Name: Intra-omentalis Islet Transplantation mittels h-omentalis Matrix Islet Füllung (hOMING) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Lernen Sie die hOMING-Technik zur Intra-omentalen Islet-Transplantation mit Hydrogel-Matrix kennen. Diese Methode optimiert die Engraftment-Effizienz und ermöglicht schnelle Biomaterialvalidierung bei Rattenmodellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde von Région Alsace, BioArtMAtrix-Pôle Alsace Biovalley-CQDM finanziert; 53/14/C1. Die Autoren sind dankbar für das Team von Pr. Bruant-Rodier von Hôpitaux Universitaires de Strasbourg für Hilfe bei der Entwicklung dieser innovativen Technik.

Alle Tierversuche wurden nach den Richtlinien der National Institutes of Health, die Autorisierungsnummer durchgeführt: AL/60/67/02/13.
1. Empfänger Vorbereitung
<ol><li>
Diabetes im Empfänger Ratten chemisch zu induzieren.
	<ol>
<li>75 mg/kg Streptozocin (STZ, in sterilen 0,1 M Citrat-Puffer, pH 4) intraperitoneal auf Ratten10zu injizieren. Hinweis: Für die Transplantation Studien wurden 6 Wochen altes Baby Lewis Sorte Ratten mit einem Gewicht von 150-190 g verwendet.</li>
		<li>Überprüfen Sie den Status von Diabetes durch tägliche Blut-Glukose-Messungen während der ersten vier Tage. Injizieren von langwirksamen Insulin 6 U/Tag subkutan, wenn Ratten zeigen Glycemia über 2 g/L zur Vorbeugung von Diabetes-Komplikationen und Gewichtsverlust bis Insulin Pellet Implantation.</li>
		<li>Ratten in der Kohorte gehören, wenn zwei Maßnahmen der Schweif Vene Blutglukose &gt; 4 – 5 g/L für 2 aufeinander folgende Tage und C-Peptid ist &lt; 200 pM. Messen Sie mit einem Blutzuckermessgerät und C-Peptidemia durch ein Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) Glycemia.</li>
		<li>Implantat-Pellets Insulin unter die Haut (siehe 1.2). Hinweis: Chronische Insulintherapie ermöglicht bessere Glycemia Rechtsetzung und vermeidet diabetische Komplikationen (die oxidativen Stress am Standort Transplantation verschlimmern)11. Darüber hinaus schont die Therapie der diabetischen Zustand zusammen mit einer normalen Wachstumskurve (ohne übliche Gewichtsverlust in ein diabetisches Tier beobachtet). Dies führt zu einer größeren omentalis Fettlappen ist ideal für die Durchführung der Transplantation.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Implantation von Insulin pellets
	<ol>
<li>Betäuben Sie die Ratte mit Gas Anästhesie (3 % Isofluran in 500 mL/min O2) zu und die Ratte in Bauchlage.</li>
		<li>Überprüfen Sie Anästhesie Status durch das Fehlen von Reflex (Pfote kneifen) überprüfen. Reinigen Sie den Hals mit Povidon-Jod und Rasieren Sie den Bereich mit einer Rasierklinge zu. Povidon-Jod erneut anwenden und 3 min. stehen lassen.</li>
		<li>Statt 1,5 Insulin Pellets (3 Einheiten (U) / 200 g Ratte) in einer 1:5 verdünnt Povidon-Jod-Lösung um die Pellets zu sterilisieren. Durchbohren Sie die Haut des Halses mit einer 16 G-Trokar und legen Sie die Pellets mit dem eingerichteten Führer und Mandrin. Rufen Sie der Führer und Mandrin ab und Nähen Sie eine zentrale Anlaufstelle. Verwenden Sie Povidon-Jod, um die Masche zu reinigen. Hinweis: Keine Schmerzen nach der Operation-Management war notwendig, da die Intervention einer einzigen subkutanen Injektion der (SC) vergleichbar war.</li>
		<li>Lassen Sie die Ratte aus der Narkose zu erholen und sicherzustellen, dass Ratten Zugang zu Nahrungsmitteln zu Unterzuckerung zu vermeiden.</li>
		<li>Messen Sie die Effizienz der Pellets durch Messung-Biologie Abnahme nach der Implantation.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Pellet-Effizienz durch Glycemia Beobachtungsebene jede Woche für 1 Monat.</li>
		<li>Ratten in der Kohorte enthalten, wenn eine Maßnahme der Schweif Vene Blut C-Peptid-Ebene unter 200 beibehalten wird pM 1 Monat nach der Insulin-Pellet-Implantation. Hinweis: Prüfung C-Peptid Ebenen ist zwingend erforderlich, Tiere zu Studienbeginn vor der Transplantation zu bewerten und zu ihrem diabetischen Zustand bestätigen. Niedrigen C-Peptid-Regeneration immer tritt während der Follow-up. Die niedrigste C-Peptidemia ist bezeichnend für die niedrigsten Regeneration.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) hOMING: Intra-omentalis Matrix Inselchen füllen
<ol><li>
Insel-Matrix Gemischbildung.
	<ol>
<li>Vorbereiten des viskosen Inselchen Trägers in einem Laminar-Flow-Haube. Alginat-Pulver in sterilen PBS in einer Konzentration von 1,5 % zu lösen. Sterilisieren Sie die Vorbereitung durch Passage durch einen 0,22 µm-Filter. Bereiten Sie 400 µL pro Empfänger. Hinweis: Jede Art von Hydrogel mit einer Viskosität geeignet für Injektion durch eine Nadel 21 G einsetzbar.</li>
		<li>Insel von gesunden Lewis Ratten (200-250 g) als zuvor beschriebenen12zu isolieren.</li>
		<li>Anzahl der Insel Insel-Äquivalente (IEQ) (eine IEQ gleichwertig mit einem Pankreas Inselchen mit einem Durchmesser von 150 µm als ist)13.</li>
		<li>Bereiten Sie in einem Laminar-Flow-Haube Aliquote 7660-Inselchen Äquivalent (IEQ) in einer 1,5 mL Tube.</li>
		<li>Waschen Sie Inselchen Aliquote mit 500 µL CMRL (Connaught medizinische Forschungslabors) Medium frei von fetalen Rinderserum.</li>
		<li>Pellet-Inseln durch Zentrifugieren (2 min bei 500 x g und 4 ° C). Verwerfen Sie den überstand.</li>
		<li>Fügen Sie 150 µL Alginat Hydrogel Träger über die Inseln, mischen Sie sorgfältig, indem Sie auf und ab pipettieren und die Mischung auf Eis.</li>
		<li>Bereiten Sie eine atraumatische 21 G Nadel und eine 1 mL Spritze ohne Totvolumen laden 150 µL des leeren Alginat in die Spritze.</li>
		<li>Füllen Sie die Spritze mit der Mischung von kleinen Inseln und Alginat (150 µL, Gesamtvolumen 300 µL). Halten Sie die Spritze auf Eis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Chirurgischer Eingriff
	<ol>
<li>Chirurgische Instrumente mit Kaltentkeimung sterilisieren (2 % Steranios für 20 min).</li>
		<li>Betäuben Sie die Ratte mit Isoflurane Narkose zu und die Ratte in Bauchlage.</li>
		<li>Rasieren Sie den Hals-Bereich mit einer Rasierklinge zu und sterilisieren Sie die Fläche mit Povidon-Jod. Lassen Sie das Jod für 3 min. stehen.</li>
		<li>Machen Sie einen Schnitt mit einem Skalpell und entfernen Sie 1,5 Insulin Pellets mit Pinzette. Schließen Sie die Haut mit ein oder zwei einzelne Stichpunkte. Entfernen Sie nicht die Ratte aus der Narkose. Hinweis: Nach 1 Monat kann das Pellet bröckelig sein, da einige fibrotische Gewebe kann als Pellets wickeln; mit einer Schere um richtig zu sezieren.</li>
		<li>Legen Sie die Ratte in der Rückenlage. Rasieren Sie und desinfizieren Sie (mit Povidon-Jod) die peritonealen Raum. Lassen Sie das Jod für 3 min. stehen.</li>
