Name: Gestaltung von porösem Silizium Filme als Träger von Nerve Growth Factor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Lernen Sie die Herstellung poröser Silizium-Filme als Träger für Nerve Growth Factor. Diese Methode ermöglicht eine kontrollierte Freisetzung von NGF zur Förderung neuronaler Differenzierung und Regeneration.

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MS und ES bestätigen die Kernleistungen und Unterstützung vom LKW I. Lokey Zentrum für Life Science und Engineering und die finanzielle Unterstützung des Instituts Russell Berrie Nanotechnologie am Technion.

Alle Methoden sind durch die Ethik-Ausschuss der Bar Ilan Universität genehmigt worden.
1. Herstellung von oxidierten PSi (beteiligte2) Träger
<ol><li>Schneiden Sie einen Si-Wafer (einseitig polierte auf &lt; 100 &gt; Gesicht und stark Bor-dotierte, p-schaltend, 0,95 mΩ·cm) in 1,5 cm × 1,5 cm Muster mit einem Stift diamantbestückte.</li>
	<li>Die Si-Proben in einem Rohrofen bei 400 ° C für 2 Stunden in der Luft oxidieren (Heizung Rate: 25 ° C/min, natürliche Kühlung).</li>
	<li>Tauchen Sie die Si-Proben in einer Lösung von wässrige Flusssäure (HF) (48 %), DdH2O und Ethanol (99,9 %) (1:1:3 V/V/V) für 5 min; dann abspülen der Proben mit Ethanol dreimal und Trocknen unter einer Stickstoff-Stream. Hinweis: Vorbereiten und HF-Lösung in Plastikware nur, wie HF löst sich Glas zu speichern. Achtung: HF ist eine stark ätzende Flüssigkeit, und es sollte mit äußerster Sorgfalt behandelt werden. Im Falle einer Exposition gründlich mit Wasser abspülen und den betroffenen Bereich mit HF Gegenmittel Gel zu behandeln; Suchen Sie sofort medizinische Versorgung.</li>
	<li>Montieren Sie die Si Probe in einer Polytetrafluorethylen-Ätzen-Zelle mit einem Streifen aus Aluminiumfolie als ein Rücken-Kontakt und eine Platin Spule als Gegenelektrode.</li>
	<li>Etch Opferschicht in einer 3:1 (V/V) Lösung von wässrigen HF und Ethanol (99,9 %) für 30 s bei einer konstanten Stromdichte von 250 mA/cm2; dann spülen Sie die Oberfläche des daraus resultierenden PSi film mit Ethanol dreimal und trocken unter einer Stickstoff-Stream.</li>
	<li>Die frisch geätzt poröse Schicht in einer wässrigen NaOH-Lösung (0,1 M) für 2 min auflösen. Dann mit Ethanol dreimal spülen und Trocknen unter einer Stickstoff-Stream.</li>
	<li>Eintauchen der Probe in einer Lösung von wässrigen HF (48 %), DdH2O und Ethanol (99,9 %) (1:1:3 V/V) 2 min. lang. Dann mit Ethanol dreimal spülen und Trocknen unter einer Stickstoff-Stream.</li>
	<li>Elektrochemisch Ätzen die Si-Probe in einer 3:1 (V/V) Lösung von wässrigen HF und Ethanol (99,9 %) für 20 s bei einer konstanten Stromdichte von 250 mA/cm2; dann spülen Sie die Oberfläche des daraus resultierenden PSi film mit Ethanol dreimal und trocken unter einer Stickstoff-Stream.</li>
	<li>Thermisch oxidieren die frisch geätzt PSi Proben in einem Rohrofen bei 800 ° C für 1 h in der Luft (Heizung Rate: 25 ° C/min, natürliche Kühlung) zu einem porösen SiO2 (beteiligte2) Gerüst bilden.</li>
	<li>Spin-Mantel orientierter2 Proben mit einer positiven dicken Fotolack bei 4.000 u/min für 1 min; dann die beschichteten Proben bei 90 ° C für 2 min backen (Heizung Rate: 5 ° C/min, natürliche Kühlung).</li>
	<li>Würfeln Sie die beteiligte2 Proben in 8 mm × 8 mm Proben mit einer Würfeln.</li>
	<li>Um den Fotolack entfernen, Einweichen Sie die gewürfelten Proben in Aceton für 3 h; dann gründlich mit Ethanol spülen und Trocknen unter einer Stickstoff-Stream.</li>
</ol>2. Laden beteiligte2 mit NGF
<ol><li>Zur Vorbereitung der NGF laden Lösung lösen Sie 20 µg der murinen β-NGF in 400 µL 1:1 (V/V) Lösung von 0,01 M Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und DdH2O auf.</li>
	<li>52 µL der Laden-Lösung auf die beteiligte2 Probe hinzufügen und 2 h bei RT in einer verschlossenen Schüssel inkubieren. Hinweis: Hohe Luftfeuchtigkeit in der Schale zu verhindern Austrocknung der Lösung während der Inkubation.</li>
	<li>Sammeln Sie die Lösung auf der Oberseite der Probe für die anschließenden Quantifizierung der NGF Inhalt innerhalb der Beteiligte2 Träger. Hinweis: Das Protokoll kann nicht hier angehalten werden, wegen der Gefahr der Trocknung und Denaturierung des Proteins, NGF laden in orientierter2 sollte unmittelbar vor der beabsichtigten Verwendung durchgeführt werden.</li>
</ol>3. Quantifizierung der NGF Verladung von NGF ELISA
<ol><li>Zur Vorbereitung der ELISA-Platte fügen Sie 100 µL 0,5 µg/mL Capture Antikörper (Kaninchen Anti-Hβ-NGF) jeweils gut, die Dichtplatte und Inkubation über Nacht bei RT hinzu</li>
	<li>Aspirieren Sie die Brunnen um Flüssigkeit zu entfernen und waschen Sie die Platte viermal mit 300 µL Waschpuffer (0,05 % Tween 20 in PBS) pro Bohrloch; invertieren Sie nach der letzten Wäsche die Platte, um verbleibende Puffer zu entfernen und auf einem Papiertuch Tupfen.</li>
	<li>Jedes gut 300 µL Blockpuffer (1 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS) hinzufügen und mindestens 1 h bei RT inkubieren Dann abzusaugen und Waschen der Plattenrandes viermal, wie in Schritt 3.2 beschrieben.</li>
	<li>Zur Vorbereitung einer Kalibrationskurve NGF laden Lösung verdünnen (siehe Punkt 2.1) im Verdünnungsmittel (0,05 % Tween-20, 0,1 % BSA mit PBS-Puffer) bis 1 ng/mL. Führen Sie dann 2-fold serielle Verdünnungen von 1 ng/mL auf Null, um die Kalibrierung Kurve Proben zu erhalten.</li>
	<li>Zur Vorbereitung der Proben verdünnen Sie NGF laden Lösung (aus Schritt 2.1) und die gesammelten Post-laden-Lösung (aus Schritt 2.3) in Verdünnungsmittel 1: 100.000 und 1: 10.000 bzw., um die Konzentrationen Reichweite von ELISA-Kit im Einsatz (16-1.000 Pg/mL).</li>
	<li>Hinzufügen von 100 µL der verdünnten Proben und Kalibrierung Kurve Proben jeweils gut in dreifacher Ausfertigung und 2 h bei RT inkubieren; dann abzusaugen und Waschen der Plattenrandes viermal, wie in Schritt 3.2 beschrieben.</li>
	<li>Jedes gut 100 µL 1 µg/mL Detektionsantikörper (biotinylierte Kaninchen Anti-Hβ-NGF) hinzu und 2 h bei RT inkubieren. Dann abzusaugen und Waschen der Plattenrandes viermal, wie in Schritt 3.2 beschrieben.</li>
	<li>Avidin-Meerrettich Peroxidase (HRP) 1:2,000 im Verdünnungsmittel verdünnen, 100 µL pro Bohrloch hinzufügen und 30 min bei RT inkubieren Jetzt aspirieren Sie und waschen Sie die Platte viermal wie in Schritt 3.2 beschrieben.</li>
	<li>Jedes gut fügen Sie 100 µL Substratlösung hinzu und inkubieren Sie 25 min bei RT auf die Farbentwicklung. Messen Sie die Absorption bei 405 nm Wellenlänge Korrektur eingestellt bei 650 nm mit einer Mikrotestplatte Reader.</li>
	<li>NGF-Konzentration in der Laden-Lösung und die gesammelten Post-laden-Lösung anhand der Eichkurve zu bestimmen.</li>
	<li>Zum Berechnen der NGF Masse innerhalb orientierter2 Träger geladen subtrahieren Sie NGF Masse in der gesammelten Post-laden-Lösung aus der NGF Masse beim Laden der Lösung. NGF laden Wirksamkeit wird durch die folgende Gleichung berechnet: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58982/58982eq1.jpg">
</li>
</ol>4. in-vitro- NGF Haftentlassung beteiligte2
<ol><li>Inkubieren Sie die NGF geladen orientierter2 Träger in 2 mL 0,01 M PBS mit 1 % (w/V) BSA und 0,02 % (w/V) Natriumazid bei 37 ° C und unter orbital Agitation von 100 u/min.</li>
	<li>Sammeln Sie alle 2 Tage die Lösung und ersetzen Sie es mit 2 mL frische PBS. Die gesammelten Release-Samples in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-20 ° C für weitere Analysen zu speichern.</li>
	<li>Verwenden Sie die im Handel erhältlichen NGF ELISA-Assay NGF Inhalte in die Release-Samples wie in 3.1-3.9 beschrieben zu quantifizieren. Hinweis: Wenn Sie die Release-Samples für ELISA Quantifizierung vorbereiten, sollte verschiedene Verdünnungen zu verschiedenen Zeitpunkten entlang der Release-Zeit (d. h., frühere Zeit, die Punkte viel mehr als späteren Zeitpunkten verdünnt werden sollte) durchgeführt werden. Darüber hinaus für jede Veröffentlichung Probe sollten mindestens zwei verschiedenen Verdünnungen durchgeführt und dafür erreichen die Konzentrationen verschiedener ELISA-Kit quantifiziert.</li>
	<li>Bestimmen Sie NGF-Konzentration in der Release-Samples anhand der Eichkurve und zeichnen Sie ein Diagramm der kumulative NGF Veröffentlichung im Laufe der Zeit.</li>
</ol>(5) Quantifizierung der in-vitro- Si Erosion durch induktiv gekoppelten Plasma Atomic Emission-Spektroskopie (ICP-AES)
<ol><li>Verdünnen Sie 1 mL der Freigabe Proben 01:10 in Release Puffer (0,01 M PBS mit 1 % (w/V) BSA und 0,02 % (w/V) Natriumazid) für ein Gesamtvolumen von 10 mL.</li>
	<li>Si atomic Emission Peaks bei 212,4, 251.6 und 288.2 nm für die verdünnten Proben zu überwachen.</li>
	<li>Si-Konzentration in den Proben anhand einer Kalibrationskurve zu bestimmen.</li>
	<li>Um die Si-Abbau-Profil zu erstellen, drücken Sie Si-Gehalt zu jedem Zeitpunkt als prozentualer Anteil der gesamten Si-Gehalt der Träger (d. h. der kumulativen Si-Gehalt entlang der Freigabedauer). Hinweis: Um genaue Quantifizierung der gesamten Si-Gehalt der Träger zu gewährleisten, sind Release-Samples Stichprobe 1 Monat nach der Endpunkt der Freisetzung zu studieren und auf Si-Konzentration mit ICP-AES analysiert. Zusammenfassung der kumulativen Si-Gehalt entlang der Freigabedauer und der Si-Gehalt in der Post-Release-Samples stellt 100 % der Si-Gehalt.</li>
</ol>6. Zelle Rentabilität und Wachstum in Anwesenheit von NGF geladen orientierter2 Träger
<ol><li>
Ratte Phäochromozytom (PC12) Zellkultur
	<ol>
<li>Bereiten Sie das grundlegende Wachstumsmedium durch Zugabe von 10 % Pferd Serum (HS), 5 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % L-Glutamin, 1 % Penicillin-Streptomycin und 0,2 % Amphotericin Roselle Park medizinische Institute (RPMI) Medium.</li>
		<li>Bereiten Sie Differenzierung Medium durch Zugabe von 1 % HS, 1 % L-Glutamin, 1 % Penicillin-Streptomycin und 0,2 % Amphotericin RPMI Medium.</li>
		<li>Wachsen Sie Zellsuspension (106 Zellen) in eine 75 cm2 Kultur Flasche mit 10 mL der grundlegenden Wachstumsmedium für 8 Tage; alle 2 Tage hinzugeben 10 mL grundlegende Wachstumsmedium in den Kolben.</li>
		<li>Um differenzierte PC12 Zellkultur zu generieren, übertragen Sie die Zellsuspension auf einem Zentrifugenröhrchen; Zentrifugieren Sie Zellen für 8 min bei 200 X g und RT. Entsorgen des Überstands.</li>
		<li>Die Zellen in 5 mL frisches grundlegende Wachstumsmedium aussetzen und erneut Zentrifugieren der Zellen für 5 min bei 200 X g und RT; den Überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 3 mL grundlegende Wachstumsmedium.</li>
		<li>Separate Zellcluster aspirieren Sie die Zellen, die zehnmal mit einer 23 G Spritze.</li>
		<li>Zählen der Zellen unter Verwendung eines Hemocytometer Zelle Zählers und Samen 104 Zellen/cm2 Arbeitsbereich auf Kollagen Typ l beschichtete Platten in Anwesenheit von Differenzierung Medium.</li>
		<li>Fügen Sie nach 24 Stunden frisch murinen β-NGF (50 ng/mL) oder NGF geladen PSiO2 Träger pro Platte hinzu. Hinweis: Höhere NGF-Konzentrationen (&gt; 50 ng/mL) besitzen genaue die Wirkung wie der angegebenen Konzentration.</li>
		<li>Erneuern Sie die Differenzierung Medium alle 2 Tage.</li>
		<li>Zu evaluieren Zellviabilität, fügen Sie 10 % (V/V) von der Lebensfähigkeit Indikatorlösung (Resazurin-basiert) zu repräsentativen Zeitpunkten und 5 h bei 37 ° C inkubieren; Messung der Extinktion bei 490 nm mit einem Spektralphotometer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mäuse Dorsal Root Ganglien (DRG) Zellkultur
	<ol>
<li>DRGs aus zwei 7 Wochen alten C57bl Mäusen isolieren, zuerst begießen die Mäuse mit 70 % Ethanol und einen Einschnitt in die Haut zu entfernen.</li>
		<li>Schneiden Sie die Basis des Schädels und die Muskeln der Bauchwand, bis das Rückenmark ausgesetzt ist.</li>
		<li>Entfernen Sie der Wirbelsäule zu, indem man einen Schnitt auf der Ebene der Oberschenkelknochen und reinigen Sie das umliegende Gewebe zu.</li>
		<li>Schneiden Sie die Spalte in drei Stücke; dann geschnitten Sie jedes Stück in der Mittellinie, schälen, das Rückenmark und erzeugen zwei Hälften.</li>
		<li>Unter dem Binokular extrahieren alle DRG Ganglien und tauche sie ein in eine kalte Hank ausgeglichene Salzlösung (HBSS).</li>
		<li>Reinigen Sie das umgebende Bindegewebe Sehnen der DRGs auf eine Petrischale und entfernen Sie vorsichtig die restliche Hirnhaut unter dem Binokular.</li>
