Name: Ein Tripeptid-stabilisierten Nanoemulsion Ölsäure (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Erfahren Sie die Synthese einer tripeptid-stabilisierten Nanoemulsion mit Ölsäure-Platin(II)-Konjugat für die Arzneimittelverkapselung. Diese Methode ermöglicht biologisch abbaubare Wirkstofffreisetzung bei Eierstockkrebs.

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Gewähren Sie wir dankbar anerkennen, finanziellen Unterstützung durch das National Cancer Institute SC2CA206194. Keine finanziellen Interessenkonflikte werden erklärt.

1. Synthese von Ölsäure Acids–Platinum(II) Konjugat
<ol><li>Aktivierung von cisplatin<ol>
<li>Aussetzen von 50 mg (0.167 Mmol) von Cisplatin in 4 mL Wasser (z.B. Nanopure) bei 60 ° C.</li>
		<li>Die Lösung von Cisplatin tropfenweise 55,2 mg (0.325 Mmol) AgNO3 in 0,5 mL Wasser hinzu und rühren Sie die Reaktion für mindestens 2 h bei 60 ° C. Zeigt den Fortschritt der Reaktion bilden der weiße Niederschlag von AgCl.</li>
		<li>Um festzustellen, ob die Aktivierung Reaktion abgeschlossen ist, führen Sie den Test mit 10 % HCl auf das Vorhandensein von freien Ag+ -Ionen in Lösung. Sollte der Test negativ sein (keine zusätzliche AgCl Niederschlag sollte zu bilden).</li>
		<li>Zentrifugieren Sie das Reaktionsgemisch 3.220 x g für 10 min und entfernen Sie die weißen Niederschlag von AgCl.</li>
		<li>Den Überstand zu sammeln und über einen 0,2 mm Spritze Filter filtern. Den Überstand für die Anwesenheit von Platin indem Sie 2-3 Tropfen der Lösung über Pasteurpipette auf SnCl2 Kristalle zu testen. Der Test ist positiv, wenn die Farbe der Koordinate Komplex von Zinn mit Platin dunkel gelb/Orange ist.</li>
		<li>Verwenden Sie den Überstand mit aktivierten Pt(II) für den zweiten Schritt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reaktion von Ölsäure mit aktivierten Pt(II)<ol>
<li>Aussetzen von 94,2 Ölsäure (0.333 Mmol) mg in 3 mL Wasser bei 60 ° C.</li>
		<li>Fügen Sie 13,3 mg (0.333 Mmol hinzu) von NaOH in 1 mL Wasser und mischen Sie sich mit der Lösung der aktivierten Pt(II) aus Schritt 1.1</li>
		<li>Rühren Sie die Reaktion für 2 h bei 60 ° C und anschließend bei Raumtemperatur über Nacht. Das Rohprodukt ist eine ölige braun/gelben Niederschlag.</li>
		<li>Das Reaktionsgemisch 3.220 x g für 10 min Zentrifugieren und den Überstand zu entfernen. Trocknen Sie das Rohprodukt bei 25 ° C mit einer Drehverdampfer. Reinigen Sie das Produkt, indem mehrere Wäschen mit Acetonitril. Die endgültige Farbe des reinen Ölsäure acids–Pt(II) Konjugat ist hellgelb.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Synthese von KYF-Pt-NE und die FITC-markierte Nanoemulsion FITC-KYF-Pt-NE
<ol><li>Synthese von KYF Tripeptid und das Eindringmittel beschrifteten Tripeptid FITC-KYF<ol>
<li>Die KYF mit standard Solid-State-Peptidchemie zu synthetisieren. Verwenden Sie den folgenden Standard Kupplung Bedingungen jede Aminosäure zu befestigen: Wang Harz (2,19 Mmol), Fmoc geschützten Aminosäure (4.38 Mmol), 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium Tetrafluoroborate (TBTU) (4.38 Mmol) und Diisopropylethylamine (DIPEA) (8,76 Mmol). Auflösen der Aminosäuren mit TBTU in Dimethylformamid (DMF) und DIPEA.</li>
		<li>5,7 g Fmoc-L-Phe-4-Alkoxybenzyl-Alkohol-Harz (0,382 Meq/g) in 25 mL DMF für 1 h vor der Verwendung einweichen.</li>
		<li>Deprotect der Amingruppe der Aminosäure L-Phenylalanin mit 15 mL 20 % Piperidin/DMF-Lösung für 5 min, das Lösungsmittel zu verwerfen und das Waschen mit 20 min Zyklus wiederholen.</li>
		<li>Das Harz für 1 min mit folgenden Lösungsmitteln waschen: DMF, Isopropylalkohol (IPA), DMF, IPA, DMF, IPA, DMF, DMF. Entsorgen Sie das Lösungsmittel nach jedem Waschen.</li>
		<li>Führen Sie den Kaiser-Test um festzustellen, das Vorhandensein von freien NH2 Gruppe auf dem Harz (siehe Teilschritte) und wenn positiv (der Harz-Samen ist lila), fügen Sie die Fmoc-L-Tyrosin Aminosäure und führen Sie die Kopplung über Nacht.<ol>
<li>Bereiten Sie Kaiser Testlösungen in separate Flaschen.</li>
			<li>5 g Ninhydrin in 100 mL Ethanol auflösen.</li>