		<li>Erstellen Sie eine 1,5 cm Laparotomie direkt unter dem Brustbein mit einem Skalpell. Positionieren Sie nass-steriler Gaze um den eingeschnittenen Bereich.</li>
		<li>Identifizieren Sie das Omentum, das Fettpolster neben Bauch lokalisiert ist. Verwenden Sie Zange vorsichtig fangen das Omentum, ziehen es vorsichtig aus der Bauchhöhle und breitete es auf die Gaze. Hinweis: Das omentalis Gewebe aus der Milz erstreckt sich auf den Zwölffingerdarm und legt in die Mitte auf den Magen. Die normalen Omentum von diabetischen Ratten, die Insulintherapie ist ungefähr 2 cm ², wenn auf die Gaze zu verbreiten.</li>
		<li>Hydrat omentalis Gewebe nun mit 2 mL vorgewärmten 37 ° C sterile Kochsalzlösung. Verwenden Sie kleine gebogene Pinzetten zu manipulieren das Gewebe und die omentalis Kante mit der Nadel zwischen den omentalis Schichten zu durchdringen. Stechen Sie die Nadel ganz.</li>
		<li>Beginnen Sie die Injektion von der kleinen Insel Vorbereitung langsam und bewegen Sie vorsichtig die Nadel nach hinten, um die kleinen Inseln an mehreren Stellen (als Linien) zu injizieren. Vor dem Zurückziehen der Nadelöhrs, sicherzustellen Sie, dass das Hydrogel verlassen die Nadel beendet hat um den Verlust der verstreuten Inselchen zu vermeiden.</li>
		<li>Wiederholen Sie diese Manipulation, wie notwendig, um den gesamten Inhalt der Spritze verwenden verschiedene Einstiegspunkte zum Verteilen von der kleinen Inseln durch das omentalis Gewebe injizieren. Hinweis: In Ratten sind in der Regel vier bis fünf Injektionen erforderlich.</li>
		<li>Überprüfen Sie, dass Inselchen in der Spritze am Ende der Injektion nicht gruppiert sind. Hinweis: Wenn einige Inselchen noch sichtbar sind, ist es möglich, ziehen Sie die Nadel heraus aus der Spritze, füllen die Spritze direkt mit 100 µL leer Hydrogel und schließen Sie wieder die Nadel. Eine zweite Runde der Injektion kann getan werden, um die restlichen Inseln spülen.</li>
		<li>Verwenden Sie sterile Kochsalzlösung um Hydrat omentalis Gewebe und der Wand der Laparotomie wieder. Verwenden Sie Zange, um Omentum in der Bauchhöhle sorgfältig zu ersetzen.</li>
		<li>Injizieren Sie 2 mL vorgewärmten sterilen Kochsalzlösung in die Bauchhöhle die Ratte zu rehydrieren.</li>
		<li>Schließen Sie die Muskelwand mit kontinuierlicher Faden Naht. Dann nähen Sie die kutane Schicht mit einzelnen Stichpunkt (Punkt).</li>
		<li>Spritzen Sie Meloxicam (1,5 mg/kg) subkutan als Analgetikum für 5 Tage einmal am Tag.</li>
		<li>Legen Sie die Ratte in einem Käfig auf ein Heizkissen bis zur Genesung aus der Narkose. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Empfänger Ratten.</li>
		<li>Messen Sie den Blutzucker nach der Transplantation jeden Tag. Wenn Glycemia ist &gt; 2 g/L, 6 U von langwirksamen Insulin Spritzen subkutan einmal täglich.</li>
		<li>Organfunktion durch Glycemia und c-Peptidemia Überwachung in 1 oder 2 Monaten zu beurteilen. Hinweis: Im Falle einer erfolgreichen Transplantation Glycemia sollte innerhalb von 2-5 Tagen nach der Transplantation stabilisieren, und Ratten können Insulin abgenommen werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) omentalis Graft Explantation
Hinweis: Dieses Verfahren ermöglicht die Bestätigung der guten Organfunktion. Nach der Entnahme eine funktionale Prothese sollte Ratten zu einem diabetischen Zustand zurückzukehren. Dieser Schritt wird nach 1 oder 2 Monate der metabolischen Follow-up durchgeführt.
<ol><li>Betäuben Sie die Ratte mit Gas Narkose zu und legen Sie sie in die Rückenlage.</li>
	<li>Rasieren Sie der peritonealen Raum und sterilisieren Sie mit Povidon-Jod für 3 min zu.</li>
	<li>Erstellen Sie eine 1,5 cm Laparotomie knapp Brustbein mit einem Skalpell. Nass-steriler Gaze in der eingeschnittenen Umgebung zu platzieren.</li>
	<li>Identifizieren Sie das Omentum, die neben den Magen ist. Verwenden Sie Zange zu sorgfältig auf die Gaze verbreiten.</li>
	<li>Mit einer Schere die Omentum Verbrauchssteuern. Starten Sie aus dem Teil, das auf die Bauchspeicheldrüse Rute (neben der Milz) haftet. Wenn Blutungen auftreten, verwenden Sie trockene sterilen Gaze um zu stoppen.</li>
	<li>Weiter Exzision entlang des Teils an den Magen befestigt und das Omentum abrufen. Hinweis: An dieser Stelle können Gastroepiploic Arterien (Abbildung 1) dazu führen, dass eine große Menge von Blutungen, wenn sie versehentlich geschnitten werden. Arterie Einschnitte sind unumgänglich, um das Transplantat abrufen, aber Blutungen kann mit Hilfe einer Pinzette und Gaze verwaltet werden. Wenn ein versehentliche Schnitt passiert, fest mit trockenen Gaze zu komprimieren und die Kompression für mindestens 1 min pflegen. Sollte die Blutung zu stoppen. Ist dies nicht der Fall, verwenden Sie Clips oder verwenden Sie eine elektrische Operationsmesser, um die Schiffe zu Kauterisieren.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58898/58898fig1.jpg"> Abbildung 1: Verteilung der omentalis Arterie. Für Omentum Transplantat Explantation wird der kritische Bereich, bestehend aus Gastroepiploic Arterien in blau dargestellt. Während der Resektion dieses Teils des omentalis Gewebes muss Aufmerksamkeit der richtigen Gastroepiploic Arterie Abschnitt gewidmet werden. Kompression, Ligatur oder Kauterisation kann verwendet werden, um Blutungen zu begrenzen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58898/58898fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<ol start="7"><li>Überprüfen Sie, ob eine Blutung anhält. Ist dies nicht der Fall, injizieren Sie 2 mL vorgewärmte Kochsalzlösung zu, schließen Sie die Ratte und verarbeiten Sie wie zuvor beschrieben.  Explantierten Tiere zurück zu einem diabetischen Zustand. Insulininjektion (6 U/SC/Tag) ist dann zwingend erforderlich, um das Wohlergehen der Tiere zu gewährleisten.</li>
	<li>Einschläfern der Ratte 10 bis 12 Tage nach Explantation mit einer Überdosis von Pentobarbital (182,2 mg/kg).</li>
</ol>4. histologische Analyse: Hämatoxylin und Eosin Färbung
<ol><li>Beheben Sie die abgerufenen Omenta mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) und in Paraffin einbetten.</li>
	<li>Schneiden Sie Abschnitte 4 µm Dicke aus und Hämatoxylin und Eosin Fleck für die morphologische Bewertung der Transplantation.</li>
</ol>5. statistische Analyse
<ol><li>Statistischen Signifikanz mit statistischen Analysesoftware und Messwiederholungen Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukey ehrlich Bedeutung Unterschied Test als post-hoc-Test zu bestimmen. P -Werte als dar: *p &lt; 0,05; p &lt; 0,01; p &lt; 0,001.</li>
</ol>