		<li>Distanzieren Sie die DRG-Zellen durch Inkubation sie für 20 min in 1.000 U von Papain.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zellen für 4 min bei 400 X g. Verwerfen Sie den Überstand und halten Sie die Zelle Pellet.</li>
		<li>Aufschwemmen Sie das Pellet in einer 10 mg/mL Kollagenase und 12 mg/mL-Dispase-II-Lösung und 20 min bei 37 ° c inkubieren</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Zellen für 2 min bei 400 X g; verwerfen Sie den Überstand und halten Sie die Zelle Pellet.</li>
		<li>Genannte Zelle Pellet in 1 mL HBSS, Glukose 10 mM und 5 mM HEPES (pH 7,35) durch wiederholte Passage durch einen verengten Pasteurpipette.</li>
		<li>Fügen Sie die dissoziierten Zellen sanft L-15 Medium mit 20 % der Silica-basierten kolloidales Medium für Zellseparation durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung hinzu; Zentrifuge für 8 min bei 1.000 X g. Aspirieren Sie überstand und halten Sie die Zelle Pellet. Hinweis: Das Ziel dieses Schrittes ist, zu trennen und zu reinigen, die Nervenzellen vor axonalen Trümmer, Schwann-Zellen und Fibroblasten.</li>
		<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 2 mL f-12 Medium; Zentrifuge für 2 min bei 1.000 x g; den Überstand verwerfen und erneut das Pellet in 1 mL f-12 Medium.</li>
		<li>Zählen der Zellen und 2 × 104 Samenzellen auf Poly-L-Lysin und Laminin beschichtet unten 35 mm Kultur Glasschalen, in einem f-12 antibiotikafreien Medium ergänzt mit 10 % FBS. Hinweis: Saatgut zunächst die Zellen in einem kleinen Volumen des Mediums (150-200 µL); Fügen Sie nach 2 h Inkubation bei 37 ° C Medium, einem Endvolumen von 2 mL.</li>
		<li>Fügen Sie sanft die NGF geladen orientierter2 Träger oder frische murinen β-NGF (50 ng/mL) pro Platte.</li>
		<li>Beheben Sie nach 2 Tagen die Zellkultur von mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) Lösung für 15 min bei RT Inkubation; Immunostain der Zellkultur mit einem gemeinsamen Immunfluoreszenz Färbung Verfahren31.</li>
		<li>Bild der neuronalen Zellkulturen mit einem konfokalen Mikroskop.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(7) Zellanalyse Differenzierung
<ol><li>
PC12 Zellen Differenzierung Prozentsatz im Beisein von NGF geladen orientierter2 Träger
	<ol>
<li>Inkubieren Sie die NGF geladen orientierter2 Träger in 2 mL Differenzierung Medium in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2.</li>
		<li>Alle 2 Tage, sammeln Sie die Lösung zu und ersetzen Sie es mit 2 mL frisches Medium. Die gesammelten Release-Samples in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-20 ° C für weitere Analysen zu speichern.</li>
		<li>Samen PC12 Zellen in 12-Well Kollagen-beschichteten Platten wie in Abschnitt 4.1 (4.1.3-4.1.6).</li>
		<li>Nach 24 h vorstellen der Release-Samples von repräsentativen Zeitpunkten (von Abschnitt 5.1.2) zu den verschiedenen Brunnen; Fügen Sie für Kontroll-Vertiefungen frische murinen β-NGF (50 ng/mL).</li>
		<li>Nach 24 h Bild, die Zellen mit einem Lichtmikroskop.</li>
		<li>Um den Prozentsatz der Neurit tragenden Zellen bestimmen, manuell zählen Zellen, die Neuriten aus der Gesamtzahl der Zellen in die Bilder zu klein geworden war (n = 5 Frames für jedes gut); Zeichnen Sie ein Diagramm der Anteil an PC12 Zellen mit Neuriten Auswuchs im Laufe der Zeit. Hinweis: Undifferenzierte PC12 Zellen schien Struktur ohne Neuriten, gerundet haben, während die differenzierte Zellen durch Auswuchs von Neuriten (mindestens eine Mindestlänge gleich der Zelle Soma Durchmesser) oder morphologische Veränderungen identifiziert werden können.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Morphometrische Analyse von differenzierten PC12 Zellen
	<ol>
<li>Erwerben Sie für Verarbeitung Bildanalyse Phasenbilder von kultivierten Zellen bis zu 3 Tage nach der Behandlung mit NGF (als freie Reagenz oder das Freigabe-Produkt der NGF geladen orientierter2 Träger). Hinweis: Zu späteren Zeitpunkten (abgesehen von Tag 5) entwickeln die Zellen hochkomplexe Netzwerke, morphometrische Messungen an einer einzelnen Zelle Auflösung zu verhindern.</li>
		<li>Download Bildbearbeitungsprogramm NeuronJ, eine ImageJ-Plug-in ermöglicht eine halbautomatische Neuriten Ablaufverfolgung und Längenmessung.</li>
		<li>Konvertieren Sie die Image-Datei in ein 8-Bit-Format und Maßnahme Pixel Mikrometer-Verhältnis mit dem Bild Skala Bar.</li>
		<li>Legen Sie den Maßstab mit Analyze | Befehl Set Varia und Messen Sie die Länge der einzelnen Neuriten.</li>
		<li>Manuell zählen Sie die Anzahl der Verzweigungen Punkte und die Anzahl der Neuriten aus jeder Zelle Soma. Hinweis: Eine durchschnittliche Neuriten Länge beträgt 1 Tag nach der NGF Behandlung ca. 30 µm. Die gemessenen Neuriten Längen können weit verbreitet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Abbaubare nanostrukturierten orientierter2 Filme sind hergestellt und als Träger für NGF, so dass für seine kontinuierliche und verlängerte Freigabe, seine biologischen Aktivität unter Beibehaltung eingesetzt. In Vitro demonstriert das Potenzial der Beteiligte2 , dienen als ein Fördersystem für NGF ist durch den Nachweis ihrer Fähigkeit zur Freigabe ausreichend NGF Dosierung induzieren neuronale Differenzierung und Förderung Auswuchs der PC12 Zellen und DRG-Neuronen. Die entwickelten Filme dient als langfristige Stauseen von NGF für zukünftige Behandlung in Vivo.
Die strukturellen Eigenschaften der gefertigten PSi Filme wurden speziell für NGF Nutzlast zugeschnitten; die Stromdichte von der elektrochemischen Ätzvorgang wurde angepasst, um Porengröße ca. 40 erhalten nm, die leicht, wenn der NGF, ein Protein mit einer Molecular weight von 26,5 kDa32 und einen charakteristischen Durchmesser von ~ 4 nm33 berücksichtigen würde, innerhalb der poröse Matrix. Darüber hinaus wurde thermische Oxidation des porösen Gerüstes durchgeführt, um physikalische Adsorption von NGF ermöglichen durch elektrostatische Anziehung des positiv geladenen Proteins, die negativ geladenen oxidierte PSi-Oberfläche. Die Oberflächenchemie der PSi übt einen großen Einfluss auf die Wirksamkeit laden und kann leicht eingestellt werden, um die Wechselwirkungen zwischen der Nutzlast und der poröse Matrix besser kontrollieren. Diese Wechselwirkungen bestimmen anschließend die Struktur der adsorbierten Protein-Moleküle und deren Bioaktivität34,35,36. Abschließend wurde das System angepasst, um optimale Beladung von NGF zu erhalten durch eine sorgfältige Auswahl der geeignete Porengröße, Oberflächeneigenschaften und der ideale laden Lösungsmittel und der daraus resultierende Effekt der genannten Parameter diktiert das Protein-laden Wirksamkeit. Daher Änderungen in der Fertigung-Parameter (z.B., Stromdichte, Radierung Zeit, Art und Konzentration der Dotierstoff oder Elektrolyt), Oberflächenchemie oder laden Lösung Zusammensetzung beeinflussen kann, die Belastung Wirksamkeit und Bioaktivität von der geladene Protein.
Die Freisetzungsrate eine Nutzlast von PSi OrPSiO2Host ist in der Regel durch eine Kombination von zwei gleichzeitigen Mechanismen, out Diffusion von der Nutzlast-Molekülen und den Abbau der Si Gerüst37diktiert. Die Erosion und anschließende Auflösungsgeschwindigkeit sind Implantationsort, der Pathologie und Krankheit Staat28,38,39betroffen. In früheren Arbeiten wurde festgestellt, dass wenn eine unterschiedliche Freisetzungsrate für eine bestimmte therapeutische Anwendung erforderlich ist, kann das Freisetzungsprofil geändert und verlängert durch Ändern der Oberflächenchemie der PSi Oberfläche38,40, 41. Verschiedene chemische Modifikationen, wie thermische Oxidation, thermische Karbonisierung und Hydrosilylierung Techniken haben gezeigt, dass die PSi-Oberfläche zu stabilisieren und beeinflussen seine Degradierung und daraus resultierende Nutzlast Freigabe35,42 ,43,44,45. Darüber hinaus sollten Laden der NGF in den Trägern durch kovalente Bindung die Proteinmoleküle an Si Gerüst über verschiedene Wege der Oberflächenchemie in einer längeren Version führen, da die Nutzlast nur freigegeben wird, wenn die kovalente Bindungen gebrochen sind oder die Unterstützung von Si-Matrix ist abgebaut,21.
Darüber hinaus kann im Anschluss an den Fertigungsprozess PSi gerendert werden in verschiedenen Konfigurationen neben Dünnfilme, z. B. Mikropartikel46, Nanopartikel47 oder freistehende Membranen26, die auch als Träger eingesetzt werden können NGF und erfüllen spezifische Anwendungsanforderungen.
Um klinisch relevant zu sein, sollte der NGF Inhalt innerhalb der Beteiligte2 Träger die Reichweite von therapeutischen Dosen. In der im Protokoll beschriebenen Methode die NGF geladen orientierter2 Träger in eine einheitliche Lautstärke von 2 mL der Zelle Medien eingebracht werden oder PBS-Puffer und damit die Konzentration der Laden-Lösung und die jeweiligen NGF Masse geladen wurden angepasst, um die Ausbeute eines NGF-Konzentration, die relevant für das getestete in-Vitro -System veröffentlicht. Bei der Verwendung dieser Methode für verschiedene Systeme, wie z. B. Ex Vivo oder in-Vivo -Umgebungen, sollte die Konzentration der NGF laden Lösung erhöht und die benötigte Dosis angepasst. Alternativ kann höhere NGF Inhalt durch die Einführung mehrerer Träger pro geprüften Bereich oder über größere Flächen orientierter2 Proben einzuholen.
Darüber hinaus ist darauf hinzuweisen, dass in späteren Zeitpunkten entlang der Freigabedauer, die freigegebenen NGF-Konzentrationen deutlich niedriger als bei früheren Zeitpunkten sind. Die Tatsache, dass der NGF-Fluss im Laufe der Zeit nicht konstant ist muss berücksichtigt werden, wenn das System nach Anwendung Bedürfnissen entwerfen.
Zahlreiche NGF Lieferung Systeme wurden entwickelt und beschrieben, die meisten von ihnen sind Polymer-basierten Systemen, bestehend aus synthetischen oder natürlichen Polymeren Konjugate10,11,12,15 , 16 , 17. diese Systeme haben gezeigt, wirksam verzögerter Freisetzung Profile jedoch die Freigabedauer erstreckte sich über einen Zeitraum von mehreren Tagen mit einem erheblichen Burst-Effekt. Einige dieser Lieferung Plattformen leiden unter kritischen Einschränkungen z. B. Verlust der Bioaktivität auf die Kapselung Prozess, der Nutzung der verschiedenen stabilisierenden Agenten18,48, sowie anspruchsvolle und komplexe Fertigung-Techniken-16. Eine der größten Herausforderungen bei der Entwicklung von Trägersystemen für Proteine ist die Fähigkeit, die Bioaktivität der Moleküle bei Einschluss in die Carrier-System zu erhalten. Proteine oder Peptide können geladen werden in PSi/beteiligte2 bei RT oder auch bei niedrigeren Temperaturen ohne starke organische Lösungsmitteln, die beide wichtigen Faktoren sind, wenn diese empfindlichen Biomoleküle zu laden. Frühere Studien haben gezeigt, dass PSi/beteiligte2 Oberflächenchemie eine entscheidende Rolle spielt bei der Minimierung von möglichen Denaturierung von den geladenen Proteine35,36. PSi/beteiligte2 ist daher, insbesondere eine vorteilhafte Nanomaterialien für die Entwicklung von Trägersystemen für Wachstumsfaktoren im allgemeinen und NGF.
Die derzeitige Arbeit konzentriert sich auf die Verwendung dieser Methode als einen neuen therapeutischen Ansatz für die direkte Verwaltung der NGF in das ZNS für potenzielle Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen. Die NGF geladen orientierter2 Träger in den Gehirnen der Mäuse implantiert werden können und die Wirksamkeit der Plattform als langfristige Implantate ist studierte in Vivo. Darüber hinaus kann Kombination von diesen vielversprechenden Träger mit nicht-invasiven Biolistics49,50 die NGF geladen orientierter2 Partikel in eine hohe räumliche Auflösung zu einem lokalisierten Bereich mit einem pneumatischen Roman verwalten ermöglichen Kapillare Waffe zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, denen eine räumlich-zeitliche Medikamentengabe erforderlich ist. Darüber hinaus kann NGF neuronale Wachstum in einem chemischen Gradienten Weise51, ähnlich wie Axon Guidance Moleküle leiten. Somit können die geladene beteiligte2 Träger als Lockstoff-Hot-Spots zu NGF, Wachstum, ergänzend zu anderen Regie Cues52,53direkt dienen. Darüber hinaus können beteiligte2Träger speziell zugeschnitten werden, um die Lieferung von NGF für eine viel verlängert Frist von bis zu mehreren Monaten aufrecht zu erhalten, durch weitere tuning-orientierter2 Nanostruktur und ihrer Oberflächenchemie.

