Name: Immobilisierung von Live Caenorhabditis Elegans Einzelpersonen, die eine ultraflache Polydimethylsiloxan Mikrofluidik-Chip mit Wassereinlagerungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Erfahren Sie eine Methode zur Immobilisierung lebender Caenorhabditis elegans mit einem ultradünnen Polydimethylsiloxan-Mikrofluidik-Chip. Diese Technik ermöglicht präzise Mikrostrahlenbestrahlung und Langzeitbeobachtung für Verhaltensstudien.

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Die Autoren danken Dr. Atsushi Higashitani für freundliche Beratung bezüglich der Behandlung von C. Elegans und DRS. Yuya Hattori, Yuichiro Yokota und Yasuhiko Kobayashi für wertvolle Diskussionen. Die Autoren danken den Caenorhabditis genetischen Center für die Bereitstellung von C. Elegans und E. Coli-Stämme. Wir danken die Crew des Zyklotrons TIARA bei QST-Takasaki für die freundliche Unterstützung bei der Bestrahlung Experimente. Wir danken Dr. Susan Furness zur Bearbeitung eines Entwurfs dieser Handschrift. Diese Studie wurde zum Teil durch KAKENHI (Grant-Nummern JP15K11921 und JP18K18839) von JSPS, M.S unterstützt

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<li>Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+biological+effects+of+ion+beams+on+lethality%2C+molecular+nature+of+mutation%2C+mutation+rate%2C+and+spectrum+of+mutation+phenotype+for+mutation+breeding+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants.</a> Journal of Radiation Research. 51 (3), 223-233 (2010).</li>
<li>Ghita, M., Fernandez-Palomo, C., Fukunaga, H., Fredericia, P. M., Schettino, G., Bräuer-Krisch, E., Butterworth, K. T., McMahon, S. J., Prise, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbeam+evolution%3A+from+single+cell+irradiation+to+pre-clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Microbeam evolution: from single cell irradiation to pre-clinical studies.</a> International Journal of Radiation Biology. 94 (8), 708-718 (2018).</li>
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<li>Yasuda, T., Kamahori, M., Nagata, K., Watanabe-Asaka, T., Suzuki, M., Funayama, T., Mitani, H., Oda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abscopal+activation+of+microglia+in+embryonic+fish+brain+following+targeted+irradiation+with+heavy-ion+microbeam%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Abscopal activation of microglia in embryonic fish brain following targeted irradiation with heavy-ion microbeam.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1-15 (2017).</li>
<li>Suzuki, M., Sakashita, T., Hattori, Y., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ultra-thin+chips+for+immobilization+of+Caenorhabditis+elegans+in+microfluidic+channels+during+irradiation+and+selection+of+buffer+solution+to+prevent+dehydration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 306, Aug 1 32-37 (2018).</li>
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<li>Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+chemotaxis+revealed+by+paired+presentation+of+a+chemoattractant+and+starvation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Biology. 204, Pt 10 1757-1764 (2001).</li>
<li>Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+locomotory+rate+is+modulated+by+the+environment+through+a+dopaminergic+pathway+and+by+experience+through+a+serotonergic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">C. elegans locomotory rate is modulated by the environment through a dopaminergic pathway and by experience through a serotonergic pathway.</a> Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).</li>
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<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li>
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<li>Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+immobilization+of+physiologically+active+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 5 (12), 1888-1902 (2010).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Auf dem Chip Immobilisierung von C. Elegans unter live-Bedingungen mit einem benetzbar PDMS-Mikrofluidik-Chip ermöglicht die effiziente zielgerichtete Microbeam Bestrahlung von mehreren Tieren. Die einfache Handhabung und Funktionen, um Austrocknen zu verhindern machen dieses System für Anwendungen geeignet, nicht nur in Microbeam Bestrahlung, sondern auch in mehreren Verhaltensstörungen Assays. Dieser Wurm Blätter haben bereits in den Handel gebracht worden und leicht zu erhalten. Konventionelle mikrofluidische...