<ol><li>Bakhshandeh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%3B+strategies%2C+tissues%2C+and+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%26+genetic+engineering+reviews%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering; strategies, tissues, and biomaterials.</a> Biotechnology & genetic engineering reviews. 33, 144-172 (2017).</li>
<li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462, 433-441 (2009).</li>
<li>Slaughter, B. V., Khurshid, S. S., Fisher, O. Z., Khademhosseini, A., Peppas, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">Hydrogels in regenerative medicine.</a> Adv Mater. , 3307-3329 (2009).</li>
<li>Rice, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+regenerative+microenvironment+with+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+healthcare+materials%22%5BJournal%5D)">Engineering the regenerative microenvironment with biomaterials.</a> Advanced healthcare materials. 2, 57-71 (2013).</li>
<li>Bai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+hydrogels+for+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Bioactive+Materials%22%5BJournal%5D)">Bioactive hydrogels for bone regeneration.</a> Bioactive Materials. 3, 401-417 (2018).</li>
<li>Allbright, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+adipose-derived+stem+cells+in+poloxamer+hydrogel+improves+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Delivery of adipose-derived stem cells in poloxamer hydrogel improves peripheral nerve regeneration.</a> Muscle Nerve. , (2018).</li>
<li>Van Der Windt, D. J., Echeverri, G. J., Ijzermans, J. N. M., Cooper, D. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Choice+of+Anatomical+Site+for+Islet+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+transplantation%22%5BJournal%5D)">The Choice of Anatomical Site for Islet Transplantation.</a> Cell transplantation. 17, 1005-1014 (2008).</li>
<li>Zweifach, B. W., Lipowsky, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+studies+of+microcirculatory+structure+and+function.+III.+Microvascular+hemodynamics+of+cat+mesentery+and+rabbit+omentum%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative studies of microcirculatory structure and function. III. Microvascular hemodynamics of cat mesentery and rabbit omentum.</a> Circ Res. 41, 380-390 (1977).</li>
<li>Bruant-Rodier, C., Dissaux, C., Baratte, A., Francois Fiquet, C., Bodin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+breast+of+the+adolescent+girl%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Chir+Plast+Esthet%22%5BJournal%5D)">The breast of the adolescent girl.</a> Ann Chir Plast Esthet. 61, 629-639 (2016).</li>
<li>Schaschkow, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extra-Hepatic+Islet+Transplantation%3A+Validation+of+the+h-Omental+Matrix+Islet+filliNG+%28hOMING%29+Technique+on+a+Rodent+Model+Using+an+Alginate+Carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+transplantation%22%5BJournal%5D)">Extra-Hepatic Islet Transplantation: Validation of the h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING) Technique on a Rodent Model Using an Alginate Carrier.</a> Cell transplantation. 27, 1289-1293 (2018).</li>
<li>Schaschkow, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+Type+of+Continuous+Insulin+Administration+on+Metabolism+in+a+Diabetic+Rat+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+diabetes+research%22%5BJournal%5D)">Impact of the Type of Continuous Insulin Administration on Metabolism in a Diabetic Rat Model.</a> Journal of diabetes research. 2016, 8310516(2016).</li>
<li>Schaschkow, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+an+autologous+oxygenating+matrix+culture+system+on+rat+islet+transplantation+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Impact of an autologous oxygenating matrix culture system on rat islet transplantation outcome.</a> Biomaterials. 52, 180-188 (2015).</li>
<li>Kissler, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+methodologies+for+quantifying+isolated+human+islets%3A+an+Islet+Cell+Resources+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+transplantation%22%5BJournal%5D)">Validation of methodologies for quantifying isolated human islets: an Islet Cell Resources study.</a> Clinical transplantation. 24, 236-242 (2010).</li>
<li>Delaune, V., Berney, T., Lacotte, S., Toso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraportal+islet+transplantation%3A+the+impact+of+the+liver+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+international+%3A+official+journal+of+the+European+Society+for+Organ+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Intraportal islet transplantation: the impact of the liver microenvironment.</a> Transplant international : official journal of the European Society for Organ Transplantation. 30, 227-238 (2017).</li>
<li>Leitao, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+fat+accumulation+after+islet+transplantation+and+graft+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+transplantation%22%5BJournal%5D)">Liver fat accumulation after islet transplantation and graft survival.</a> Cell transplantation. 23, 1221-1227 (2014).</li>
<li>Narang, A. S., Mahato, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+biomaterial+approaches+for+improved+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+reviews%22%5BJournal%5D)">Biological and biomaterial approaches for improved islet transplantation.</a> Pharmacological reviews. 58, 194-243 (2006).</li>
<li>Alvarado-Velez, M., Pai, S. B., Bellamkonda, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+carriers+for+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as carriers for stem cell transplantation.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 61, 1474-1481 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Einige wichtige Schritte können in diesem Protokoll hervorgehoben werden. Erstens muss die Person, die Durchführung der Operation und die Gewebe zu manipulieren zart mit dem Fettgewebe sein, wie zerbrechlich ist. Zerkleinerung oder eine Beschädigung der Omentum muss vermieden werden. Omentum, wird als eine defensive Gewebe Makrophagen und andere Leukozyten angereichert. Diese Immunzellen durch übermäßige Manipulation aktiviert werden können und könnte sich negativ auf das Transplantat. Zweitens ist Transplantat (Insel-Hydrogel Mischung) laden auch kritisch. Die Person, die Durchführung des Verfahrens muss Totvolumina vermeiden und laden Sie alle das Hydrogel-Insel-Gemisch muss in der Injektionsvorrichtung. Unmittelbar nach diesem Schritt ist ein weiterer kritischer Punkt die Injektion selbst. Injektion muss langsam, sorgfältig und vorsichtig durchgeführt werden. Die Spritze muss durch die leeren Hydrogel zunächst geladen, um alle verbleibenden Inselchen abrufen gespült werden. Drittens muss Nähen sorgfältig und in zwei Schritten erfolgen. Der muskulöse Plan sollte sein vernäht zuerst kümmert sich nicht um das Omentum mit den Muskel, Naht und die Haut sollte separat vernäht. Bezüglich der Explantation-Verfahrens für die omentalis Graft sollte besondere Aufmerksamkeit im Moment genommen werden, wenn die Arterien in der Nähe des Magens (Gastroepiploic Arterien) eingeschnitten sind. Es ist wichtig, Blutungen achten, die auftreten, und beenden Sie sie vor dem Nähen des Tieres da zu tierischen Tod innerhalb einiger Tage anhaltende Blutungen führt.
Fehlersuche kann über das Medium notwendig für den Transport von kleinen Inseln; die Wahl von Hydrogel liegt der Experimentator, solange das Hydrogel injizierbare ist. Die Verwendung unterschiedlicher Materialien kann in Variablen führen Transplantat Funktion (mit oder ohne Supplementierung, zum Beispiel). Die hier beschriebene Methode hat ihre Effizienz für Co verpflanzend Inertmaterial mit einem Insel-Verhältnis von 7660 IEQ/kg nachgewiesen.
Das vorliegende Verfahren kann durch die omentalis Größe und Hydrogel Eigenschaften beschränkt werden. Um eine diabetische Nagetier Modell zu verwenden, ist Insulin-Therapie vor der Insel Implantation ausreichend Pfropfen Bereich obligatorisch. Diabetische Nagetiere verlieren viel Gewicht und Fettmasse aufgrund von STZ-induzierte Diabetes. In Anbetracht des geringen Gewichts der Tiere in diese Studie aufgenommen ist es nicht möglich, in einem noch kleineren Bereich Pfropfen.
Erhaltung der richtigen Glycemia Management (vor Transplantation mit Pellets und danach mit langwirksamen Insulin) ist obligatorisch. Hier haben wir das Insulin Pellet bis zu dem Tag der Transplantation aus mehreren Gründen zu sparen. Erstens reduziert die Wartung von einem richtigen glykämischen Kontrolle oxidativen Stress induziert durch Diabetes in den Empfänger Organen, die schädlich für Islet Transplantation11 und ermöglicht die Fortsetzung der intensiven Insulintherapie und Empfänger Vorbereitung in der Klinik12beobachtet. Zweitens wollten wir die maximale Anzahl der Anästhesieverfahren für die Ratten. Hinsichtlich der Durchführung der Insulintherapie während der metabolische Follow-up mit langwirksamen Insulin vermieden das Schema verwendet massive Komplikationen aufgrund von Glucotoxicity (die Transplantate zerstören kann) und einen "echten" Glycemia Wert zu erhalten.
Um Transplantat Effizienz zu überwachen, ist Glycemia nicht relevanten Parameter in den ersten Tagen, wenn Ratten Insulintherapie mit Pellets erhalten. Deshalb überprüfen, dass das C-Peptid-Niveau mehrmals vor Transplantation obligatorisch ist. Diese Zeiten gehören zu Beginn der Studie, Tiere nach STZ Injektion auswählen und dann nur vor Transplantation, um sicherzustellen, dass Ratten Diabetiker bleiben und Regeneration minimal ist.
Hydrogel Eigenschaften sind ebenfalls wichtig. Flüssige Hydrogel wird aus omentalis Gewebe auslaufen und hochviskosen Hydrogel werden nicht injizierbare. Hydrogel Viskosität und Injectability muss vor der Anwendung getestet werden, aber es scheint wichtig, auch das Material direkt durch Auswertung der Insel oder eine andere Zellen überleben in-vitro-test. Hier, wie Inseln sehr empfindlich gegen Hypoxie und die Verwendung von hochviskosen Träger sind können Sauerstoffdiffusion beeinflussen.
In Bezug auf die Bedeutung der Methode hier in Bezug auf bestehende Methoden beschrieben hat dieser Intra-Gewebe Transplantation Technik Vorteile in Bezug auf die Reproduzierbarkeit. Es ist auch atraumatisch für das Gewebe und wegen seiner extra vaskulären Lage vermeidet Risiken Blutung und Thrombose. Auch bei der Inselversetzung ist sofort Blut-vermittelte Entzündungsreaktion vermieden14. Darüber hinaus ermöglicht hOMING Umpflanzen Inselchen in ein nicht-lebenswichtiges Organ, im Gegensatz zu Transplantation in die Leber, die Risiken in Bezug auf die Leberfunktion15mit sich bringt.
Um optimale Leistung zu erzielen, muss ein Hydrogel Zellen angepasst werden, die es tragen wird. Einsatz von Wachstumsfaktoren oder spezifische Proteine haben eine positive Wirkung auf die transplantierten Zellen16,17.
Abschließend möchte ich sagen, kann diese Technik zur in-vivo Validierung ein Hydrogel auf verschiedenen Zelltypen, verwendet werden, vor allem, wenn eine aktive metabolische Umgebung, wie bei kleinen Inseln benötigt wird. Darüber hinaus diese Operationstechnik gilt für mehrere Anwendungen und könnte in Zukunft schnell übertragbar auf den Menschen, wie es mit Laparoskopie leicht durchgeführt werden kann.

