Produktion von Pseudotyped Partikel hoch pathogene Coronaviren in eine Einstellung "Biosafety Level 2" zu studieren
1. März 2019
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur pseudotyped Partikel in eine Einstellung "BSL-2" unter Einbeziehung der Spike-Protein des hoch pathogenen Viren Nahen Osten respiratorisches Syndrom und Schweres Akutes Respiratorisches Syndrom Coronaviren zu generieren. Diese pseudotyped Partikel enthalten eine Luciferase Reporter-gen ermöglicht die Quantifizierung der Virus Eintritt in Zielzellen Host.
Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, Pseudotypviren zu erzeugen, die sicher verwendet werden können, um virale Eintrittsereignisse von hoch pathogenen Viren, wie Sal Coronavirus und den meisten Coronaviren, zu untersuchen. Diese vielseitige Technik basiert auf der einfachen Einrichtung transient transfektion. Dieses System kann auch angewendet werden, um Partikel zu produzieren, die pseudotypisiert mit Fusionsproteinen anderer Viren sind, nicht nur Coronavirus S.Für beste Ergebnisse ist es wichtig, die Zellgesundheit und -dichte für die Transfektion sowie für Pseudotyp-Virusinfektionen zu überwachen.
Die Demonstration dieses Verfahrens werden Tiffany Tang und Lakshmi Nathan sein. Absolventen meines Labors. Zunächst sorgfältig HEK293T-Zellen mit 10 Millilitern 37 Grad Celsius waschen, dPBS zweimal vorgewärmt.
Als nächstes aspirieren Sie den Überstand und befestigen Sie Zellen mit einem Milliliter 25%Trypsin-Lösung, die bei 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Dann inkubieren Sie den Kolben der Zellen bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid-Umgebung für drei bis fünf Minuten, bis die Zellen beginnen, sich zu lösen. Fügen Sie vier Milliliter komplettes DMEM hinzu, um die Trypsin-Lösung zu deaktivieren.
Und dann zählen Sie Zellen mit einem Zellzählschlitten und einem Lichtmikroskop. Verdünnung der Zellen auf 500.000 Zellen pro Milliliter mit vollständigem DMEM. Als nächstes samen Sie zwei Milliliter pro Brunnen der Zelllösung in einer 6-Well-Gewebekulturplatte.
Und bewegen Sie die Platte sanft hin und her und Seite an Seite, um Zellen gleichmäßig zu verteilen. Nachdem sichergestellt wurde, dass die Zellen gleichmäßig verteilt sind, inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Umgebung über Nacht oder 16 bis 18 Stunden. Um drei Plasmid-Kotransfektionen vorzusoformatieren, mischen Sie zunächst berechnete Mengen von Plasmiden und das reduzierte Serumzellkulturmedium in einem Mikrozentrifugenrohr.
Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Dann fügen Sie drei Mikroliter pro Brunnen des lipidbasierten Transfektionsreageims auf 47 Mikroliter pro Brunnen des reduzierten Serumzellkulturmediums hinzu. Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für fünf Minuten.
Als nächstes, in einem Mikrozentrifugenrohr, mischen sie die gleichen Mengen des Transfektionsreagenzes und der Plasmidlösungen durch Rohrüberschrift enden sie mehrmals nach oben und unten. Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Verwenden Sie nach der nächtlichen Inkubation der Zellplatte ein invertiertes Lichtmikroskop, um Zellen auf ihre Morphologie und Dichte zu untersuchen.
Dann, aspirieren Sie das verbrauchte Medium der Zellen und fügen Sie sanft einen Milliliter pro Brunnen des vorgewärmten reduzierten Serumzellkulturmediums zu jedem Brunnen hinzu. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter der Transfektionslösung zu jedem Brunnen tropfen weise. Und die Zellen bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für vier bis sechs Stunden inkubieren.
Am Ende der Inkubation einen Milliliter vorgewärmter antibiotikafreier Transfektion DMEM bei 37 Grad Celsius zu jedem Brunnen hinzufügen. Und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für 48 Stunden. Um die Sammlung von Pseudotyppartikeln zu beginnen, verwenden Sie ein invertiertes Lichtmikroskop, um die Zellen auf ihre Morphologie und ihren Allgemeinzustand zu untersuchen.
Die Farbe des Mediums sollte hellrosa oder leicht orange sein. Dann übertragen Sie die Überräube der transfizierten Zellen auf 50 Milliliter konische Zentrifugenröhren. Zentrifugieren Sie die Rohre mit 290-facher Schwerkraft sieben Minuten lang, um Zellablagerungen zu entfernen.