NGF ist essentiell für die Entwicklung und Wartung von Neuronen im peripheren Nervensystem (PNS)1 und spielt eine entscheidende Rolle in das Überleben und die Funktion der basalen Vorderhirn cholinerge Neuronen im zentralen Nervensystem (ZNS)2. Seine pharmakologische hohe Potenzial für die Behandlung von zentralen Neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson, wurde allgemein mit klinischen Studien derzeit im Fortschritt3,4,5nachgewiesen, 6. Die größte Herausforderung bei der Bereitstellung von NGF an die CNS wohnt in seiner Unfähigkeit, die Blut-Hirn-Schranke (BBB), wenn Sie systemisch verabreicht7. Darüber hinaus NGF Anfälligkeit für schnelle enzymatische Abbau macht seiner kurze Halbwertszeit und deutlich begrenzt seine therapeutische Verwendung8,9. Daher ist eine unbefriedigte Herausforderung, Delivery-Systeme zu entwerfen, die für eine längere und kontrollierte Freisetzung von NGF auf sichere Weise zu ermöglichen. Verschiedenen NGF-Delivery-Systeme, einschließlich der Polymer-basierten Systemen wurden studierte10,11,12,13,14,15, 16 , 17. die Veröffentlichung Profile dieser Systeme zeichneten sich oft durch eine ausgeprägte ersten Ausbruch folgte durch eine langsame kontinuierliche Freisetzung, wo in der zweiten Stufe die Freisetzungsrate erheblich geringer im Vergleich zu den ersten Ausbruch11 ,18,19. Darüber hinaus wurden die Inaktivierung des Proteins durch die sauren Abbauprodukte der Polymere (z.B., poly(lactic-co-glycolic) Säure) oder Verlust der NGF Bioaktivität bei der Kapselung mit dieser Systeme20beobachtet.
Nanostructured PSi zeichnet sich durch mehrere ansprechende Eigenschaften, wie hohe Fläche, poröse großvolumige, Biokompatibilität und abstimmbaren Abbaubarkeit in Körperflüssigkeiten, für eine viel versprechende Medikamente Lieferung Plattform21wachsenden, 22,23,24,25,26,27,28. Richtige Auswahl der Anodisierung Bedingungen kann mühelos die PSi strukturellen Eigenschaften (z.B., Porosität und Pore Größe) für Schneiderei Medikament be- und Freigabe Kinetik21,27einstellen. Darüber hinaus erlauben bequeme chemische Wanderrouten, ändern Sie die Oberfläche des PSi und damit weiter optimieren die Auflösegeschwindigkeit Si Gerüst unter physiologischen Bedingungen und die Freisetzungsraten der Droge22,24, 29,30.
Diese Arbeit konzentriert sich auf eine PSi-basiertes Liefersystem für längere kontrollierte Freisetzung von NGF zu entwerfen. Die Wirkung der NGF-PSi Träger auf neuronale Differenzierung und Auswuchs wird mit PC12 Zellen untersucht und DRG-Neuronen zu trennen. Wir zeigen, dass die geladenen NGF die Bioaktivität bewahrt hat, durch Induktion Neuriten Auswuchs und Tiefe Differenzierung über einen 1-Monats-Zeitraum innerhalb einer einzigen Verwaltung.