Zelltherapie ist ein heißes Thema, da es darum geht, Krankheiten anhand der regenerativen Medizin zu heilen. Biologisches Material-gestützte Zelltherapien sind zunehmend in den letzten Jahren untersucht worden, vor allem, weil Zelle Implantation häufig einen Träger für die Übertragung der Zellen aus der Kulturschale an den Empfänger erfordert. Biomaterial Gerüste sind potentiell wertvolle Zellträger, die mehrere Rollen1erfüllen. Zuständigen Träger sollten schützen Zellen vor mechanischen Belastungen und bieten günstige Wachstumsbedingungen, wie wesentliche Wachstumsfaktoren, metabolische Abfall Ausscheidung, Austausch von Nährsubstanzen und Sauerstoff2.
Unter den verschiedenen Arten von Biomaterialien für die Zelltherapie haben Hydrogele viele Vorteile. Sie sind biokompatibel, biologisch abbaubar, einfach zu handhaben, und Sauerstoff Diffusion3erleichtern. Darüber hinaus ermöglicht Stand der Technik den Einsatz von Hydrogele, um Zellen überleben und mit z. B. Supplementierung mit Wachstumsfaktoren oder extrazellulären Matrix Proteine4weiterhin zu helfen.
Hydrogel-Träger mit Stammzellen können injiziert werden, wie Behandlungen, z. B. Knochen Regeneration5 und Nervensystem Krankheit6. Die Implantation von metabolisch aktiven Zellen ist notwendig. In-vitro-Validierung des Ansatzes ist, zwar möglich bleiben Werkzeuge und Techniken zur in-vivo Validierung um verfeinert werden.
Zelle und Hydrogel-Transplantation kann leicht durch subkutane Injektion erfolgen, wenn Biokompatibilität Tests durchgeführt werden. Bei transplantierten Zellen systemische Faktoren regulieren durch ihre metabolische Wirkung sollen, ist jedoch dieser subkutanen Lokalisierung nicht optimal, im Wesentlichen in Bezug auf die venösen Abfluss7. Daher gibt es keine aktuellen Tools, schnell, sicher und effizient die wohltuende Wirkung von einem Hydrogel zu bewerten. Am Beispiel der Inselversetzung, die erfordert, dass Hormone in den Blutstrom aus dem Transplantat als Reaktion auf den Blutzuckerspiegel freigesetzt werden, haben wir eine neue Methode zur in-vivo Zelle/Hydrogel-Implantation entwickelt.
Der erste Schritt war eine Akzeptor-Transplantation-Website identifizieren, die ein Hydrogel mit Zellen annehmen kann. Das Omentum bietet einen großen Raum für die Implantation ist sehr plastisch, und seine Dichte Vaskularisierung, kombiniert mit der intraperitonealen Einstellung ist interessant für die Untersuchung von Zellen mit hoher Stoffwechselaktivität8. Als nächstes mussten wir eine chirurgische Technik ermöglicht die Übertragung der Zellen und die Hydrogel in das Omentum zu etablieren. Inspiriert durch das Lipofilling, plastische Chirurgie9verwendet, entwickelten wir die h-omentalis Matrix-Insel (hOMING) Ansatz zu füllen. Inselchen in Hydrogel eingebettet sind im Inneren die omentalis Gewebe injiziert. Auch soll die Technik bieten maximale Engraftment durch die Verwendung mehrere Ablagerungen von der Zelle und Hydrogel-Gemisch in die omentalis Gewebe, wo die große Zahl der Blutgefäße verbessert auch die Sauerstoffversorgung der Graft.
In der vorliegenden Studie beschreiben wir eine einfache und innovative Technik für die Inselchen Implantation zwischen omentalis Laken, in das Fettgewebe am nächsten an den Blutgefäßen. Dieser besteht aus Mikro-invasive Chirurgie, die unter Laparoskopie abgeschlossen werden konnte, mit der Injektion von Inseln in einem Hydrogel in das Fettgewebe enthalten. Diese Technik ist leicht anwendbar, alle Kombinationen von Hydrogel und Zelle, die getestet werden müssen ein in eine metabolisch funktionsfähige Umgebung.