			<li>80 g von Phenol in 20 mL Ethanol auflösen.</li>
			<li>Mischen Sie 2 mL 0.001 M wässrige Lösung von Zyankali mit 98 mL Pyridin.</li>
			<li>Fügen Sie 2-3 Tropfen von jedem Kaiser Lösungen für Probe und Wärme in kochendem Wasser für 5 Minuten testen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Nach erfolgreicher Kopplung der zweiten Aminosäure, die Kaiser-Test durchführen und wenn Negative Deprotection Protokoll (Schritte 2.1.3 zu 2.1.5) fortsetzen. Wiederholen Sie den Vorgang mit der Fmoc-Phenylalanin-Aminosäure.<ol>
<li>Waschen Sie bei der Kopplung von allen Aminosäuren das Harz für 1 min mit 5 mL DMF, IPA, DMF, Methanol, Dichlormethan und Diethylether, nach jedem Waschen verwerfen das Lösungsmittel. Das Harz zur Weiterverarbeitung zu speichern.</li>
			<li>Verwenden Sie die Hälfte des Harzes für die nächsten Schritte (2.1.7-2.1.9) um das Peptid mit FITC ändern. Um unveränderte KYF Tripeptid zu erhalten, folgen Sie den Anweisungen ab 2.1.10.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ändern Sie die N-terminalen Aminosäure von KYF KYF-N3 mit 6-Azidohexanoic Säure. Zu diesem Zweck mix 1 g (0,382 Mmol) von KYF Wang Harz und 120,1 mg (0.764 Mmol) 6-Azidohexanoic Säure mit 245,2 mg (0.764 Mmol) aus TBTU und 197,1 mg (1.528 Mmol) DIPEA in 30 mL DMF. Rühren Sie die Reaktion über Nacht bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Die Synthese von KYF-N-3 mit Propargyl Fluorescein per Klick Reaktion KYF-FITC einzuholen. Mischen Sie zu diesem Zweck 253 mg (0.097 Mmol) der KYF-N3 Wang Harz mit 3,78 mg (0.019 Mmol) CuI solide, 71,9 mg (0.193 Mmol) Propargyl Fluorescein und 2,24 mg (0.017 Mmol) DIPEA. Die Reaktion sollte seine Farbe von grün bis braun ändern.</li>
		<li>Waschen Sie nach 24 h das Harz für 1 min abwechselnd mit 5 mL DMF und IPA fünfmal, Methanol und Wasser dreimal, DMF und Wasser dreimal, und mit Dichlormethan und Diethylether dreimal. Entsorgen Sie das Lösungsmittel nach jedem Waschen.</li>
		<li>Cleave KYF-FITC oder KYF Peptid aus dem Harz mit einer Lösung aus Trifluoroacetic Säure (TFA) / Triisopropylsilane (Tipps) / h2O im Verhältnis des 95/2.5/2.5 mehr als 3 Stunden.</li>
		<li>Überstürzen Sie das rohe Peptid in einer kalten Diethylether, dreimal mit kalten Äther waschen, und dann trocknen unter Vakuum.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Synthese von FITC-KYF-stabilisierten Nanoemulsion mit Pt(II) (FITC-KYF-Pt-NE) und KYF-Pt-NE<ol>
<li>10 mg (0.0126 Mmol) der Ölsäure acids–Pt(II) Konjugat in 1,5 mL Isopropanol und Ort in einer 5 mL Spritze auflösen.</li>
		<li>Legen Sie die Spritze mit Ölsäure acids–Pt(II) Konjugat in eine Spritzenpumpe und den Fluss auf 0,1 mL/min festgelegt.</li>
		<li>Um die FITC-KYF-Pt-NE zu synthetisieren, 1 mg (0.00105 Mmol) FITC-KYF und 1 mg (0.00219 Mmol) KYF auflösen (1:2 molare Verhältnis von FITC-KYF:KYF) in 20 mL Wasser und stellen Sie die Temperatur der Lösung auf 37 ° C. Bedecken Sie die Wände des Behälters mit Alu-Folie, Immunofluoreszenz FITC Fluorophor zu vermeiden. Um dem KYF-Pt-NE zu synthetisieren, 2 mg (0.0044 Mmol) von KYF Tripeptid in 20 mL Wasser auflösen und die Temperatur der Lösung auf 37 ° C.</li>
		<li>Fügen Sie die Ölsäure acids–Pt(II) Konjugat tropfenweise zur Lösung der FITC-KYF/KYF oder KYF Tripeptid. Führen Sie diesen Schritt unter der Haube.</li>
		<li>Rühren Sie die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur, organische Lösungsmittel verdunsten und ermöglichen die Selbstmontage der FITC-KYF-Pt-NE oder KYF-Pt-ne</li>
		<li>FITC-KYF-Pt-NE oder KYF-Pt-NE in einem zentrifugalen Konzentrator zu konzentrieren (10k MWCO), und dreimal mit 4 mL Nanopure Wasser waschen.</li>
		<li>Lagern Sie die wässrigen Lösungen von KYF-Pt-NE und FITC-KYF-Pt-NE bei 4 ° c</li>
		<li>Platin mit Atomabsorptionsspektroskopie (AAS), nach der Hersteller Handbuch48Inhalte analysieren.<ol>
<li>Die Eichkurve Platin Normen in 10 % HCl Lösung vorbereiten (effektive Reichweite für AAS liegt zwischen 100 bis 1.200 ppb (Teile pro Milliarde)).</li>