<table><tbody><tr><td>Aceton</td><td>Gadot</td><td>830101375</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin</td><td>Biological Industries</td><td>03-028-1B</td><td></td></tr><tr><td>Wässriges HF (48%)</td><td>Merck</td><td>101513</td><td></td></tr><tr><td>AZ4533 Fotolack</td><td>Metal Chem, Inc.</td><td>AZ4533</td><td></td></tr><tr><td>BSA-Fraktion v</td><td>MP biomedizinische</td><td>0216006950 BSA-Lösung</td><td></td></tr><tr><td>(10%)</td><td>Biological Industries</td><td>03-010-1B</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen Typ l</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td>354236</tr><tr><td>Collagenase</td><td>Enco</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenbeschichtete Kunststoff-Deckgläser</td><td>NUNC Thermanox</td><td>1059846</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukose</td><td>Sigma-Aldrich Chemicals</td><td>G8170</td><td></td></tr><tr><td>Dispase-II</td><td>Sigma-Aldrich Chemicals</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti Maus IgG H& L-konjugiertes Alexa Fluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab150073</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolut (99,9 %)</td><td>Merck</td><td>818760</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biological Industries</td><td>04-121-1A</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd/Glutaraldehyd (2,5 %) in 0,1 M Natriumcacodylat</td><td>Elektronenmikroskopie Sciences</td><td>15949</td><td></td></tr><tr><td>Freon</td><td>Sigma-Aldrich Chemicals</td><td>613894</td><td></td></tr><tr><td>Guanidin-HCl</td><td>Sigma-Aldrich Chemicals</td><td>G7294</td><td></td></tr><tr><td>Schinkens F-12-Nährstoffmischung</td><td>Thermo Scientific</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Scientific</td><td>14185-045</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>HS</td><td>Biological Industries</td><td>04-124-1A</td><td></td></tr><tr><td>Human &beta;-NGF ELISA Development Kit</td><td>Peprotech</td><td>900-K60</td><td></td></tr><tr><td>Immumount Lösung</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Medium</td><td>Sigma-Aldrich Chemicals</td><td>L5520</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Scientific</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Biological Industries</td><td>03-020-1A</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Neurofilament H (NF-H) (phosphorylierter Antikörper) Antikörper</td><td>BiolLegend</td><td>SMI31P</td><td></td></tr><tr><td>Maus &beta;-NGF</td><td>Peprotech</td><td>450-34-20</td><td></td></tr><tr><td>Normales Eselsserum (NDS)</td><td>Sigma-Aldrich Chemicals</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Sigma-Aldrich Chemicals</td><td>p-4762</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 16%ige Lösung</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td>BN15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS (pH 7,4)</td><td></td><td></td><td>hergestellt durch Lösen von 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl und 2,7 mM KCl in doppelt destilliertem Wasser (ddH2O, 18 M&Omega;).</td></tr><tr><td>PBS X10</td><td>Biological Industries</td><td>02-020-1A</td><td></td></tr><tr><td>PC12 Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>CRL-1721</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin&ndash; Streptomycin</td><td>Biological Industries</td><td>03-032-1B</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich Chemicals</td><td>p1644</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma-Aldrich Chemicals</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>PrestoBlue Reagenz</td><td>Thermo Scientific</td><td>A13261</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium</td><td>Biological Industries</td><td>01-100-1A</td><td></td></tr><tr><td>Si Wafer</td><td>Siltronix Corp. </td><td></td><td>Hoch B-dotiert, p-Typ, 0,00095 &Omega;-cm spezifischer Widerstand, < 100>orientiertes</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich Chemicals</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich Chemicals</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Gerbsäure</td><td>Sigma-Aldrich Chemicals</td><td>403040</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Chem-Impex International Inc.</td><td>Nr. 1279</td><td></td></tr></tbody></table>