<table><tbody><tr><td>Alginat (PRONOVA UP LMV)Novamatrix</td><td></td> <td>4200206</td><td>Hydrogel-Träger</td></tr><tr><td>Atraumatische Nadel (Blunt)</td><td>B.Braun</td><td>9180109</td><td></td></tr><tr><td>CMRL ohne FBS</td><td>Gibco</td><td>11500576</td><td></td></tr><tr><td>C-Peptid ELISA Kit</td><td>Mercodia</td><td>10-1172-01</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Leica Microsystems</td><td>3801592E</td><td></td></tr><tr><td>Ethilon 4/0</td><td>Ethicon</td><td>F2414</td><td>Chirurgisches Nahtmaterial</td></tr><tr><td>Hämatoxylin</td><td>Leica Microsystems</td><td>3801562E</td><td></td></tr><tr><td>Insulinpellets</td><td>Linshin</td><td>INS-B14</td><td></td></tr><tr><td>Isofluoran</td><td>Centravet</td><td>ISO007</td><td></td></tr><tr><td>Lantus (Insulin-Glargin)</td><td>Sanofi Adventis</td><td>Lantus SoloStar</td><td>Lang wirkendes Insulin</td></tr><tr><td>Metacam</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>MET019</td><td>Entzündungshemmendes Medikament</td></tr><tr><td>NaCl (für Kochsalzlösung 0,9%)</td><td>Sigma</td><td>10112640</td><td></td></tr><tr><td>Nadel 26 G</td><td>TERUMO</td><td>050101B</td><td></td></tr><tr><td>Sauerstoff</td><td>Linde</td><td>2010152</td><td>Für Isofluran verwenden</td></tr><tr><td>Sie Natrium-Pentobarbital</td><td>Vetoquinol</td><td>Dolethal</td><td>Für die Euthanasie</td></tr><tr><td>Steranios 2%</td><td>Anios</td><td>11764046</td><td></td></tr><tr><td>Streptozotocin</td><td>Santa-Cruz</td><td>SC-200719A</td><td></td></tr><tr><td>Spritze &ndash; Injekt-F</td><td>B.Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>Trokar & Mandrin (Linshin)</td><td>Linshin</td><td>G12-SS</td><td>Zum Einsetzen von Pellets</td></tr></tbody></table>

intra-omentalis islet transplantation mittels h-omentalis matrix islet füllung (homing)

Intra-Omental Islet Transplantation Using h-Omental Matrix Islet filliNG (hOMING)

