nanomaterialien (z. B. Ladung, Größe, Oberflächenchemie), die die LAL-Reaktivität beeinflussen können und individuelle Verdünnungsbereiche erfordern.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie die durch Nanopartikel verursachten Störungen im Assay (Verstärkung oder Hemmung), die durch Optimierung der Verdünnung und Spike-Recovery-Kontrollen, wie in der Studie gezeigt, berücksichtigt werden müssen.