gestaltung von porösem silizium filme als träger von nerve growth factor

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Trotz des großen Potenzials des NGF zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen seine therapeutischen Verwaltung stellt eine große Herausforderung dar, da das Protein nicht die Blut - Hirn-Schranke, aufgrund seiner chemischen Eigenschaften überquert und erfordert daher langfristige Lieferung an das Gehirn, um eine biologische Wirkung haben. Diese Arbeit beschreibt Herstellung von nanostrukturierten PSi Filme als abbaubare Träger der NGF für nachhaltige Lieferung dieses sensiblen Proteins. Die PSi-Träger sind speziell auf um hohe Beladung Wirksamkeit und kontinuierliche Freisetzung von NGF für einen Zeitraum von vier Wochen, wobei seine biologischen Aktivität zu erhalten. Das Verhalten der NGF-PSi Träger als ein NGF-Delivery-System ist untersuchten in Vitro anhand ihrer Fähigkeit, neuronale Differenzierung und Auswuchs der PC12 Zellen und dissoziierten DRG-Neuronen zu induzieren. Zellviabilität im Beisein ordentlich und NGF geladen PSi Träger wird ausgewertet. Die Bioaktivität der NGF freigesetzt von den PSi-Trägern ist im Vergleich zu der konventionellen Behandlung der sich wiederholenden kostenlose NGF Verwaltungen. PC12 Zelldifferenzierung analysiert und charakterisiert durch die Messung der drei verschiedenen morphologischen Parametern von differenzierten Zellen; (i) die Anzahl der Neuriten extrahieren aus der Soma (Ii) die gesamten Neuriten Länge und (Iii) die Anzahl der Verzweigungspunkten. PC12 Zellen behandelt mit den NGF-PSi-Trägern zeigen eine tiefe Differenzierung während der gesamten Release. Darüber hinaus zeigen DRG neuronale Zellen kultiviert mit NGF-PSi-Träger einer umfangreiche Neuriten Initiation mit sich wiederholenden kostenlose NGF Verwaltungen Neuronen ähnlich behandelt. Die untersuchten abstimmbaren Träger zeigen die langfristigen Implantate für die NGF Release mit einem therapeutischen Potenzial für Neurodegenerative Erkrankungen.