Regenerativer Medizin basierend auf Zell-Therapie stellt eine neue Hoffnung für die Heilung von Krankheiten. Aktuelle Hindernisse sind richtige in Vivo Validierung von der Wirksamkeit der Therapie. Für die Übertragung an den Empfänger Körper Zellen oft mit Biomaterialien, vor allem Hydrogele kombiniert werden müssen. Überprüfung der Wirksamkeit von solch einem Transplantat erfordert jedoch das richtige Umfeld, die richtige Hydrogel und rechts Empfängerstelle. Das Omentum möglicherweise eine solche Site. Basierend auf dem Beispiel der Inselversetzung, entwickelten wir das hOMING (h-omentalis Matrix Islet) Abfülltechnik, bestehend aus der Injektion des Transplantats innerhalb des Gewebes zwischen den omentalis Schichten Inselchen Implantation und das Überleben verbessern. Um dies zu erreichen, haben kleine Inseln in einem Hydrogel mit einer Viskosität eingebettet werden, die eine Injektion mit einer atraumatischen Nadel ermöglicht. Spritzen werden mit einer Kombination von Hydrogel und Inselchen geladen. Mehrere Injektionen erfolgen innerhalb des omentalis Gewebes an verschiedenen Einstiegspunkten und die Ablagerung von der Insel/Hydrogel-Mischung erfolgt entlang einer Linie. Wir testeten die Machbarkeit dieser innovative Ansatz mit Dextran-Perlen. Die Perlen waren die omentalis Gewebe, in unmittelbarer Nähe zu den Blutgefäßen gut verteilen. Um die Wirksamkeit des Transplantats zu testen, wir Inselchen in diabetischen Ratten verpflanzt und führen eine metabolische Follow-up über zwei Monate. Die verpflanzten kleinen Inseln stellte eine hohe Rate von Re Vaskularisierung rund um und im Inneren der Inseln und umgekehrt Diabetes. Die zielsuchende Technik könnte für andere Arten von Hydrogel oder Zelle Therapie für Zellen mit hoher Stoffwechselaktivität anwendbar.

Die hOMING-Methode erlaubt die Vermeidung der intravaskulären Implantation und der Einschluss des Inselchen in einem Organ. Eine maximale Zeit von 8-10 min ist erforderlich für die gesamte Insel Implantationsverfahren, einschließlich Anästhesie, die vergleichbar mit klassischen Lebertransplantation eine Zeitleiste.
Um die Art und Weise untersuchen die Inselchen innerhalb des omentalis Gewebes verteilt sind, wurden Dextran Perlen transplantiert das hOMING-Methode (Abbildung 2). Einen Tag nach der Implantation Ratten wurden geopfert und omentalis Gewebe für die histologische Analyse abgerufen wurden. Hämatoxylin und Eosin Färbung zeigte eine gleichmäßige Verteilung der Kugeln durch das Gewebe (Abbildung 2rechts unten). Sehr oft Perlen wurden in der Nähe von Blutgefäßen und wurden gut im Fettgewebe implantiert. Sofort nach der Implantation tritt eine entzündliche Reaktion um die Perlen, wodurch Gewebe Neuordnung, die kleinen Inseln im Gewebe zu Schachteln.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58898/58898fig2.jpg"> Abbildung 2: Beschreibung der hOMING Technik und Perle Verteilung durch das omentalis Gewebe einen Tag nach der Implantation. (A) Abbildung der hOMING-Technik. Nach der Orgel Exposition (, links) wurde die Insel-Hydrogel-Mischung (hier ersetzt durch blau gefärbten Dextran Perlen zur besseren Visualisierung) sorgfältig in das Gewebe mit einer atraumatischen Nadel (A, Mitte) injiziert. Perlen im Gewebe implantiert sind sichtbar (A, rechts). (B) Hämatoxylin und Eosin Färbung des Omentum explantiert 1 Tag nach der Injektion der Perle. Perlen sind in das Gewebe mit einer gleichmäßigen Verteilung gefunden. Maßstabsleiste = 100 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58898/58898fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Um diese Technik zu überprüfen, führten wir isogene Studien mit Lewis-Ratten (n = 8). Diabetische Ratten Inselchen Transplantationen (7660 Insel entspricht, IEQ) pro kg Körpergewicht Ratte mit hOMING empfangen wurden Glycemia und C-Peptidemia zwei Monate lang beobachtet. Glycemia wurde durch Implantation von Insulin Pellet (als Nachweis der erste Tropfen in Glycemia beobachtet in der Abbildung 3A) gesteuert. Organfunktion spiegelte sich durch Glycemia von ca. 2 g/L und C-Peptidemia &gt; 500 pM. Vor der Transplantation, Ratten waren Diabetiker (-Biologie &gt; 5 g/L und C-Peptidemia &lt; 200 pM). Nach der Transplantation und Insulin Pellet abrufen Glycemia Wartung und Normalisierung war nur 3 Tage Post-hOMING Transplantation beobachtet und bis Transplantat Abruf (p &lt; 0,05 im Vergleich zu den Niveaus Pre-transplant) beibehalten. Nach omentalis Explantation Glycemia stieg wieder auf das Niveau von vor Transplantation, bescheinigt die Funktionalität der Inseln, die durch hOMING transplantiert wurden (Abb. 3A). Das C-Peptidemia-Muster wurde genau das Gegenteil, mit niedrigen bis nicht nachweisbar Ebenen vor der Transplantation, gefolgt von einer Erhöhung und Wartung auf diesem erhöhten Niveau im Laufe der Studie (p &lt; 0,05), und nach omentalis Explantation eines Rückgang um Ebenen (Abb. 3 b) vorab zu verpflanzen. Analyse der explantierten Omentum durch Histologie ergab hoch Re vaskularisierte Inselchen, wahrscheinlich aufgrund der Nähe zu den Blutgefäßen (Abbildung 3).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58898/58898fig3.jpg"> Abbildung 3: zweimonatige metabolische Follow-up von Ratten hOMING und Transplantat Bewertung empfangen. (A) Glycemia Messung und (B) C-Peptid-Bewertung nach hOMING mit Alginat als Insel-Träger (Tx: Transplantation und Insulin Pellet Retrieval; Explantation: Explantation der das Omentum). Transplantate sind funktional, dargestellt durch die Aufrechterhaltung der Normoglycemia nach der Insulin-Pellet-Entnahme ist und in C-Peptidemia nach der Insel Implantation zu erhöhen. Grau schattierte Bereiche repräsentieren die minimalen und maximalen aufgezeichneten Werte zu jedem Zeitpunkt. (C) Hämatoxylin und Eosin Färbung eines omentalis Abschnitts nach Inselversetzung mit der hOMING-Methode. Inseln sind gut in das Gewebe integriert zwei Monate nach der Implantation ohne jede fibrotischen Gewebes. Schiffe ranken um und im Inneren der Inseln, wie durch die Pfeile dargestellt und somit völlig Inselchen Funktion wiederherzustellen. Morphologie der Inseln scheint auch gut erhaltene. Skalieren von Balken = 50 µm. (n = 8) (*p &lt; 0,05; ** p &lt; 0,01; *** p &lt; 0,001 bestimmt mit Messwiederholungen Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukey ehrlich Bedeutung Unterschied Test als post-hoc-Test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58898/58898fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur in-vivo Validierung der Hydrogel-basierte Zelltherapie, zeigt das Beispiel der Inselversetzung. h-omentalis Matrix Inselchen füllen (hOMING) Implantation ermöglicht die Implantation einer Zelle-Hydrogel-Mischung zwischen den omentalis Schichten, in der Nähe von Blutgefäßen Engraftment in eine richtige metabolische Umgebung zu maximieren.