			<li>Lösen Sie 50 µL KYF-Pt-NE Lösung von Schritt 2.2 in 100 µL Aqua Regia (eine Mischung aus konzentrierter Salzsäure und Salpetersäure mit 3:1) und lassen Sie über Nacht bei Raumtemperatur. Fügen Sie 850 µL Wasser zu einem endgültigen Probenvolumen von 1 mL zu erreichen. Analysieren Sie die Probe mittels AAS. Die endgültige Säurekonzentration sollte 10 % in allen untersuchten Proben.</li>
			<li>Aufzeichnung der Lesung des Pt-Konzentration in ppb und den endgültigen Platin Inhalt in der Probe (Konto für Probenverdünnung und Ausgangsvolumen der Nanoemulsion) zu berechnen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) confocal Imaging der zellulären Aufnahme von FITC-KYF-Pt-NE
<ol><li>Samen 6 Eierstock-Krebs-Zelllinien (A2780, CP70, SKOV3, OV90, TOV21G und ES2), in 4 Brunnen-Kammer konfokale Gerichte an der Dichte von 4,7 x 104 -Zellen pro Kammer und Pre-Kultur über Nacht bei 37 ° C.</li>
	<li>Nach 24 h, waschen Sie die Zellen dreimal mit Phosphat Puffer Kochsalzlösung (PBS) und inkubieren Sie mit FITC-KYF-Pt-NE im Zellkulturmedium (siehe Schritt 6.1 für Zelle spezifische Details Linie) für 15 min bei 37 ° C.</li>
	<li>Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.</li>
	<li>Befestigen Sie die Zellen mit kaltem Methanol für 5 min bei-20 ° C und drei Mal mit 1 mL PBS waschen.</li>
	<li>Permeabilize der Zellen mit 1 mL 0,1 % Triton-X für 10 min bei Raumtemperatur und waschen dreimal mit 1 mL PBS.</li>
	<li>Inkubation der Zellen für 90 min mit LAMP1 Antikörper konjugiert mit Alexa Fluor 647 (1 mL) bei 01:50 Verdünnung mit PBS-Puffer bei Raumtemperatur. Als nächstes waschen Sie die Zellen 3 Mal mit PBS.</li>
	<li>Verdünnen Sie DAPI-Stammlösung (1 mg/mL) auf 1 mg/mL in PBS. Dann fügen Sie 1 mL der verdünnten Lösung zu jeder Kammer und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit PBS.</li>
	<li>Montieren Sie auf einer Folie mit Eindeckmedium Deckgläsern.</li>
	<li>Bild der Zellen mittels live Zelle confocal Mikroskop bei Erregung Wellenlänge von 405 nm, 488 nm und 633 nm. Die Erkennung-Parameter wie folgt eingestellt: Laserleistung von 0,2 % und nicht mehr als 1 %, Pinole 1 luftig Einheit gewinnen Meister 650-750, Digital Offset 0.</li>
	<li>Bild im imaging-Software öffnen. Unter angezeigte Bild wählen Sie Grafiken und Einfügeleiste Skala, der Maßstab für das Bild einfügen.</li>
</ol>4. Freigabe Medikamentenstudien
<ol><li>Führen Sie Freigabe Medikamentenstudien in PBS. Die pH-Werte der drei PBS-Puffer 7,4, 6.8 und 5.0 bzw. anpassen.</li>
	<li>5 μL der KYF-Pt-NE in 180 μL der entsprechenden pH-PBS-Puffer verdünnen, transfer zum 3,5 kDa MWCO Mini Dialyse Tasse und Inkubation bei 37 ° C mit PBS-Puffer.</li>
	<li>Puffer aus jeweils drei Mini-Dialyse Rohre bei 2, 4, 6, 24, 48 und 140 h entfernen und die Platin-Konzentrationen von AAS zu messen. Alle Proben gemäß Schritt 2.2.8 vorbereiten, aber der letzte Band der Probe zu 500 µL anpassen.</li>
</ol>(5) Zelle Kulturmethoden
<ol><li>Kultur-Zelle Linien A2780, CP70, SKOV-3, OV-90, TOV - 21G, ES-2 im Zellkulturmedium (DMEM) mit 10 % (A2780, CP70, SKOV-3, ES-2) oder mit 15 % (TOV - 21G, OV-90) fetalen bovine Serum (FBS), ergänzt mit L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin. Wachsen Sie alle Zellen in einer 5 % CO2und Wasser gesättigte Atmosphäre bei 37 ° C.</li>
	<li>3 x 105 Samenzellen in jedem 96-Well-Platte und Vorkultur über Nacht für in-vitro-Inkubation Experimente. Bereiten Sie die KYF-Pt-NE, Cisplatin und Carboplatin Lösungen in Wasser. Passen Sie die Konzentration der Pt(II) im KYF-Pt-NE um die Konzentration von Carboplatin und Cisplatin für jede Zelllinie zu entsprechen. 72 Stunden bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Bewerten Sie nach der Inkubation die zelluläre Lebensfähigkeit mit einer kolorimetrischen Assay (Zellproliferation MTT-Assay). Kurz, entfernen Sie Medium zu, und fügen Sie 110 μl 10 % MTT in Medium zu jedem gut und 2 h bei 37 ° c inkubieren Dann 100 μL Waschmittel in jede Vertiefung und 5 h bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Überprüfen Sie die Extinktion bei 570 nm mit Platte Leser. Analysieren Sie Ergebnisse mit statistischer Analyse mit Z-Test und P-Test.</li>
</ol>