Oxidierte PSi Filme werden hergestellt, wie im Protokoll beschrieben. Die Si-Wafer unterliegt einer elektrochemischen Ätzen für 20 s bei 250 mA/cm2 (Abbildung 1ai), gefolgt von thermischen Oxidation bei 800 ° C (Abbildung 1aii), ein orientierter2 Gerüst zu produzieren. Hochauflösenden Rasterelektronenmikroskopie erscheinen (HR-SEM) Bilder von der daraus resultierenden orientierter2 Film in Bild 1 bc. Draufsicht Aufnahme des Films (Abbildung 1 b) zeigt seine hochporöse Natur mit Poren ca. 40 nm im Durchmesser. Cross-sectional Schliffbild eines gespalten Films (Abbildung 1 c) zeigt eine poröse Schichtdicke von 2,9 µm, gekennzeichnet durch Vernetzung von zylindrischen Poren.
Die beteiligte2 Filme werden mit der NGF Lösung zu laden, wie in Abbildung 1Aiiigeladen. NGF laden wird quantifiziert mittels NGF ELISA durch Messung der NGF-Konzentrationen in der Laden-Lösung vor und nach der Inkubation mit orientierter2 Filme. Die durchschnittliche Masse des geladenen NGF pro beteiligte2 Film ist als 2,8 ± 0,2 µg bestimmt, die eine hohe Belastung Wirksamkeit von 90 % (w/w) (Daten nicht gezeigt31) entspricht. Um die NGF Freisetzungsprofil aus den orientierter2 Trägern zu etablieren, werden die geladenen Filme mit PBS-Puffer bei 37 ° C inkubiert und alle 2 Tage Aliquote sind für die Quantifizierung von die freigegebenen Proteinkonzentration mittels ELISA NGF abgetastet. Darüber hinaus wird der Si-Gehalt in der Release-Samples quantifiziert mit ICP-AES und Si Erosion Kinetik der Beteiligte2 Träger gegründet. Abbildung 2 zeigt die NGF-Version und die entsprechenden Si Abbau Profile der porösen Träger. Ein verzögerter Freisetzung von NGF, ohne Burst-Effekt, wird für einen Zeitraum von 1 Monat erreicht. NGF-Release in der ersten Woche ist schneller (Steigung = 0.442) im Vergleich zu eine viel langsamere Freigabe in späteren Tagen entlang der Freigabedauer (Steigung 0,043). Es sei darauf hingewiesen, dass während der gesamten Release 1 Monat Zeit ausreicht, die Höhe der NGF veröffentlicht zur Induktion Tiefe Differenzierung von PC12 Zellen, wie später erläutert wird. Die kumulative NGF veröffentlicht erweist sich in eine gute Korrelation (R2 = 0,971) mit der restlichen Si Inhalt, wie in den Einschub der Abbildung 2dargestellt.
Als nächstes die Bioaktivität der NGF geladen orientierter2 Träger zeichnet sich in Vitro, PC12 Zellen und DRG-Neuronen dienen als Modelle für neuronale Differenzierung und Auswuchs. Das ausgesät PC12 Zellen und dissoziierten DRG-Neuronen, wie im Protokoll beschrieben. Zunächst wird Zellviabilität im Beisein der Beteiligte2 Träger durch Inkubation der Zellen mit ordentlichen (nicht geladen) oder NGF geladen orientierter2geprüft; Steuerplatten und Zellen mit ordentlich orientierter2 behandelt werden alle 2 Tage mit kostenlosen NGF ergänzt. Keine Zytotoxizität wird beobachtet, unter Einwirkung der Zellen, die pur oder NGF geladen orientierter2 Träger (Abb. 3a), zeigen, dass beteiligte2 mit dieser Zelllinie biokompatibel ist. Abbildung 3 b zeigt repräsentative HR-SEM Mikrographen PC12 Zellen mit NGF geladen orientierter2 Träger behandelt. Die beobachteten Zellen Extrakt Neuriten und Form charakteristisch verzweigte neuronale Netze. Ähnliche Ergebnisse werden erzielt, wenn die Aussaat DRG neuronale Zellen in Anwesenheit von NGF geladen orientierter2 Träger getrennt. Konfokale Bilder von Immunostained DRG Zellen kultiviert mit NGF geladen orientierter2 Trägern (Abbildung 3e) zeigen eine umfangreiche Neuriten Initiierung und Dehnung, ähnlich wie die Positivkontrolle (d.h., Neuronen mit kostenlosen ergänzt NGF, siehe Abbildung 3d), während die negativen Steuern (d. h.unbehandelten Neuronen, siehe Abbildung 3 c), weist eine schlechte Ausmaß der Neurit Auswuchs.
Um PC12 Zellen Differenzierung Prozentsatz im Beisein von NGF befreit die beteiligte2 Träger zu bewerten, ist Differenzierung durch zählen der Zellen mit Neuriten Auswuchs aus der gesamten Zellpopulation quantifiziert. Abbildung 4 fasst die Ergebnisse in Bezug auf den Anteil von differenzierten Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten über einen Zeitraum von 26 Tagen. Deutliche Differenzierung Prozentwerte werden während der gesamten Studium erreicht. Insbesondere hat veröffentlichten NGF nach 26 Tagen, Differenzierung von über 50 %, ein Prozentsatz der Differenzierung induziert, die deutlich höher zu früheren Studien mit Polymer-basierten Träger16verglichen wird. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass NGF Einschluss in den porösen Host die biologische Aktivität des Proteins zur Induktion Tiefe Differenzierung für einen Zeitraum von ~ 1 Monat erhalten.
Um die Wirkung von NGF-orientierter2 Träger auf neuronale Differenzierung eingehender zu untersuchen, werden drei charakteristische morphologische Parameter der differenzierten PC12 Zellen auf der Ebene der einzelnen Zelle gemessen: (i) die Anzahl der Neuriten aus der Soma (extrahieren (II) die gesamten Neuriten Länge und (Iii) die Anzahl der Verzweigungspunkten. Die Zellen werden mit NGF geladen orientierter2 Träger oder wiederholte Verabreichung von freien NGF (alle 2 Tage), als ein Steuerelement behandelt. Abbildung 5a -c präsentiert die morphometrische Analyse der Zellpopulation am Tag 1 und 3. Die PC12 Zellen behandelt mit der NGF geladen orientierter2 zeigen morphometrische Werte, die die Steuerung der Behandlung für alle drei getesteten Parameter ähnlich sind. Nach 3 Tagen sind die Werte aller morphologischen Parameter beobachtet, um mit der gleichen Rate für die NGF geladen orientierter2 Träger und die Behandlung der sich wiederholenden Verwaltung der freien NGF erhöhen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58982/58982fig1.jpg"> Abbildung 1: Herstellung von orientierter2 Filme. (a) Fertigung Schema der Beteiligte2 Träger: (i) Silizium-Wafer unterliegt einer elektrochemischen Ätzen für 20 s bei 250 mA/cm2, gefolgt von (Ii) thermische Oxidation bei 800 ° C, leski2 beteiligte und (Iii) Laden von NGF zu produzieren physikalische Adsorption (Schaltpläne zeichnen nicht maßstabsgetreu). (b-c) Draufsicht und Querschnitt Elektron Mikrographen eine charakteristische orientierter2 Film. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58982/58982fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58982/58982fig2.jpg"> Abbildung 2: NGF Release und Si Erosion Profile von NGF geladen orientierter2 Trägern. Das Ausmaß des Abbaus der Beteiligte2 Träger präsentiert sich als der Anteil der verbleibenden Si-Gehalt auf jeden Zeitpunkt aus der gesamten Si-Gehalt des porösen Films. Der Inset zeigt die Korrelation zwischen der kumulative NGF freigesetzt und verbleibende Si Inhalte. Fehler Balken repräsentieren SD, n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58982/58982fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58982/58982fig3.jpg"> Abbildung 3: Zellviabilität und Wachstum in Anwesenheit von NGF geladen orientierter2 Träger. (a) In-vitro- Zytotoxizität Charakterisierung. PC12 Zellen Lebensfähigkeit ist gemessen an 1, 3 und 7 Tagen nach ihrer Exposition gegenüber ordentlich (nicht geladen) beteiligte2 Träger, NGF geladen orientierter2 Träger oder kostenlose NGF (50 ng/mL alle 2 Tage, Steuerplatten). (b) Elektron Mikrographen PC12 Zellen kultiviert mit NGF geladen orientierter2 Träger für 9 Tage. Links: ein Zoom-in, Darstellung Neuriten Auswuchs aus der Zelle Soma; rechts: ein Zoom-Out, unter Angabe der hochkomplexen neuronalen Netzwerks gebildet. (c-e) Konfokale Mikroskopie Bilder von Immunostained DRG neuronale Zellkultur (2 Tage nach der Aussaat): (c) unbehandelten Zellen; (d) Zellen ergänzt mit gratis NGF (50 ng/mL); (e) NGF-orientierter2 Träger. Immunofluorescent Färbung der Neurofilamente H ermöglicht Bildgebung der Zelle Soma und outgrowing Neuriten. Maßstabsleiste = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58982/58982fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58982/58982fig4.jpg"> Abbildung 4: PC12 Zellen Differenzierung Prozentwerte bei Kontakt mit NGF aus NGF geladen orientierter2 Träger zu repräsentativen Zeitpunkten freigesetzt. Differenzierung-Prozentsatz wird als die Anzahl der Zellen mit Neuriten Auswuchs aus der gesamten Zellpopulation ausgedrückt. Kontrolle der Behandlung bezieht sich auf Zellen ergänzt mit kostenlosen NGF (50 ng/mL). Repräsentative lichtmikroskopische Aufnahmen von Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten werden entlang der x-Achse dargestellt; Maßstabsleiste = 25 µm für Aufnahmen von Tag 2, 8, 14, 26 und 50 µm für Kontrolle Schliffbild. Fehler Balken repräsentieren SD, n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58982/58982fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58982/58982fig5.jpg"> Abbildung 5: morphometrische Analyse von differenzierten Zellen PC12. Drei morphologische Parameter der differenzierten PC12 Zellen gemessen werden auf die einzelne Zellenebene am Tag 1 und 3 Wirkstoffexposition NGF geladen orientierter2 Träger oder wiederholte Verabreichung von NGF kostenlos alle 2 Tage (Kontrolle); (ein) total Neuriten Länge (b) Anzahl der Neuriten extrahieren aus der Zelle Soma und (c) Anzahl der Verzweigungspunkten. Fehler Balken repräsentieren SD, n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58982/58982fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu entwerfen und fabrizieren nanostrukturierten poröse Silizium (PSi) Filme als abbaubare Träger für den Nervenwachstumsfaktor (NGF). Neuronale Differenzierung und Auswuchs der PC12 Zellen und Mäusen Dorsal Root Ganglion (DRG) Neuronen sind bei der Behandlung mit der NGF geladen PSi Träger gekennzeichnet.