Intra-omentalis Islet Transplantation mittels h-omentalis Matrix Islet Füllung (hOMING)

Regenerative medicine based on cell therapy represents a new hope for curing disease. Current obstacles include proper in vivo validation of the ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Zelltherapie zu beantworten, wie z. B. kann die Islettransplantation durch die hOMING-Chirurgietechnik optimiert werden? Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie einfach, schnell und abstimmbar ist und die Validierung des Biomaterials ebenfalls sehr schnell ist. Die visuelle Demonstration der Nadelplatzierung ist entscheidend, um eine ordnungsgemäße Transplantatinjektion im Omentum zu gewährleisten, da eine falsch platzierte Nadel zu einer Leckage der Islete führen kann.Um Diabetes zu induzieren, injizieren Sie 75 Milligramm pro Kilogramm Streptozotocin intraperitoneal in jede sechs Wochen alte, 150 bis 190 Gramm Lewis Empfängerratte, und überprüfen Sie den Diabetes-Status durch tägliche Blutzuckermessung für die ersten vier Tage nach der Injektion. Wenn die Ratten eine Glykämie über zwei Gramm pro Liter aufweisen, injizieren sie subkutan sechs Einheiten lang wirkendes Insulin pro Tag, um Diabeteskomplikationen und Gewichtsverlust zu verhindern. Nehmen Sie Ratten in die experimentelle Kohorte ein, wenn zwei Messungen des Blutzuckerspiegels der Schwanzvene an zwei aufeinanderfolgenden Tagen größer als vier bis fünf Gramm pro Liter sind, mit einem C-Peptidspiegel unter 200 Picomolar.Bei der Pelletimplantation, bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen im anästhesierten diabetischen Empfängertier und reinigen Sie den Hals mit Povidon Jod. Rasieren Sie den Implantationsbereich und reinigen Sie die exponierte Haut mit zusätzlichem Povidon-Jod. Nach drei Minuten sterilisieren Sie ein 1/2 Insulinpellets in einer ein bis fünf Povidon-Jodlösung und verwenden Sie einen 16 Gauge Trocar, um die exponierte Nackenhaut zu durchbohren.Verwenden Sie dann die Führung und stylet, um die Pellets einzufügen und die Öffnung mit einem einzigen Punkt zu bespannen. Reinigen Sie den Stich mit mehr Povidon Jod und lassen Sie die Ratte in einem Käfig mit Überwachung und Nahrung zu erholen, um Hypoglykämie zu vermeiden. Um die Effizienz der Pellets zu messen, messen Sie die Glykämie-Abnahme jede Woche für einen Monat nach der Implantation, einschließlich Ratten in der experimentellen Kohorte, wenn ein Maß des Schwanzvenenblut-C-Peptidspiegels unter 200 Picomolar bei einem Monat nach der Insulinpellet-Implantation gehalten wird.Für die intra-omentale Matrix-Inselfüllung zählen Sie die Anzahl der Von gesunden Spenderratten isolierten Inseln in Inseläquivalenten und bereiten Sie ein 7, 660 Inseläquivalent pro Kilogramm Empfänger in einzelnen 1,5-Milliliter-Röhren vor. Waschen Sie jedes Aliquot mit 500 Mikroliter CMRL-Medium ohne fetales Rinderserum und setzen Sie die Inselpellets in 150 Mikroliter frisch zubereiteten Alginathydrogelträger pro Rohr mit sorgfältiger Mischung vor, bevor Sie die Rohre auf Eis legen. Als nächstes laden Sie Ein-Milliliter-Spritzen mit einer atraumatischen 21-Spur-Nadel mit 150 Mikroliter leerem Alginat ohne totes Volumen, gefolgt von 150 Mikroliter Alginat plus Inselchen.Legen Sie die Spritzen auf Eis und bereiten Sie den Hals des ersten Empfängertiers vor, wie gerade gezeigt. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen Schnitt über die alte Wunde zu machen und verwenden Sie Zangen, um die Pellets zu entfernen. Schließen Sie den Stich mit einem oder zwei einzelnen Stichpunkten und legen Sie die Ratte in die Supine-Position.Sterilisieren Sie den Peritonealbereich und rasieren Sie sich. Verwenden Sie ein Skalpell, um eine 1/2 Zentimeter Laparotomie direkt unter dem Brustbein zu erstellen. Legen Sie nass sterilisierte Gaze um den Schnitt und identifizieren Sie das omentale Fettpolster neben dem Magen.Verwenden Sie Zangen, um das Fettpolster vorsichtig aus der Peritonealhöhle zu ziehen und es auf der Gaze zu verbreiten. Hydratisieren Sie das Omentalgewebe gut mit zwei Millilitern vorgewärmter, 37-Grad-Celsius steriler Salin, und durchdringen Sie das Gewebe mit kleinen gekrümmten Zangen in der einen Hand mit der anderen in die omentale Kante zwischen den Omentalschichten. Achten Sie beim Einsetzen der Nadel darauf, dass sie vor Beginn der Injektion von einer dünnen Schicht Omentalgewebe umgeben ist.Setzen Sie die Nadel vollständig ein und beginnen Sie langsam mit der Injektion des Inselpräparats, während Sie die Nadel zurückziehen, damit die injizierten Inselchen im gesamten Gewebe verteilt werden können. Während der Injektion ziehen Sie die Nadel an den Rand des Gewebes, stoppen Sie die Injektion, wenn die Nadel fast aus ist. Warten Sie dann fünf Sekunden, bevor Sie eine neue Injektion am nächsten Speicherort starten.Und weitere drei bis vier Aliquots injizieren, wie gezeigt. Wenn das gesamte Hydrogel abgegeben wurde, ziehen Sie die Nadel vorsichtig zurück, um den Verlust der injizierten Inselchen zu vermeiden, und überprüfen Sie, ob die Inselchen nicht in der Spritze am Ende der Injektion gruppiert sind. Wenn alle Inselchen geliefert wurden, hydratisieren Sie das Omentum und die Wand der Laparotomie, bevor Sie das Omentalgewebe vorsichtig in die Bauchhöhle zurückgeben.Injizieren Sie zwei Milliliter vorgewärmte sterile Saline in die Bauchhöhle, um die Ratte zu rehydrieren. Schließen Sie dann die Muskelwand mit einer durchgehenden Fadennaht und nähen Sie die Hautschicht mit einem einzigen Stichpunkt. Nach ein bis zwei Monaten metabolischer Nachbeobachtung öffnen Sie den chirurgischen Schnitt jedes Empfängers wie gezeigt, und verwenden Sie Zangen, um die Omenta vorsichtig auf salinengetränkte Gazestücke zu verteilen, die neben den Einschnitten angeordnet sind.Ausgehend von der Region, die dem Bauchspeicheldrüsenschwanz haftet, verwenden Sie eine Schere, um das Omentalgewebe zu verbrauchen und zwei Milliliter vorgewärmte Salin zu injizieren, bevor jedes Tier geschlossen wird, wie gezeigt. Fixieren Sie die abgerufene Omenta in 4%Paraformaldehyd, bevor Sie sie in Paraffin einbetten. Dann erwerben sie vier Mikrometer dicke Abschnitte des Gewebes auf einem Mikrotom und wenden Hämatoxylin und Eosinfleck für die morphologische Bewertung der Transplantationen an.Dextran-Perlen, die mit der hOMING-Methode transplantiert wurden, wie gezeigt, wurden häufig in der Nähe der Blutgefäße beobachtet und gut in das Fettgewebe implantiert. In dieser repräsentativen isogenen Studie wurde die Glykämie zunächst durch Implantation eines 1/2 Insulinpellets, wie nachgewiesen, und dann durch implantierte Inselchen kontrolliert, wie durch eine Glykämie von etwa zwei Gramm pro Liter und eine C-Peptidämie von mehr als 500 Picomolar bei den Empfängertieren nachgewiesen wurde. Darüber hinaus ergab die histologische Analyse der explantierten Omenta hochgradig rekonvaskularisierte Inselchen, wahrscheinlich aufgrund ihrer Nähe zu den Blutgefäßen.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher in Zelltherapiebereichen, um biotechnologische Zellmikroumgebungen in präklinischen Modellen zu erforschen.