Strahlung, einschließlich Röntgenstrahlen, Gammastrahlen und Schwerionen-Balken, ist weit verbreitet für biologische Anwendungen wie z. B. Krebsdiagnose und Behandlung und für die Ionenstrahl-Zucht. Zahlreiche Studien und technische Entwicklungen konzentrieren derzeit über die Auswirkungen von Strahlung1,2,3. Microbeam Bestrahlung ist ein mächtiges Mittel identifizieren strahlenempfindlichen Standorte in lebenden Organismen4. Die Takasaki Advanced Strahlung Institut des nationalen Forschungsinstitute für Quantum und radiologischen Science and Technology (QST-Takasaki) entwickelt eine Technologie, um einzelne Zellen unter mikroskopischer Beobachtung mit Schwerionen-Bestrahlung Microbeams5, und hat Methoden zur gezielten Microbeam Bestrahlung von mehreren Modell Tieren, wie dem Fadenwurm Caenorhabditis Elegans4,6, Seidenraupen7und Oryzias aktivieren Latipes (japanische Medaka)8. Gezielte Microbeam Bestrahlung von Nematoden C. Elegans ermöglicht die effektive Knockdown von bestimmten Regionen, wie den Nerv-Ring im Kopfbereich, damit um die Rollen dieser Systeme in Prozesse wie Fortbewegung zu identifizieren.
Eine Methode für die auf dem Chip Immobilisierung von C. Elegans Personen ohne die Notwendigkeit für die Anästhesie wurde entwickelt, um Microbeam Bestrahlung4zu ermöglichen. Darüber hinaus zur Verbesserung der in der vorherigen Studie4verwendeten mikrofluidischen Chips entwickelten vor kurzem wir benetzbar, Ion-durchlässig, Polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidischen Chips, bezeichnet als Wurm Blätter (siehe Tabelle der Materialien), für C. Elegans Individuen9Immobilisierung. Diese bestehen aus ultra-dünnen weichen Laken (Dicke = 300 µm; Breite = 15 mm; Länge = 15 mm) mit mehreren (20 oder 25) gerade mikrofluidischen Kanälen (Tiefe 70 µm; = Breite = 60 µm oder 50 µm; Länge = 8 mm) an der Oberfläche (Abb. 1A-D). Mikrofluidische Kanäle sind offen und können mehrere Tiere gleichzeitig in ihnen eingeschlossen werden (Abbildung 1E). Die Blätter sind anfällig für mikrofluidische Kanäle (von ca. 10 %, Abbildung 1F) erweitert werden können und die Elastizität erlaubt Tiere sanft umhüllt werden. Auch können aufgrund der selbständigen Aufnahmekapazität von der PDMS Tiere verschlossen ist in den Kanälen durch Abdecken der Wurm Blechoberfläche mit einer dünnen Abdeckfolie, in denen Tiere nicht in die Kanäle für das Gehäuse gedrückt werden. Durch Drehen des Deckels film über, können wir leicht die Tiere sammeln.
Die Kanäle nicht zu verletzen die Würmer wenn sie eingeschlossen werden oder wenn sie gesammelt werden. Darüber hinaus sind die Blätter aus PDMS, die im wesentlichen hydrophob ist, aber Wassereinlagerungen durch Vermittlung von Hydrophilie des Materials erreicht werden kann. Die Wassereinlagerungen und Dicke sind günstige Eigenschaften der Wurm Blätter. Die Wassereinlagerungen Kapazität verhindert Austrocknung der Tiere nach längerer Immobilisierung und ermöglicht langfristige Beobachtungen durchgeführt werden.
Darüber hinaus sind bereits9beschrieben, die Blätter nur 300 µm dicken, schwere Ionen wie Kohlenstoff-Ionen (mit einer Reichweite von ca. 1 mm im Wasser) ermöglichen das Blatt umschließt die Tiere durchlaufen. Dadurch können die Ionen Teilchen erkannt werden und die angewandte Strahlendosis genau gemessen werden. Darüber hinaus die Wurm-Blätter können wiederverwendet werden und sind somit wirtschaftlich. Mit der herkömmlichen Injektionsverfahren die Tiere eingeschlossen sind manchmal tot und sie können nicht aus dem Kanal genommen werden; Ihre Eier können auch die Kanäle verstopfen. Dies macht den Chip unbrauchbar. Chips sind daher grundsätzlich Einweg und das Kosten-Nutzen-Verhältnis ist schlecht.
In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir im Detail eine Reihe von Methoden für die auf dem Chip Immobilisierung von live C. Elegans Einzelpersonen mit Wurm Sheets. Durch Fortbewegung Proben von Tieren 3 h nach auf Chip Immobilisierung haben wir die geeigneten Abdeckfolie ausgewertet. Darüber hinaus haben wir die Beispiele der Immobilisierung auf dem Chip für bildgebende Beobachtungen und Microbeam Bestrahlung gezeigt.