Gestaltung von porösem Silizium Filme als Träger von Nerve Growth Factor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...

NGF an das Gehirn geliefert ist eine Herausforderung. Hier stellen wir einen neuen Trägertyp vor, der eine sichere und längere Freisetzung des bioaktiven Proteins ermöglicht. Diese Technik ermöglicht eine einfache und effiziente Beladung von NGF in poröse Siliziumträger.Es wird bei Raumtemperatur und ohne Verwendung von starken organischen Lösungsmitteln durchgeführt. Da das poröse Siliziumträgerdesign abstimmbar ist, können die Träger als NGF-Reservoirimplantate für eine langfristige Freisetzung dienen, aber auch modifiziert werden, um andere Faktoren und Medikamente zu tragen. Für Ingenieure und Chemiker ist der Herstellungsprozess möglicherweise einfacher durchzuführen.Während für Lebenswissenschaftler und Kliniker, die Zellkultur Verfahren sollten relativ einfach zu reproduzieren sein. Beginnen Sie mit der Montage eines ein Punkt fünf mal einen Punkt fünf Zentimeter großen Siliziumwafers mit einem gut charakterisierten Widerstand in eine Polytetrafluro-Ethal-Ätzzelle mit einem Streifen aus Aluminiumfolie als Rückenkontakt und einem O-Ring zur Versiegelung der Zelle. Das Gewebe ist für den Einsatz von Siliziumwafern mit ähnlichen Widerstandswerten jedes Mal represistierbar.Die Siliziumprobe in einer Drei-zu-eins-Lösung von Akleus-Flusssäure und Ethanol wird 20 Sekunden lang bei einer konstanten Stromdichte von 250 Milliampere pro Zentimeter quadratisch elektrochemisch geätzt. Spülen Sie dann die Oberfläche des resultierenden porösen Siliziumfilms dreimal mit Ethanol ab, bevor Sie unter einem Stickstoffstrom trocknen. Wenn die Probe trocken ist, oxidieren Sie die frisch geätzte poröse Siliziumprobe im Rohrofen bei 800 Grad Celsius eine Stunde lang in der Umgebungsluft zu einem oxidierten porösen Siliziumgerüst.Wenn die Probe abgekühlt ist, verwenden Sie eine Holzsäge, um sie in eine acht mal acht Millimeter große Probe zu schneiden. Um die Proben mit NGF zu beladen, geben Sie 52 Mikroliter frisch zubereitete NGF-Ladelösung auf jede Probe und inkubieren Sie die Proben für zwei Stunden bei Raumtemperatur in einer abgedeckten Schale unter hohen Feuchtigkeitsbedingungen. Nach zwei Stunden die Lösung auf den Proben sammeln und NGF-Ladelösung und die gesammelten Proben nach der Ladelösung in den entsprechenden Konzentrationsbereich für das Iliza-Kit verdünnen.Wenn alle Proben verdünnt wurden, fügen Sie 100 Mikroliter der verdünnten Proben in Kalibrierkurvenproben zu jedem Bohrkörper eines NGF-Capture-Antikörpers hinzu, der 96 Well-Iliza-Platte für eine zweistündige Inkubation bei Raumtemperatur beschichtet hat. Am Ende der Inkubation die Platte viermal waschen und hundert Mikroliter eines Mikrogramms pro Milliliter biotentilierten Detektionsantikörpers für eine zweistündige Inkubation bei Raumtemperatur zu jedem Brunnen hinzufügen. Nach vier Waschungen, wie gezeigt, fügen Sie 100 Mikroliter Avidin-Horseradish Peroxidace zu jedem Brunnen für eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur gefolgt von vier Waschungen im Waschpuffer, wie gezeigt.Nach der letzten Wäsche 100 Mikroliter Substratlösung zu jedem Brunnen für eine 25-minütige Farbentwicklung Inkubation bei Raumtemperatur hinzufügen. Verwenden Sie dann einen Mikroplattenleser, um die Absorption bei 405 Nanometern zu messen, wobei die Wellenlängenkorrektur auf 650 Nanometer eingestellt ist, und die NGF-Konzentration sowohl in der Ladelösung als auch in der gesammelten Nachladelösung basierend auf der Kalibrierkurve zu bestimmen. Für In Vitro NGF Freisetzung, inkubieren die NGF geladen oxidierte poröse Siliziumträger in zwei Milliliter NullPunkt Null ein Molar PBS ergänzt mit einem Prozent Boyvine Serum albaman in Null Punkt Null zwei Prozent Natriumazid bei 37 Grad Celsius und 100 Rotationen pro Minute der Orbitaladjatation.Sammeln Sie die Lösung alle zwei Tage und ersetzen Sie sie nach jeder Aspiration durch zwei Milliliter frische SPBS. Dann frieren Sie die gesammelten Freisetzungsproben in flüssigem Stickstoff für minus 20 Grad Celsius Lagerung, bis NGF-Analyse von iliza, wie gerade gezeigt. Um ein differenziertes Feo Cromo Sitoma 12 oder PC 12, Zellkultur zu erzeugen, sammeln Sie die Zellsuspension durch Sentripugation und setzen Sie die Zellen in fünf Milliliter n frischem Grundwachstumsmedium wieder aus.Nach einer zweiten Sentribugation den Palate in drei Millilitern des Grundlegenden Wachstumsmediums wieder aussetzen und eine 23-Spur-Spritze verwenden, um die Zellen zehnmal zu saugen, um Zellcluster zu trennen. Nach dem Zählen, Samen ein mal 10 bis die vierte Zelle pro Zentimeter quadratische n-Messbereich auf einem kolligen Typ ein beschichtete Platten in Gegenwart von Differenzierungsmedium. Legen Sie die Platten in den Inkubator.Nach 24 Stunden bei 37 Grad Celsius frische murine Beta NGF oder NGF geladenporigen Siliziumträger auf jeder Platte hinzufügen und die Platten zum Inkubator zurückgeben. Um die Zelllebensfähigkeit zu bewerten, inkubieren Sie die Kulturen mit 10 Prozent einer geeigneten Lebensfähigkeitsindikatorlösung zu repräsentativen Zeitpunkten für fünf Stunden bei 37 Grad Celsius und messen Sie die Absorption auf einem Spektropentometer bei 490 Nanometern, wobei die Wellenlängenkorrektur auf 630 Nanometer festgelegt ist. Um die PC 12-Zelldifferenzierung in Gegenwart von NGF-belasteten porösen Siliziumträgern zu bewerten, säen Sie die PC 12-Zellen in 12 niedrig kollagenbeschichteten Platten 24 Stunden lang in einem Zellkultur-Inkubator und führen die zuvor erhaltenen In Vitro-proben in die entsprechenden Versuchsbrunnen ein.Nach einer 24-stündigen Inkubation die Zellen durch Lichtmikroskopie abbilden und die Anzahl der Zellen mit Alkronuriten in jedem Brunnen manuell zählen. Zur morphometrischen Analyse der differenzierten PC 12-Zellen erfassen Sie Phasenbilder der kultivierten Zellen bis zu drei Tage nach der Behandlung mit NGF und öffnen Sie die Dateien in Neuron J.Konvertieren Sie die Bilddatei in ein Acht-Bit-Format und verwenden Sie die Bildskala-Leiste, um das Verhältnis von Pixel zu Mikrometer zu messen. Verwenden Sie Analysieren und Festlegen von Maßstäben, um den Maßstab festzulegen und die Länge jedes Neurites zu messen.Zählen Sie dann manuell die Anzahl der Verzweigungspunkte und die Anzahl der Nouriten, die aus jedem Zellsoma stammen. Gezeigt werden hochauflösende Rasterelektronenmikroskopiebilder des resultierenden oxidierten porösen Siliziumfilms. Eine Top-View-Mikrographie des Films zeigt seine sehr poröse Natur mit Poren von etwa 40 Nanometern Durchmesser.Eine Querschnittsmikroskopie eines spaltenden Films zeigt eine poröse Schichtdicke von zwei Punkten von neun Mikrometern, die sich durch die Verbindung zylindrischer Poren auszeichnet. Eine nachhaltige Freisetzung von NGF ohne Burst-Effekt wird für einen Zeitraum von einem Monat mit einer schnelleren NGF-Veröffentlichung während der ersten Woche im Vergleich zu einer viel langsameren Freisetzungsrate in den späteren Tagen der Veröffentlichungszeit erreicht. Die Behandlung mit NGF-belasteten porösen Siliziumträgern induziert die Bildung von Neuriten in charakteristischen verzweigten neuronalen Netzwerken in PC 12-Zellkulturen.Beachten Sie, dass auch nach 26 Tagen die freigesetzte NGF eine Zelldifferenzierung von über 50 Prozent induziert, was darauf hindeutet, dass die NGF-Einschließung innerhalb des porösen Wirts die biologische Aktivität des Proteins für einen Zeitraum von etwa einem Monat konserviert. Die morphometrische Analyse der mit NGF belasteten porösen Silizium behandelten Zellpopulationen an den Tagen eins und drei zeigt, dass PC 12-Zellen, die mit NGF-belastetem porösem Silizium behandelt wurden, morphometrische Werte aufweisen, die denen entsprechen, die in den kontrollierten Behandlungskulturen für alle drei getesteten Parameter beobachtet wurden. Wenn Sie die vorgestellten Schritte angemessen befolgen und erfüllen, erhalten Sie ein vorteilhaftes NGF-Liefersystem, das das Überleben und die Differenzierung neuronaler Zellen aufrecht erhält.Wir untersuchen derzeit die Verwendung von NGF porösen Siliziumträgern als langfristige Freisetzen von Implantaten im Gehirn, um ihre normale Schutzwirkung zu untersuchen und degenerative Krankheiten wie die Alzheimer-Krankheit zu kennen. Nach diesem Verfahren kann auch die Wirkung der NGF-belasteten porösen Siliziumträger auf ein normales Wachstum von Dosal-Holz-Gangränzellen untersucht werden. Poröses Silizium ist ein vielversprechendes Nanomaterial, das für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden kann.Anders als die hier vorgestellte, einschließlich biologischer oder chemischer Sensoren, Diagnostik und Bildgebung. Um eine mögliche Toxizität der porösen Siliziumträger gegenüber Ihrer Zelllinie auszuschließen, achten Sie darauf, einen Aufsatz der Dauerhaftigkeit durchzuführen und Ihre porösen Siliziumproben zu sterilisieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