Autoren müssen kein Interessenkonflikt besteht, offen zu legen.

Wichtige Schritte bei der Nanoemulsion Synthese gehören das molare Verhältnis der Substrate anpassen, Erhaltung Temperatur und Durchflussmenge Tarifsteuerung während Ölsäure acids–Pt(II) Zugabe und ausreichend Zeit für die Selbstmontage und Reinigung das Produkt mit einer zentrifugale Konzentrator Spalte. Diese Parameter beeinflussen die Größe und Morphologie der KYF-Pt-NE; Daher ist es besonders wichtig, das richtige molare Verhältnis pflegen und die synthetischen Bedingungen korrekt einstellen.
<p class="jove_conte...

In den letzten Jahren gab es ein wachsendes Interesse an der Technik von Nanopartikeln für biomedizinische Anwendungen wie Drug Delivery und Bioimaging1,2,3,4. Die Multifunktionalität von Nanopartikel-basierten Systemen erfordert oft unter Einbeziehung mehrerer Komponenten innerhalb einer Formulierung. Die Bausteine, die oft auf Lipide oder Polymeren basieren unterscheiden sich hinsichtlich ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften sowie ihrer Biokompatibilität und biologische Abbaubarkeit, was letztlich die Funktion der Nanostruktur1, beeinträchtigt 5,6. Biologisch abgeleitete Materialien, wie Proteine und Peptide, wurden lange als viel versprechende Komponenten von multifunktionalen Nanostrukturen aufgrund ihrer Sequenz Flexibilität7,8anerkannt. Peptide, die selbst-zusammenbauen in hochgeordnete supramolekularen Architekturen bilden spiralförmige Bänder9,10, faserigen Gerüste11,12und viele mehr, und ebnete damit den Weg zu Haus Biomolekül-basierten Hybrid Nanostrukturen mit einem Bottom-up-Ansatz13.
Peptide wurden für Anwendungen in Medizin und Biotechnologie, vor allem für die Krebstherapie14 und Herz-Kreislauf-Krankheiten15 sowie für antibiotische Entwicklung16,17, metabolische untersucht Störungen18und Infektionen19. Es gibt über hundert kleinen Peptid-Therapeutika, die in klinischen Studien20. Peptide sind einfach zu ändern und schnell, kostengünstig zu synthetisieren. Darüber hinaus sind sie biologisch abbaubar, das erleichtert ihre biologische und pharmazeutische Anwendungen21,22. Die Verwendung von Peptiden als strukturelle Komponenten umfasst das Engineering von responsive, Peptid-basierte Nanopartikel und Hydrogel Depots für kontrollierte Freisetzung23,24,25,26 , 27, Peptid-basierte Biosensoren28,29,30,31, oder Bio-elektronische Geräte32,33,34. Wichtig ist, fanden sich auch kurze Peptide mit zwei oder drei Aminosäure-Resten, die Phenylalanin enthalten, führen die Selbstmontage35,36,37 verarbeitet und stabilisierte Emulsionen38 zu schaffen .
Platin-basierte Medikamente, aufgrund ihrer hohen Wirksamkeit in vielen Krebs-Behandlungsschemata, sowohl allein als auch in Kombination mit anderen Agenten39,40eingesetzt. Platin Verbindungen verursachen DNA-Schäden durch die Bildung von Interstrand, Monoadducts bzw. Intrastrand Querverbindungen. Die Pt-DNA-Läsionen sind durch die zelluläre Maschinerie erkannt und wenn nicht repariert, zu zellulären Apoptose führen. Der wichtigste Mechanismus, den PT(II) zum Krebs Zelltod beiträgt ist die Hemmung der DNA-Transkription41,42. Allerdings sind die Vorteile von Platin-Therapie durch systemische Toxizität des Pt(II) verringert, die schweren Nebenwirkungen auslöst. Dies führt zu niedrigeren klinische Dosierung von Pt(II)43, führt oft zu Sub-therapeutische Konzentrationen von Platin erreichen die DNA. Infolgedessen trägt die DNA-Reparatur, die folgt, Krebs Zelle überleben und den Erwerb von Pt(II) Widerstand. Die Platin Chemo-Widerstand ist ein großes Problem in der Anti-Krebs-Therapie und die Hauptursache für Behandlung Scheitern44,45.
Wir haben eine stabile Nanosysteme entwickelt, die den Pt(II)-Agent um eine Schirmwirkung im systemischen Kreislauf versorgen und die Pt II-induzierten Nebenwirkungen zu vermindern kapselt. Das System basiert auf einem Ölsäure acids-Pt(II) Kern mit einem KYF Tripeptid bilden eine Nanoemulsion (KYF-Pt-NE)46stabilisiert. Die Bausteine der KYF-Pt-NE, die Aminosäuren der Tripeptid sowie die Ölsäure, haben den Status im allgemeinen erkannt als Safe (GRAS) mit Food and Drug Administration (FDA). KYF-Pt-NE wird mithilfe einer Nanoprecipitation Methode47vorbereitet. Kurz gesagt, wird die Ölsäure acids-Pt(II) Konjugat in einem organischen Lösungsmittel gelöst und dann tropfenweise zu einer wässrigen Lösung KYF (Abbildung 1) bei 37 ° C. Die Lösung wird für mehrere Stunden in Selbstmontage KYF-Pt-ne erlauben gerührt. Die Nanoemulsion wird in 10 kDa zentrifugale Konzentratoren konzentriert und dreimal mit Wasser gewaschen. Die chemische Modifizierung von KYF mit einem Fluorophor ermöglicht die Synthese von fluoreszierenden FITC-KYF-Pt-NE für biomedizinische Bildgebung geeignet.