<table><tbody><tr><td>C. elegans Wildtyp-Stamm</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA</td><td>N2</td><td>Wildtyp-Stamm C. elegans Stamm, der in dieser Studie im Allgemeinen verwendet wird</td></tr><tr><td>C. elegans unc-119(e2498) III mutierter Stamm</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA</td><td>CB4845</td><td>C. elegans Stamm, der nur als Beispiel für Mutanten mit abnormaler Körperform verwendet wird&nbsp;</td></tr><tr><td>C. elegans transgener Stamm HBR4</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA</td><td>HBR4</td><td>Der Genotyp dieses transgenen C. elegans Stammes ist HBR4:goeIs3[pmyo-3::GCamP3.35:: unc-54&ndash; 3' utr, unc-119(+)]V. Dieser Stamm wurde nur für die bildgebende Beobachtung eingesetzt.</td></tr><tr><td>E. coli Stamm</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, USA</td><td>OP50</td><td>E. coli Stamm, der als Futter für C. elegans</td></tr><tr><td>Worm Sheet IR (50/60)</td><td>Biocosm, Inc., Hyogo, Japan</td><td>BCM17-0001</td><td>Mikrofluidischer Chip mit 25 geraden 50/60-& Mikro; M breite Kanäle, die in allen Experimenten und Beobachtungen in dieser Arbeit verwendet wurden&nbsp;</td></tr><tr><td>Worm Sheet 60</td><td>Biocosm, Inc., Hyogo, Japan</td><td>BCM18-0001</td><td>Mikrofluidischer Chip mit 20 geraden 60 & Mikro; Kanäle mit M-Breite. Dies ist für erwachsene Tiere 3-5 Tage nach dem Schlüpfen bei 20°C möglich.</td></tr><tr><td>Worm Sheet 50</td><td>Biocosm, Inc., Hyogo, Japan</td><td>BCM18-0002</td><td>Mikrofluidischer Chip mit 20 geraden 50 & Mikro; Kanäle mit M-Breite. Dies ist für erwachsene Tiere ~3 Tage nach dem Schlüpfen bei 20°C möglich.</td></tr><tr><td>MICRO COVER GLAS</td><td>MATSUNAMI GLASS IND. LTD.</td><td>C030401</td><td>Deckglas (Dicke: 130-170 & Mikro; m) wird in Lokomotions-Assays in Protocol 3</td></tr><tr><td>Polystyrene Film</td><td>Biocosm, Inc., Hyogo, Japan</td><td>verwendet BCM18-0001/ BCM18-0002</td><td>Gebündelte Artikel von Wurmblättern. PS filim (Dicke: ~130 &micro; m) wird in Fortbewegungstests im Rahmen von Protokoll 3 verwendet.</td></tr><tr><td>Polyesterfolie Lumirror</td><td>TORAY INDUSTRIES, INC., Tokio, Japan</td><td>Lumirror T60 (t 125 &micro; m)</td><td>PET Filim (Dicke: 125 &Mikro; m) wird in Lokomotions-Assays in Protokoll 3</td></tr><tr><td>IWAKI 60 mm/unbehandelte Schale</td><td>AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan) verwendet.