intra-omental-islet-transplantation-using-h-omental-matrix-islet

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Die Transplantation von isolierten Inseln wurde vorgeschlagen, eine potenzielle Behandlungsoption für Typ-1-Diabetes sein. Hier beschreiben wir eine Methode, um kleine Inseln aus Maus Bauchspeicheldrüsen zu isolieren und verpflanzen sie in die subkapsulären Raum der Niere.

Eine Methode zur Murine Islet Isolation und subkapsulären Nierentransplantation

Dieses Video beschreibt das Protokoll für die Transplantation menschlicher Pankreasinseln in die vordere Kammer des Mausauges, um die Revaskularisation von menschlichen Inseltransplantaten in vivo zu überwachen. Es hilft auch, den Beitrag von Empfänger- und Spenderzellen zur Förderung der Verkapselung und Vaskularisierung des Transplantats zu verstehen.

Transplantation von Pankreasinseln: Eine Methode zur Implantation von Pankreasinseln in die vordere Kammer des Mausauges für die In-vivo-Bildgebung

Dieses Protokoll zeigt die Mäuseinselisolation und die Aussaat auf ein dezelluläres Gerüst. Gerüstunterstützte Inselchen wurden in das epididymale Fettpolster von Streptozotocin (STZ) -induzierten diabetischen Mäusen transplantiert. Islets überlebten an der Transplantationsstelle und umkehrten den hyperglykämischen Zustand.

Gerüstgestützte Transplantation von Inseln in der epididymalen Fettauflage von diabetischen Mäusen

Eine Methode für die omentalis Transplantation von Inseln in einer Maus wird eingeführt. Isolierte Inseln sind mit Hydrogel vermischt und das Gemisch wird in den omentalis Beutel einer diabetischen Maus gebracht. Dann, der Blutzucker wird überwacht, und Immuno-histochemische Analyse erfolgt.

Eine Methode zur Inselversetzung, Omentum in Maus

Pankreatischen inselversetzung ist eine Möglichkeit, Normoglycemia bei Diabetes Typ 1 zu erreichen. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Transplantation-Technik durch die intraportal Route weiterhin normale Blutzuckerwerte bei diabetischen Mäusen.

Intraportal Transplantation der Bauchspeicheldrüse Inselchen im Mausmodell

In diesem Protokoll wird eine Methode der murinen Islet-Isolierung und Transplantation in das inguinale subkutane weiße Fettgewebe beschrieben. Isolierte syngene murinische Inselchen werden mit einem Kellermembranhydrogel in einen murinen Empfänger transplantiert. Der Blutzuckerspiegel der Empfänger wird überwacht und die Histologieanalyse der Islettransplantate durchgeführt.

Leisten-Subkutanes weißes Adiposeengewebe (ISWAT) Transplantationsmodell von Murine-Inseln

Ziel dieses Protokolls ist es, die Dynamik des menschlichen Pankreas-Islet-Entransplantierungsprozesses und des beitragenden Wirts- und Spenderzellen kontinuierlich zu überwachen. Dies wird durch die Transplantation menschlicher Inselchen in die vordere Augenkammer (ACE) eines NOD erreicht. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-Mausempfänger gefolgt von wiederholter 2-Photonen-Bildgebung.

Längsschnitt in Vivo Bildgebung und Quantifizierung der menschlichen Pankreas-Islet-Grafting- und Beitragenden Wirtszellen in der Vorderen Augenkammer

Diese fettbedeckte Inseltransplantationsmethode eignet sich für den Nachweis von eingepfropften Inseln in der intraperitonealen Höhle. Insbesondere erfordert es nicht die Verwendung von Biobindemitteln oder Naht.

Fettbedeckte Inseltransplantation mit Nebenhoden-weißem Fettgewebe

Hier stellen wir verfeinerte chirurgische Verfahren zur erfolgreichen Durchführung der intraportalen Inseltransplantation, einem klinisch relevanten, aber technisch anspruchsvollen chirurgischen Eingriff, bei Mäusen vor.

Minimierung der Venenblutung nach der Infusion während der intrahepatischen Inseltransplantation bei Mäusen

Wir bieten ein minimalinvasives Protokoll für die intramuskuläre Transplantation von von humanen Stammzellen abgeleiteten Pankreas-Stammzellinseln in immundefiziente Mäuse für die In-vivo-Implantation und nachgelagerte Analyse.

Intramuskuläre Transplantation von humanen pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten endokrinen Zellen der Pankreasbildung bei Mäusen

Lernen Sie die hOMING-Technik zur Intra-omentalen Islet-Transplantation mit Hydrogel-Matrix kennen. Diese Methode optimiert die Engraftment-Effizienz und ermöglicht schnelle Biomaterialvalidierung bei Rattenmodellen.

Intra-omentalis Islet Transplantation mittels h-omentalis Matrix Islet Füllung (hOMING)

Weitere Videos entdecken