<table><tbody><tr><td>2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborat (TBTU)</td><td>ANASPEC INC.:</td><td>AS-20376</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Konfokalschale mit 4-Well-Kammer</td><td>Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific</td><td>154526</td><td>Zur Bildgebung</td></tr><tr><td>von 6-Bromhexansäure</td><td>Chem-Impex INT' L INC.</td><td>24477</td><td>Click-Modifikation für Peptid</td></tr><tr><td>A2780</td><td>Großzügig zur Verfügung gestellt von Professor John Martignetti von The Mount Sinai Hospital</td><td>Ovarian cancer</td><td></td> cell line</tr><tr><td>Barnstead Nanopure</td><td>Thermo Fisher</td><td>D11901</td><td>Wasserfiltersystem</td></tr><tr><td>BÜCHI rotavapor R-3</td><td>Büchi</td><td>Z568090</td><td>Zur Lösungsmittelentfernung und Probentrocknung</td></tr><tr><td>Zentrifuge 5810 R</td><td>eppendorf</td><td>5811F</td><td>Für die Trennung von Platinkomplexen</td></tr><tr><td>Cis-DichlordiaminPlatin (II) 99%</td><td>Acros Organics</td><td>19376-0050</td><td>In-vitro-Tests</td></tr><tr><td>CP70</td><td>Großzügig durchgeführt von Professor John Martignetti von der</td><td>Ovarialkrebs-Zelllinie</td>des Mount Sinai Hospital <td></td></tr><tr><td>Digitales Wasserbad</td><td>VWR</td><td>97025-134</td><td>Zum Aufwärmen von Medien für die Zellkultur</td></tr><tr><td>Dynamische Lichtstreuung (DLS)</td><td>Brookhaven Instrument Corporation</td><td></td><td>Für Größenmessungen von Nanopartikeln</td></tr><tr><td>ES-2</td><td>ATCC</td><td>CRL-1978</td><td>Eierstockkrebs-Zelllinie</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99,79%</td><td>Chem-Impex INT' L INC.</td><td>00493</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Phe 4-Alkoxybenzylalkoholharz (0,382 meq/g),</td> <td>Chem-Impex INT" L INC.</td><td>01914</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98%</td><td>Alfa Aesar</td><td>H59730</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>HERACELL 150i CO2-Inkubator</td><td>Thermo Scientific Fisher</td><td></td><td>Inkubator</td></tr><tr><td>Hochdruck-Spritzenpumpe</td><td>New Era</td><td>1010-US</td><td>Für die Zugabe von Platinkomplexen in der Nanopartikelsynthese</td></tr><tr><td>Heizplatte/Rührer</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td>Zum Rühren und Erhitzen</td></tr> <tr><td>von ProbenLAMP-1 Antikörper (kojugiert mit Alexa Fluor 647)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-18821 AF647</td><td>Zur Bildgebung</td></tr><tr><td>N,N-Diisopropylethylamin (DIPEA)</td><td>Oakwood Chemical</td><td>005027</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Ninhydrin 99%</td><td>Alfa Aesar A10409</td><td></td><td>Kaiser Test</td></tr><tr><td>Ölsäure</td><td>Chem-Impex INT' L INC.</td><td>01421</td><td>Für die Platinkomplexsynthese</td></tr><tr><td>OV90</td><td>ATCC</td><td>CRL-11732</td><td>Eierstockkrebs-Zelllinie</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>Für die Zellwäsche</td></tr><tr><td>Permount Eindeckmedium</td><td>Fisher Chemical</td><td>SP15-100</td><td>Für die Bildgebung</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A92500</td><td>Kaiser Test</td></tr><tr><td>Phosphotungssäure</td><td>Fisher Chemical</td><td>A248-25</td><td>Negativfärbung für TEM</td></tr><tr><td>Piperidin 99%</td><td>BTC</td><td>219260-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>SPPS Platinum AAS Standardlösung</td><td>Alfa Aesar</td><td>88086</td><td>1000ug/ml für Kalibrierkurve</td></tr><tr><td>Propargylbromid 97%</td><td>Alfa Aesar</td><td>L10595</td><td>Für Alkinmodifikation von Fluorescein</td></tr><tr><td>Scientific biologischer Schrank</td><td>Thermo Scientific Fisher</td><td>1385</td><td>Biohaube für Zellkulturen</td></tr><tr><td>Selbstreinigendes Vakuumsystem</td><td>Welch</td><td>2028</td><td>Vakuumpumpe für Rotavapor</td></tr><tr><td></td><td>Silbernitrat Acros Organics</td><td>19768-0250</td><td>Cisplatin-Aktivierung</td></tr><tr><td>SKOV3</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td>Eierstockkrebs-Zelllinie</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>S313-1</td><td>Für die Platinkomplexsynthese</td></tr><tr><td>Zinn(II)-chlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208256</td><td>Test auf das Vorhandensein von Platin</td></tr><tr><td>TOV21G</td><td>ATCC</td><td>CRL-11730</td><td>Eierstockkrebs-Zelllinie</td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure 99% (TFA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06374</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Triisopropylsilan (TIPS)</td><td>Chem-Impex INT' L INC.</td><td>01966</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100ML</td><td>Für die Bildgebung</td></tr><tr><td>von Uraninpulver 40%</td><td>Fisher</td><td>Scientific S25328A</td><td>Für die Alkinmodifikation von Fluorescein</td></tr><tr><td>Vivaspin 20 (10000 MWCO)</td><td>Sartorious</td><td>VS2001</td><td>Für die Waschung und Kondensation von Nanopartikeln</td></tr><tr><td>VWR Inverses Mikroskop</td><td>VWR</td><td>89404-462</td><td>Für die Zellkulturüberwachung</td></tr></tbody></table>

ein tripeptid-stabilisierten nanoemulsion Ölsäure

A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid

Wir beschreiben eine Methode um eine Nanoemulsion bestehend aus einem Ölsäure acids-Pt(II) Kern und einer Lysin-Tyrosin-Phenylalanin (KYF) Beschichtung (KYF-Pt-NE) zu produzieren. KYF-Pt-NE Pt(II) bei 10 Gew.-% kapselt, hat einen Durchmesser von 107 ± 27 nm und eine negative Oberflächenladung. KYF-Pt-NE ist stabil im Wasser und im Serum und ist biologisch aktiv. Die Konjugation der Fluorophor, KYF ermöglicht die Synthese von einem fluoreszierenden Nanoemulsion die für biologische Bildgebung geeignet sind. Die Synthese von der Nanoemulsion wird in einer wässrigen Umgebung und die KYF-Pt-NE Formen über Self-assembly eine kurze KYF-Peptid und ein Konjugat Ölsäure acids-platinum(II) durchgeführt. Die Selbstmontage Prozess hängt die Temperatur der Lösung, das molare Verhältnis der Substrate und der Durchflussmenge des Substrats hinaus. Entscheidende Schritte umfassen Beibehaltung der optimalen rühren Rate während der Synthesis, genügend Zeit für die Selbstmontage bei schönem und Pre-Konzentration der Nanoemulsion allmählich in eine zentrifugale Konzentrator.