</td><td>1010-060</td><td>Unbehandelte Schale zur Inzuvation von C. elegans in Protokoll 1</td></tr><tr><td>IWAKI 35 mm/unbehandelte Schale</td><td>AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japan).</td><td>1010-035</td><td>Unbehandelte Schale, die in Lokomotions-Assays verwendet wird Protokoll 3</td></tr><tr><td>Milli-Q</td><td>Merck, Frankreich</td><td></td><td>Reinstwasser</td></tr><tr><td>Kimwipe S-200</td><td>Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokio, Japan</td><td>62020</td><td>120 mm x 215 mm; 200 Blatt/Karton</td></tr><tr><td>WormStuff Worm Pick</td><td>Genesee Scientific Corporation, CA, USA)</td><td>59-AWP</td><td>Platin-Picker, spezialisiert auf die Aufnahme von C. elegans</td></tr><tr><td>Forschung Stereomikroskop-System</td><td>OLYMPUS CORPORATION, Tokio, Japan</td><td>SZX16</td><td>Mikroskop, das in allen Experimenten und Beobachtungen in dieser Arbeit verwendet wird</td></tr><tr><td>Motorisiertes Fokusstativ für SZX16</td><td>OLYMPUS CORPORATION, Tokio, Japan</td><td>SZX2-ILLB</td><td>Dies wurde für die Hellfeldbeobachtung in Protokoll 3-8 verwendet.</td></tr><tr><td>Objektiv (&mal; 1)</td><td>OLYMPUS CORPORATION, Tokio, Japan</td><td>SDFPLAPO1&times; PF</td><td>NA: 0,15; W.D.: 60 mm. Dieses Darlehen wurde für die Hellfeldbeobachtung in Protokoll 3-8 verwendet.</td></tr><tr><td>Objektiv (&mal; 2)</td><td>OLYMPUS CORPORATION, Tokio, Japan</td><td>SDFPLAPO2XPFC</td><td>NA: 0,3; W.D.: 20 mm. Das&nbsp; Lends wurde für bildgebende Beobachtungen verwendet.</td></tr><tr><td>Quecksilber-Lichtquelle</td><td>OLYMPUS CORPORATION, Tokio, Japan</td><td>U-LH100HG</td><td>Das breite Emissionsspektrum ermöglicht die Durchführung einer Reihe von Fluoreszenzbildgebungsexperimenten mit allen gängigen Fluorophoren.</td></tr><tr><td>SZX16 Leuchtstofffiltereinheit (Hohe Leistung für YFP)</td><td>OLYMPUS CORPORATION, Tokio, Japan</td><td>SZX2-FYFPHQ</td><td>Ex: 490-500 nm; Em: 510-560. Dies wurde für die bildgebende Beobachtung des HBR4-Stammes verwendet.</td></tr><tr><td>Digitalkamera High Speed EXILIM</td><td>CASIO COMPUTER Co., Ltd, Tokio, Japan</td><td></td><td>EX-F1 Die Abbildungen 1B, 1E, 1F, 2A-C und Video 1 wurden mit dieser Digitalkamera aufgenommen.</td></tr><tr><td>Office 2013</td><td>Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, USA</td><td></td><td>EXCEL Software für statistische Analysen</td></tr></tbody></table>