In diesem Video zeigen wir die Technik der weichen Lithographie mit Polydimethylsiloxan (PDMS), die wir verwenden, um eine Mikrofluidikvorrichtung zur Kultivierung von Neuronen farbricate.

Herstellung eines mikrofluidischen Vorrichtung für die Abschottung der Neuron Soma und Axonen

Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Strukturierung oxidfreie Silizium und Germanium mit reaktiven organischen Monoschichten und demonstrieren Funktionalisierung der strukturierten Substraten mit kleinen Molekülen und Proteinen. Der Ansatz vollständig schützt Oberflächen durch chemische Oxidation, ermöglicht eine präzise Kontrolle über Funktion Morphologie und bietet leichten Zugang zu chemisch diskriminiert Muster.

Soft-Lithographie Funktionalisierung und Strukturierung Oxydfreie Silizium und Germanium

Quelle: Rosenberg, M., et al. Design von porösen Siliziumfilmen als Träger des Nervenwachstumsfaktors. J. Vis. Exp. (2019).Dieses Video zeigt die Verwendung einer abbaubaren nanostrukturierten porösen Siliziumfolie (PSi) für die verzögerte Freisetzung des Nervenwachstumsfaktors (NGF) zur Unterstützung der PC12-Zelldifferenzierung. NGF wird durch elektrostatische Wechselwirkungen an den Poren der Folie adsorbiert und durch Diffusion und Gerüstabbau allmählich an das Medium abgegeben. Diese...

Anhaltende Verabreichung des Nervenwachstumsfaktors unter Verwendung eines porösen Siliziumfilms in Ratten-Phäochromozytom-Zellen 12

Dieses Protokoll kombiniert Elektrospinnen und Mikrosphären, um Gewebegerüste zu entwickeln, die Neuronen lenken. Der Nervenwachstumsfaktor wurde in PLGA-Mikrosphären eingekapselt und in faserige Gerüste aus Hyaluronsäure (HA) elektrogesponnen.  Die Proteinbioaktivität wurde getestet, indem die Gerüste mit den Spinalwurzelganglien des Primärkükens besät und 4-6 Tage lang kultiviert wurden.

Elektro Growth Factor Releasing Mikrosphären in Fasergerüste

Lieferung bleibt die größte Herausforderung für die therapeutische Anwendung der small interfering RNA (siRNA). Dieses Protokoll schließt die Verwendung eines multifunktionellen und biokompatibel siRNA Abgabeplattform, bestehend aus Arginin und Polyethylenimin gepfropft porösen Siliciummikropartikel.

Poröses Silizium Mikropartikel für die Lieferung von siRNA-Therapeutika

Diese Handschrift beschreibt ein Protokoll, um in vitro modulare Netzwerke aus räumlich beschränkt, funktionell miteinander verbundenen neuronalen wachsen. Eine Polymermaske zum Strukturieren einer Proteinschicht verwendet, um die zelluläre Adhäsion über die Kultivierungssubstrat zu fördern. Vernickelt Neuronen wachsen auf beschichteten Bereiche Gründung spontane Verbindungen und elektrophysiologische Aktivität zeigen.

Design, Oberflächenbehandlung, Cellular-Überzug und Kultivierung von Modular Neuronale Netze Bestehend aus Funktionell mit Inter-Schaltungen

Einblicke in die komplexen Aktionen des Gehirns erfordern fortschrittliche Forschungswerkzeuge. Hier demonstrieren wir ein neuartiges, auf Seidenkollagen basierendes 3D-Modell von neuronalem Gewebe, das einer gehirnähnlichen Architektur ähnelt. Das Modell kann verwendet werden, um die Assemblierung neuronaler Netzwerke, die axonale Führung, Zell-Zell-Interaktionen und die elektrische Aktivität zu untersuchen.

Engineered 3D Silk-Kollagen-basierten Modell von polarisiertem Neural Tissue

Wir zeigen die Synthese von Fusogenic poröses Silizium-Nanopartikeln für effektive in vitro und in vivo Oligonukleotid-Lieferung. Poröses Silizium-Nanopartikeln sind beladen mit SiRNA den Kern bilden die durch Fusogenic Lipide durch Extrusion die Shell zu bilden beschichtet ist. Targeting glyko-Funktionalisierung und Partikelcharakterisierung sind im Preis inbegriffen.

Synthese, Funktionalisierung und Charakterisierung von Fusogenic poröses Silizium-Nanopartikeln für Oligonukleotid-Lieferung

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Silizium-Nanodrähten für die intrazelluläre optische Biomodulation von Zellen in einer einfachen und einfach durchzuführenden Methode. Die Technik ist sehr anpassungsfähig an verschiedene Zelltypen und kann sowohl für In-vitro- als auch für In-vivo-Anwendungen eingesetzt werden.

Silizium-Nanodrähte und optische Stimulation für Untersuchungen der intra- und interzellulären elektrischen Kopplung

In diesem Manuskript demonstrieren wir die Herstellung einer biohybriden Hydrogel-Biotinte, die Graphen für den Einsatz im peripheren Tissue Engineering enthält. Unter Verwendung dieses 3D-Biohybridmaterials wird das neuronale Differenzierungsprotokoll von Stammzellen durchgeführt. Dies kann ein wichtiger Schritt sein, um ähnliche Biomaterialien in die Klinik zu bringen.

Herstellung und Charakterisierung von Graphen-basierter 3D-Biohybrid-Hydrogel-Biotinte für das periphere Neuroengineering

Lernen Sie die Herstellung poröser Silizium-Filme als Träger für Nerve Growth Factor. Diese Methode ermöglicht eine kontrollierte Freisetzung von NGF zur Förderung neuronaler Differenzierung und Regeneration.

Gestaltung von porösem Silizium Filme als Träger von Nerve Growth Factor

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