Vertreter TEM Bild von KYF-Pt-NE unter Verwendung dieses Protokolls ist in Abbildung 2Adargestellt. KYF-Pt-NEs sind sphärische Morphologie, gut verteilt, und einheitlich in der Größe. Der Kerndurchmesser des KYF-Pt-NEs, gemessen direkt von drei TEM Bilder mit einem Minimum von 200 Messungen durchgeführt, ist 107 ± 27 nm. Die hydrodynamische Durchmesser von KYF-Pt-NE, mit dynamischen Licht Spektroskopie (DLS), analysiert erwies sich 240 nm mit einem Polydisper...

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode um eine Nanoemulsion eine Ölsäure acids-platinum(II) Konjugat mit einer Lysin-Tyrosin-Phenylalanin (KYF) Tripeptid stabilisiert zu synthetisieren. Die Nanoemulsion Formen unter milden synthetischen Bedingungen über Self-assembly von der KYF und das Konjugat.

Ein Tripeptid-stabilisierten Nanoemulsion Ölsäure

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The ...

Angesichts der großen Auswahl an kurzen Peptidsequenzen kann diese Methode auf viele andere Nanopartikel-Designs erweitert werden. Peptidmodifikation kann das System für diagnostische Zwecke geeignet machen. Die Verkapselung von Krebsplatin zu Arzneimitteln mit biologisch abbaubarem, niedrig toxischem Stabilisierungsmittel ist für pharmazeutische Anwendungen von großer Bedeutung.Vorläufige In-vivo-Studien mit Eierstockkrebs sind vielversprechend und werden weiter untersucht. Zunächst 50 Milligramm Cisplatin in vier Millilitern reines Wasser bei 60 Grad Celsius aussetzen. Fügen Sie die Silbernitratlösung tropfenweise in die Cisplatin-Lösung und rühren Sie das Gemisch bei 300 bis 400 Umdrehungen pro Minute für zwei Stunden bei 60 Grad Celsius im Dunkeln.Danach verwenden Sie 10 Gewichtsprozent Salzsäure, um zu bestätigen, dass es keine freien Silberionen in Lösung gibt. Wenn sich bei Zugabe von Salzsäure kein zusätzliches Silberchlorid bildet, zentrieren Sie das Gemisch bei 3, 220-facher Schwerkraft für 10 Minuten. Dekantden Sie den Überstand und filtern Sie ihn durch einen 0,2 Mikrometer Spritzenfilter.Dann testen Sie das Filtrat auf Platin, indem Sie zwei bis drei Tropfen auf 10 zwei Chloridkristalle auftragen. Platin ist vorhanden, wenn die Suspension dunkelbraun oder orange wird. Als nächstes fügen Sie 13,3 Milligramm Natriumhydroxid in einem Milliliter Wasser in 94,2 Milligramm Suspension von Ölsäure in drei Milliliter Wasser bei 60 Grad Celsius hinzu.Rühren Sie die Mischung für zwei Stunden bei 60 Grad Celsius. Dann schalten Sie die Hitze aus und rühren Sie bei Raumtemperatur für 16 bis 24 Stunden, um das Rohprodukt als öligen, gelbbraunen Niederschlag zu erhalten. Zentrifugieren Sie das Reaktionsgemisch bei 3, 220-facher Schwerkraft für 10 Minuten, und entfernen Sie den Überstand.Trocknen Sie die Produkte auf einem Rotationsverdampfer bei 25 Grad Celsius. Das Rohprodukt in fünf Milliliter Acetonitril aussetzen, indem das Produkt durch Zentrifugation gewirbelt und zurückgewinnt. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang mindestens zwei weitere Male, um das reine Ölsäure-Platin-II-Konjugat als hellgelben Feststoff zu erhalten.Erstens, tränken Sie 5,7 Gramm Fmoc geschützt L-Phenylalanin funktionalisierte Wang Harz in 25 Milliliter Dimethylformamid für eine Stunde. Dann das Harz in 15 Milliliter 20%Piperidin in DMF für fünf Minuten einweichen, während es bei 80 RPM schüttelt, um das Amin zu de-schutzn. Das Harz abtropfen lassen und den De-Schutz 20 Minuten wiederholen.Waschen Sie das Harz anschließend mit DMF und Isopropylalkohol. Sobald der De-Schutz bestätigt wurde, fügen Sie Fmoc geschützte L-Tyrosin TBTU und DIPEA und rühren Sie die Mischung für 16 bis 24 Stunden, um Kopplung durchzuführen. Waschharz mit DMF und Isopropylalkohol.Führen Sie den Kaiser-Test durch und fahren Sie mit dem De-Schutz und der Wäsche fort, wie zuvor beschrieben. Paar und de-protect Fmoc geschütztLysin in der gleichen Weise. Waschen Sie das Harz anschließend mit DMF, IPA, Methanol, Dichlormethan und Diethylether.Legen Sie ein Gramm KYF-lagerisches Harz für die FITC-Modifikation beiseite. Das restliche Harz in 95% Trifluoressigsäure einweichen. 