immobilisierung von live caenorhabditis elegans einzelpersonen, die eine ultraflache polydimethylsiloxan mikrofluidik-chip mit wassereinlagerungen

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

Strahlung ist weit verbreitet, für Anwendungen in der Biologie und Ionenstrahl-Zucht, und unter diesen Verfahren Microbeam Bestrahlung stellt ein mächtiges Mittel der Identifizierung von strahlenempfindlichen Websites in lebenden Organismen. Dieses Papier beschreibt eine Reihe von auf dem Chip Immobilisierung Methoden zur gezielten Microbeam Bestrahlung von live Individuen von Caenorhabditis Elegansentwickelt. Insbesondere die Behandlung von Polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidischen Chips, die wir zuvor entwickelt, um C. Elegans Personen ohne die Notwendigkeit zu immobilisieren, für Anästhesie detailliert erklärt wird. Dieser Chip, genannt ein Wurm-Blatt ist anfällig für mikrofluidische Kanäle erweitert werden können und die Elastizität erlaubt Tiere sanft umhüllt werden. Auch können aufgrund der selbständigen Aufnahmekapazität von der PDMS Tiere verschlossen ist in den Kanälen durch Abdecken der Wurm Blechoberfläche mit einer dünnen Abdeckfolie, in denen Tiere nicht in die Kanäle für das Gehäuse gedrückt werden. Durch Drehen des Deckels film über, können wir leicht die Tiere sammeln. Darüber hinaus das Wurm-Blatt zeigt Wassereinlagerungen und ermöglicht C. Elegans Einzelpersonen mikroskopische Beobachtung über einen längeren Zeitraum unter live-Bedingungen ausgesetzt sind. Darüber hinaus ist das Blatt nur 300 µm dick, so dass schwere Ionen wie Kohlenstoff-Ionen passieren das Blatt umschließt die Tiere, so dass die Ionen Teilchen erkannt werden und die angewandte Strahlendosis genau gemessen werden. Denn Auswahl der Abdeckung Filme verwendet zum umschließen die Tiere sehr wichtig für erfolgreiche langfristige Immobilisierung, wir haben die Auswahl der geeigneten Abdeckfolien und zeigte ein empfehlenswertes Hotel bei einigen Filmen. Als Anwendungsbeispiel des Chips haben wir bildgebende Beobachtung der muskuläre Aktivitäten der Tiere umschließt des mikrofluidischen Kanals das Wurm-Blatt sowie die Microbeam Bestrahlung eingeführt. Diese Beispiele zeigen, dass der Wurm Blätter erheblich die Möglichkeiten für biologische Experimente erweitert haben.

Aktive C. Elegans Einzelpersonen konnten erfolgreich mit einer ultradünnen, benetzbar PDMS, Mikrofluidik-Chip (Wurm Blatt) immobilisiert werden. Wir untersuchten die Eignung der verschiedenen Abdeckfolien für den Wurm Dichtungsplatte, wie im Protokoll Abschnitt 3 beschrieben. Um die Abdichtung Auswirkungen der Abdeckung Filme zu bewerten, wir entschlossen die Bewegungsfähigkeit der Tiere 3 h nach auf Chip Immobilisierung mit Deckglas (Dicke: 130-170 µm), PET-Folien (Stärke: 125 µ...

Eine Reihe von Immobilisierung Methoden wurde gegründet, um die gezielte Bestrahlung von live Caenorhabditis Elegans ermöglichen Einzelpersonen mit einer neu entwickelten ultra-dünnen Polydimethylsiloxan mikrofluidischen chip mit Wassereinlagerungen. Dieser Roman auf dem Chip Immobilisierung ist auch ausreichend für imaging-Beobachtungen. Die ausführliche Behandlung und Anwendungsbeispiele des Chips werden erläutert.

Immobilisierung von Live Caenorhabditis Elegans Einzelpersonen, die eine ultraflache Polydimethylsiloxan Mikrofluidik-Chip mit Wassereinlagerungen

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means ...