Als nächstes klärt filterüberstand durch einen sterilen 0,45 Mikron Poren-Größe Filter. Machen Sie kleine Volumen Aliquots von Pseudotyp-Virus-Lösung in Kryo-Fläschchen. Und lagern Sie sie bei negativen 80 Grad Celsius.
Um pseudotypisierte Partikelinfektiondurchzuführen, erste Untersuchungszellen unter Lichtmikroskop, um zu bestätigen, dass es einen konfluenten Teppich von Zellen. Dann waschen Sie die Zellen dreimal mit 0,5 Millilitern des vorgewärmten DPBS bei 37 Grad Celsius. Als nächstes aspirieren Sie die Überräube der Zellen und impfen sie die Zellen mit 200 Mikrolitern der aufgetauten pseudotypisierten Partikellösung.
Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für ein bis zwei Stunden. Nach der Inkubationszeit 300 Mikroliter des vorgewärmten DMEMc bei 37 Grad Celsius hinzufügen. Und die infizierten Zellen bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für 72 Stunden inkubieren.
Schließlich die Überstand der infizierten Zellen aspirieren. Und vor luziferase Reporter Assay. Um die Infektiosität von pseudotypisierten Partikeln zu quantifizieren, taut zuerst luziferin Substrat, gespeichert bei minus 80 Grad Celsius, bei fünf Mal Luziferase-Assay-Lyse-Puffer bei minus 20 Grad Celsius auf Raumtemperatur gespeichert.
Dann verdünnen Sie den Luziferase-Assay-Lyse-Puffer auf eine einmalige Konzentration mit sterilem Wasser. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter des verdünnten Puffers zu jedem Brunnen hinzu. Und bei Raumtemperatur auf einer Wippe für 15 Minuten inkubieren.
Um die Luziferase-Aktivitätsmessung durchzuführen, fügen Sie zunächst 20 Mikroliter Luziferinsubstrat zu einem Mikrozentrifugenrohr hinzu. Dann fügen Sie 10 Mikroliter des Lysats in das Rohr. Mischen Sie den Inhalt, indem Sie die Rohre sanft streichen.
Und legte die Röhre in ein Luminometer-Gerät. Schließen Sie den Deckel und messen Sie den Lumineszenzwert des Rohres. Zeichnen Sie die Messung der relativen Lichteinheiten auf und gehen Sie der Datenanalyse voraus.
Infektiositätstests von SARS-Spp und MERS-Spp in anfälligen Wirtszellen zeigten eine starke durchschnittliche Infektiosität im Vergleich zu den erwarteten positiven Kontrollpartikeln. Nicht infizierte Kontrollen und die negativen Kontrollpartikel ohne virale Hüllimpfstoffe. Auch Luziferase-Aktivitäts-Assays zeigten Konzentrationsabhängigkeit von SARS-Spp und MERS-Spp-Infektiosität.
Eine Erhöhung der SARS-Spp- oder MERS-Spp-Infektion in schlecht freizügigen Zielzellen, transfiziert, um den ACE2-Rezeptor von SARS-Spp oder den DPP4-Rezeptor von MERS-Spp auszudrücken, bestätigt, dass die Verwendung von Pseudovirionen durch Rezeptoren der Vonzeptorverwendung von Natoviren zur Vermittlung von Anhaftung und Eintrag von Pseudovirionen ähnelt. Überprüfen Sie die Berechnungen, bevor Sie diesen Schritt ausführen. Und stellen Sie sicher, dass alle Lösungen während des Schritts gut gemischt sind.
Ein Western-Blot-Assay kann an konzentrierten pseudotypisierten Partikeln durchgeführt werden, um die Aufnahme von S-Glykoprotein in die Pseudovirionen zu bewerten. Während die hier beschriebenen pseudotypisierten Partikel sicherere Surrogate als Nato-Viren sind, erfordern sie immer noch zwei Vorsichtsmaßnahmen auf Biosicherheitsstufe.
Überblick
Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von pseudotypisierten Partikeln, die Spike-Proteine von MERS- und SARS-Coronavirusen in einer BSL-2-Umgebung enthalten. Diese Partikel ermöglichen die Untersuchung des viralen Eindringens in Wirtszellen unter Verwendung eines Luciferase-Reportergens zur Quantifizierung.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Virologie
- Zellbiologie
- Infektiologie
Hintergrund
- Pseudotypisierte Viren sind sicherere Modelle zur Untersuchung pathogener Viren.