2,5% Triisopropylsilan und 2,5% Wasser für drei Stunden, um das Tripeptid aus dem Harz zu spalten.Das rohe Peptid mit auf 20 Grad Celsius gekühltem Diethylether ausfälten. Waschen Sie den Niederschlag dreimal durch Zentrifugation in 30 bis 40 Milliliter Portionen kalten Diethylethers und trocknen Sie ihn unter Vakuum. Als nächstes mischen Sie das restliche Gramm KYF-Harz mit 120,1 Milligramm 6-Acetohexansäure in 30 Milliliter DMF mit TBTU und DIPEA.Rühren Sie die Mischung für 16 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur, um das Azid modifizierte Tripeptid zu erhalten. Kombinieren Sie dann 253 Milligramm dieses Harzes mit 3,78 Milligramm festem Kupfer(I)iodid 71,9 Milligramm Propargylflorisean und 2,24 Milligramm DIPEA. Lassen Sie die Mischung reagieren, während sie für 24 Stunden schüttelt.Dann waschen Sie das FITC modifizierte KYF-Lagerharz gründlich. Den FITC modifizierten KYF aus dem Harz lassen und auf die gleiche Weise wie das unveränderte Tripeptid reinigen. Um mit der Vorbereitung der Nanoemoulsion zu beginnen, lösen Sie 10 Milligramm des Ölsäure-Platin-II-Konjugats in 1,5 Milliliter IPA auf.Zeichnen Sie diese Lösung in eine 5-Milliliter-Spritze, befestigen Sie eine 20-Meter-Nadel und montieren Sie die Spritze auf einer Spritzenpumpe über dem Reaktionsbereich. Stellen Sie die Spritzenpumpe auf 0,1 Milliliter pro Minute ein. Für eine Nanoemulsion mit FITC modifiziertem KYF, lösen Sie ein Milligramm FITC modifizierte KYF und ein Milligramm unverändertes KYF in 20 Milliliter Wasser auf.Für eine Nanoemulsion mit unverändertem KYF lösen Sie stattdessen zwei Milligramm KYF in 20 Milliliter Wasser auf. Erhitzen Sie die FITC-modifizierte oder unveränderte KYF-Lösung auf 37 Grad Celsius. Stellen Sie sicher, dass die KYF-Lösung bei etwa 400 Umdrehungen umrührt und dass die Spritze auf die Lösung ausgerichtet ist.Starten Sie dann die Spritzenpumpe, um mit dem Hinzufügen der Ölsäure Platin zwei Konjugat Tropfen klug zu beginnen. Nachdem das Konjugat hinzugefügt wurde, reduzieren Sie die Rührgeschwindigkeit auf 150 Umdrehungen pro Minute und lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen. Fahren Sie 16 bis 24 Stunden lang mit dem Rühren fort.Konzentrieren Sie dann das Nanoemultion in einer 10.000 Daltons Zentrifugalfiltereinheit. Waschen Sie die Nanoemulsion dreimal in einer Zentrifugalfiltereinheit mit vier Milliliter-Portionen Reinstwasser. Und dann speichern Sie es als wässrige Lösung bei vier Grad Celsius.Das Endprodukt ist opaleszierend für KYF-Nanopartikel und fluoreszierend für FITC-modifizierte Nanopartikel. Die Tröpfchen in einer Nanoemulsion, die mit unverändertem KYF hergestellt wurden, waren kugelförmig, gut dispergiert und relativ gleichmäßig. Basierend auf Transmissionselektronenmikroskopiebildern hatten die Kerne einen Durchmesser von etwa 107 Nanometern.Die FITC-modifizierte Nanoemulsion, die hier grün erscheint, könnte in Zellen aus verschiedenen Eierstockkrebszelllinien eindringen. Während der hydrodynamische Durchmesser beider Formulierungen während der viermonatigen Lagerung im Wasser zunahm, blieben die Gesamtabmessungen erhalten. Darüber hinaus wurde nach einem Tag der Inkubation in 20% fetalem Rinderserum keine Opsonisierung der Emulsion beobachtet.Die Freisetzung von Platin aus der Emulsion war am langsamsten bei pH 7,4 mit nur 20,8% des Platins, das nach vier Stunden freigesetzt wurde. Die Platinfreisetzung beschleunigte sich, als der pH-Wert abnahm. Die platinhaltige KYF-beschichtete Nanoemulsion reduzierte die Lebensfähigkeit dieser Eierstockkrebszelllinien in einem viel größeren Maße als carboplatin, das klinisch relevante Analog.Die Nanoemulsion zeigte auch eine vergleichbare oder größere Verringerung der Lebensfähigkeit als Cisplatin in fünf der sechs Zelllinien. Die KYF-beschichtete Nanoemulsion führte durchweg zu einer vergleichbaren oder größeren Verringerung der Lebensfähigkeit als das Oleicsäure-Platin-II-Konjugat allein. Dies ist eine einfache, effiziente Methode zur Verkapselung hydrophober Therapeutika in das Nanopartikelgerüst der Tripeptidbasis.Kurze Peptide sind biologisch abbaubar und haben eine geringe Toxizität, was für die Medizin und Biotechnologie von Bedeutung ist. Führen Sie dieses Verfahren unter der Dunstabzugshaube durch, um eine Exposition gegenüber organischen Lösungsmitteln zu vermeiden. Platinölsäure und KYF Platin-Nanoemulsionen haben Krebsschutzeigenschaften und sollten daher mit besonderer Sorgfalt behandelt werden.Diese Methode ist einfach in Bezug auf niedrige Filabilator Aktivität und Ausrüstung, aber es stützt sich auf die ordnungsgemäße Anwendung der Synthesestrategie, und zugrunde liegende chemische Konzepte. Unsere Methode kann erweitert werden, um andere kleine Wirkstoffmoleküle zu liefern. Der Nanopartikelkern besteht aus Ölsäure und eignet sich daher für die Verkapselung hydrophober Wirkstoffe.

a-tripeptide-stabilized-nanoemulsion-of-oleic-acid

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Phase-shift Nanoemulsionen (PSNE) kann verdampft mit hoher Intensität fokussierter Ultraschall, um lokale Erwärmung und zur Verbesserung thermischen Ablation von Tumoren sein. In diesem Bericht wird die Herstellung von stabilen PSNE mit einer engen Größenverteilung beschrieben. Darüber hinaus wird der Einfluss des verdampften PSNE auf Ultraschall-vermittelte Ablation im Gewebe-ähnlichen Phantomen demonstriert.