Ein Vorteil dieses Protokolls ist, dass das Wurmblatt einfach zu handhaben ist. Das Blatt verfügt über Eigenschaften, die das Trocknen verhindern und es uns ermöglichen, Mikrostrahlbestrahlung für lebende Tiere durchzuführen, mehrere Verhaltenstests durchzuführen und Langzeitbeobachtungen durchzuführen. Die mikrofluidischen Kanäle in diesem Wurmblatt sind offen, was das Sammeln von Tieren erleichtert.Diese Schneckenblätter können auch wiederholt verwendet werden, was sie wirtschaftlicher macht. Als wir diese Technik entwickelten, wollten wir nur einen Teil der Tiere mit einem Mikrostrahl unter dem Mikroskop bestrahlen. Also brauchten wir klare, sehr dünne Chips, die die Tiere halten konnten.Legen Sie zunächst ein dünnes, transparentes Blatt auf die Bühne, um es als Bodenabdeckungsfolie zu verwenden. Positionieren Sie vorsichtig eine Schneckenfolie auf der unteren Abdeckfolie mit flacher Pinzette. Legen Sie mindestens drei Tröpfchen Pufferlösung auf die Oberfläche einer 6 Zentimeter langen, nicht behandelten Petrischale.Dann wählen Sie mehrere erwachsene C.elegans mit einem Platina-Picker von einer Kulturplatte. Übertragen Sie die Tiere auf ein Tröpfchen mit dem Platina-Picker und lassen Sie die Tiere im Puffer schwimmen, um alle Bakterien zu entfernen. Waschen Sie die Tiere in zwei separaten Tröpfchen und spülen Sie die Tiere in einem anderen Tröpfchen.Legen Sie als Nächstes ein Tröpfchen Pufferlösung auf die Oberfläche des Wurmblatts. Entfernen Sie die gewaschenen Tiere aus dem Puffertröpfchen, und übertragen Sie sie auf ein Tröpfchen auf dem Wurmblatt. Verwenden Sie eine flache Pinzette, um einen PS-Abdeckungsfilm über das Schneckenblatt zu legen, und drücken Sie sanft über die Kanäle von einem Ende des Blattes zum anderen.Oder lassen Sie die Tiere einfach in seimlet fallen und versiegeln Sie vorsichtig mit dem Deckfilm, so dass sich Tröpfchen zwischen der Abdeckung und den Wurmblättern mit den Tieren innerhalb des Kanals ausbreitet. Bestätigen Sie, dass die Tiere am Leben sind, indem Sie mit einem Mikroskop bei 1-2-facher Vergrößerung auf Bewegung überprüfen. Notieren Sie die Positionen der Tiere, und notieren Sie sich insbesondere die Nummer des Kanals, in dem jedes Tier eingeschlossen ist, und die Position jedes Tieres im Kanal.Um immobilisierende Tiere zu sammeln, verwenden Sie eine flache Pinzette, um den Abdeckfilm vom Wurmblatt zu entfernen, und lassen Sie dann 10-15 Mikroliter Pufferlösung auf einen der mikrofluidischen Kanäle fallen, die die Tiere umschließen. Beobachten Sie unter dem Stereomikroskop die Tiere beim Drehen. Dann nehmen Sie die Schwimmtiere mit dem Platina-Picker auf und bringen Sie sie auf eine Assay-Platte.Nachdem Sie die Tiere wie bisher nachgewiesen eingeschlossen haben, beobachten Sie fluoreszierende Flecken an den Tieren mit einem Mehleszenzmikroskop. Dann Bild CalciumionenWellenausbreitung mittels Videoaufnahme, um dynamische Aktivitäten zu beobachten. Das verwendete Wurmblatt auf eine sechs Zentimeter lange Petrischale legen und etwa 100 Mikroliter sterilisiertes ultrareines Wasser auf das Blech legen.Verwenden Sie die Handschuhe, um Wasser auf der Oberfläche des Blattes zu verteilen und alle Verunreinigungen abzuwaschen. Als Nächstes verwenden Sie Einwegtücher, um die Feuchtigkeit vom Wurmblatt zu entfernen. Geben Sie fünf Milliliter 70% Ethanol in die Petrischale und verwenden Sie die Gehandicapten, um das Ethanol über das Schneckenblatt zu verteilen.Schließlich, nachdem das Blatt trocken ist, legen Sie das Blatt auf eine sterile Petrischale und Decken. Anhand dieses Protokolls wurde die Eignung verschiedener Coverfilme untersucht. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Beweglichkeit zwischen Kontrolltieren und Tieren, die in mikrofluidischen Kanälen mit PS-Folie eingeschlossen waren.Im Gegensatz dazu wurde die Beweglichkeit bei Tieren, die unter einem Deckglas eingeschlossen sind, deutlich reduziert. Auch die Beweglichkeit der tiere, die mit einem Tierfilm eingeschlossen sind, wurde deutlich verringert. Es ist wichtig, Deckfolien für die Abdichtung von mikrofluidischen Kanälen sorgfältig auszuwählen.Anhand dieses Protokolls haben wir drei Stunden nach der Immobilisierung auf dem Chip die Eignung verschiedener Coverfilme durch Fortbewegungstests der Tiere bewertet. Mit dieser Technik wollten wir einen ultradünnen benetzbaren Chip nur für die Mikrostrahlbestrahlung entwickeln. Diese Wurmblätter wurden jedoch bereits für Bildgebungunden und Verhaltenstests über ihre ursprünglichen Anwendungen hinaus verwendet.

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