- Die Technik ermöglicht die Untersuchung viraler Eintrittsmechanismen.
- HEK293T-Zellen werden häufig für Transfektion und Virusproduktion verwendet.
- Die Überwachung der Zellgesundheit ist entscheidend für eine erfolgreiche Transfektion und Infektion.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer sicheren Methode zur Untersuchung des viralen Eindringens von MERS und SARS.
- Quantifizierung der Infektiosität pseudotypisierter Partikel.
- Bewertung der Rezeptornutzung in Pseudovirionen.
Verwendete Methoden
- Transfektion von HEK293T-Zellen mit Plasmiden, die virale Proteine codieren.
- Sammlung und Reinigung pseudotypisierter Partikel.
- Infektion von Zielzellen mit pseudotypisierten Partikeln.
- Messung der Luciferase-Aktivität zur Quantifizierung der Infektiosität.
Hauptergebnisse
- Pseudotypisierte Partikel zeigten eine starke Infektiosität in Zielzellen.
- Luciferase-Assays demonstrierten eine konzentrationsabhängige Antwort.
- Die Rezeptornutzung bestätigte sich als ähnlich der nativer Viren.
- Western-Blot-Assays zeigten eine erfolgreiche Einbeziehung von Spike-Proteinen an.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Protokoll bietet eine zuverlässige Methode zur Untersuchung des viralen Eindringens.
- Pseudotypisierte Partikel dienen als effektive Surrogatmodelle für pathogene Viren.
- Dieser Ansatz kann für andere Viren über Coronavirusse hinaus angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to study viral entry mechanisms of highly pathogenic coronaviruses under BSL-2 conditions, reducing containment barriers while maintaining biological relevance. By using pseudotyped particles with luciferase readouts, organizations can efficiently evaluate host susceptibility, tropism, and inhibitor effects in early discovery workflows. The approach supports mechanistic de-risking of entry-targeted therapeutics before committing resources to higher-risk models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of coronavirus spike protein-mediated entry pathways using surrogate particles that mimic native virion behavior.
- Operational Value: Allows screening of receptor usage and entry inhibitors in standard BSL-2 facilities without requiring BSL-3 access.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a quantitative luciferase-based readout to measure infectivity and assess concentration-dependent inhibition of viral entry.
- Operational Value: Supports high-throughput compatible workflows for pseudotype production, purification, and infection using HEK-293T cells.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates assessment of host cell susceptibility and tropism by pseudotyped particles bearing MERS-CoV or SARS-CoV spike proteins.
- Operational Value: Enables cross-functional collaboration between virology, assay development, and pharmacology teams using standardized pseudotype panels.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through mechanistic interrogation of viral entry prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of spike protein function and receptor engagement using pseudotyped surrogates.
- Screening: Enables production of standardized, quantifiable pseudotyped particles for consistent compound screening against viral entry.
- Analytics: Generates luciferase-based luminescence readouts that allow quantitative comparison of infectivity across conditions and inhibitor treatments.
- Translational Research: Connects to preclinical relevance by confirming receptor usage parallels that of native viruses, informing model selection.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform applicable to multiple viral fusion proteins (e.g., influenza HA, Ebola GP) beyond coronaviruses.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in viral entry mechanisms through receptor-specific infection patterns and inhibitor sensitivity profiling.
- Operational Value: Standardized pseudotype production and titration via luciferase assay improves reproducibility across teams and sites.
- Strategic Value: Reduces late-stage attrition by enabling early de-risking of entry-targeted candidates using physiologically relevant surrogates.
- Portfolio Impact: Informs go/no-go decisions on entry inhibitors by providing quantitative data on mechanism of action and potency.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, transfection, and viral pseudotype production.
- Dependent on access to luminometers and luciferase assay reagents for infectivity quantification.
- Necessitates standardized SOPs for supernatant collection, filtration, and aliquoting to ensure batch consistency.
- Adaptation to non-coronaviral envelope proteins requires validation of pseudotype incorporation and functionality.
- Limited to studying entry steps only; downstream viral life cycle events require complementary methods.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:41
Cell Seeding for Pseudotyped Particle Production
2:05
Three-plasmid Co-transfection
3:53
Pseudotyped Particles Collection
4:46
Pseudotyped Particle Infection
5:54
Infectivity Quantification by Luciferase Assay Readout
7:04
Results: Infectivity Assays of SARS-CoV S and MERS-CoV S Pseudotyped Particles
8:02
Conclusion