Synthese von Phase-shift Nanoemulsionen mit enger Größenverteilung für Acoustic Droplet Vaporisation und Bubble-enhanced Ultraschall-vermittelte Ablation

Wir beschreiben die Herstellung und Charakterisierung von Nanopartikeln und Mikropartikeln aus Poly(milchsäure-co-glykolsäure) unter Verwendung von Vitamin E-TPGS als Emulgator. Durch Variation von Formulierungsparametern, wie z. B. der Emulgatorkonzentration, ist es möglich, Nanopartikel mit mittleren Durchmessern von 220 nm bis 1,98 μm herzustellen.

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Wir berichten über eine intelligente Anwendung von Kohlenstoffnanoröhren zur kinetischen Stabilisierung von Lipidpartikeln, die selbstorganisierte Nanostrukturen in ihren Kernen enthalten. Die Herstellung von Lipidpartikeln erfordert relativ geringe Konzentrationen von Kohlenstoffnanoröhren, die ihren Einsatz in biomedizinischen Anwendungen wie der Verabreichung von Medikamenten ermöglichen.

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Die Schlüsselschritte der lebenden anionischen Polymerisation von Phenylglycidylether (PheGE) auf Methoxypolyethylenglykol (MPEG - b -PPheGE) beschrieben. Die resultierenden Blockcopolymermizellen (BCMs) wurden unter physiologisch relevanten Bedingungen wurde mit Doxorubicin 14% (wt%) und eine verzögerte Freisetzung des Arzneimittels über 4 Tage geladen erhalten.

Die anionische Polymerisation eines amphiphilen Copolymer zur Herstellung von Blockcopolymermicellen Stabilisiert durch π-π-Stapelwechselwirkungen

Um Krebsmedikamente mit hoher Spezifität und reduzierten Nebenwirkungen an Tumorstellen zu bringen, sind neue Methoden auf Basis von Nanopartikeln erforderlich. Hier beschreiben wir disulfidvernetzte Mizellen, die durch Wasserstoffperoxid-vermittelte Oxidation leicht hergestellt werden können und in der Lage sind, unter einer reduzierenden Tumorumgebung effizient zu dissoziieren, um Nutzlasten freizusetzen.

Eine leichte und effiziente Ansatz für die Produktion von Reversible Disulfid Vernetzte Mizellen

Liposomen mit Single-Kette amphiphilen, weisen insbesondere Fettsäuren unterschiedliche Eigenschaften im Vergleich zu den enthaltenden Diacylphospholipids aufgrund der einzigartigen chemischen Eigenschaften der einzelne Kette amphiphilen. Hier beschreiben wir Techniken für die Vorbereitung, die Reinigung und die Verwendung von Liposomen bestehen teilweise oder ganz von diesen amphiphilen.

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Diese Studie beschreibt die klassische Hydratation mit der Dünnschichtmethode zur Nanoliposomenpräparation, gefolgt von der Nanopartikelcharakterisierung. Ein 47 kDa-hydrophiles und kugelförmiges Protein, Tarin, wird erfolgreich als Strategie zur Verbesserung der Stabilität verkapselt, schnelle Clearance vermieden und eine kontrollierte Freisetzung gefördert. Die Methode kann an hydrophobe Moleküle angepasst werden.

Vorbereitung und Charakterisierung von Nanoliposomen zur Entrapment ierung bioaktiver hydrophiler Globularproteine

Öle, die für die Verabreichung von Medikamenten verwendet werden, können das Lipidprofil von Patienten stören, was bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen unerwünscht ist. Omega-3-Fettsäuren-reiche Öle sind eine gesunde Alternative zu herkömmlichen Ölen und haben ein enormes Potenzial für selbstemulgierte Drug-Delivery-Systeme.

Selbst-Nanoemulgierung von gesunden Ölen zur Verbesserung der Löslichkeit lipophiler Arzneimittel

Um effiziente Adjuvantien rational zu gestalten, haben wir die Poly-Milchsäure-Co-Glykolsäure-Nanopartikel-stabilisierte Pickering-Emulsion (PNPE) entwickelt. Das PNPE besaß eine einzigartige Weichheit und eine hydrophobe Schnittstelle für einen potenten zellulären Kontakt und bot eine Antigenladung mit hohem Gehalt, was die zelluläre Affinität des Abgabesystems zu Antigen-präsentierenden Zellen verbesserte und eine effiziente Internalisierung von Antigenen induzierte.

Zelluläre Affinität der partikelstabilisierten Emulsion zur Förderung der Antigeninternalisierung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Oktanol-unterstützte Liposomenassemblierung (OLA), eine mikrofluidische Technik zur Erzeugung biokompatibler Liposomen. OLA produziert monodisperse, mikrometergroße Liposomen mit effizienter Verkapselung, die sofortige On-Chip-Experimente ermöglichen. Dieses Protokoll soll sich besonders für die synthetische Biologie und die synthetische Zellforschung eignen.

On-Chip-Oktanol-gestützte Liposomen-Assemblierung für die Biotechnologie

In diesem Protokoll haben wir eine mit einer kationischen Nanoemulsion verkapselte Retinsäure (RA) entwickelt, die als Adjuvans verwendet werden kann, um antigenspezifische systemische und mukosale Reaktionen zu fördern. Durch die Zugabe der von der FDA zugelassenen RA zur Nanoemulsion wurde antigenspezifisches sIgA in der Vagina und im Dünndarm nach intramuskulärer Injektion der Nanoemulsion gefördert.

Kationische Nanoemulsions-verkapselte Retinsäure als Adjuvans zur Förderung von OVA-spezifischen systemischen und mukosalen Reaktionen

Erfahren Sie die Synthese einer tripeptid-stabilisierten Nanoemulsion mit Ölsäure-Platin(II)-Konjugat für die Arzneimittelverkapselung. Diese Methode ermöglicht biologisch abbaubare Wirkstofffreisetzung bei Eierstockkrebs.

Ein Tripeptid-stabilisierten Nanoemulsion Ölsäure

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