Name: Analyse von Sauerstoff-Verbrauch im primären kultivierten Maus neonatale Herzzellen mit einer extrazellulären Flux-Analyzer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Lernen Sie die Analyse des Sauerstoffverbrauchs in primären neonatalen Maus-Kardiomyozyten mit einem extrazellulären Flux-Analyzer. Diese Methode ermöglicht die Bewertung mitochondrialer Funktion in der Kardiologie.

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Wir möchten alle Ross Lab und Murphy Lab Mitgliedern danken. Diese Arbeit wird unterstützt durch die American Heart Association (14SDG17790005), Y.C NIH (HL115933, HL127806) und VA Verdienst (BX003260), R.S.R.

Für die Arbeit mit Neugeborenen Mäusen Bitte verweisen auf lokale Hochschulinstitut Leitlinien Satz her durch die Pflege der Tiere-Programme und die institutionellen und anderen einschlägigen Bestimmungen einhalten. Alle in diesem Protokoll beschriebene Methoden wurden von der UC San Diego institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt und Bundes- und einzelstaatlichen Vorschriften einhalten.
1. Vorbereitung der Reagenzien
<ol><li>25 mL Pre Aufschlusslösungvorbereiten: HBSS (ohne Ca2 + und Mg2 +) ergänzt mit Trypsin (0,5 mg/mL). Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,22 µm-Filter und halten Sie auf dem Eis bis zur Verwendung. Stellen Sie vor Aufschlusslösung am Tag des Experiments. Hinweis: Es ist wichtig, HBSS ohne Ca2 + zu verwenden und Mg2 +, als Ca2 + und Mg2 + bewirkt Myozyten Kontraktion und anschließende Zelltod während der Isolation.</li>
	<li>30 mL Kollagenase Verdauung Puffervorzubereiten: Kollagenase (0,8 mg/mL, ca. 350 U/mL) in HBSS (ohne Ca2 + und Mg2 +) Puffer gelöst. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,22 µm-Filter und halten Sie auf dem Eis bis zur Verwendung. Kollagenase Aufschlusslösung am Tag des Experiments zu machen.</li>
	<li>500 mL Cardiomyocyte Nährmedien (Wachstumsmedien)vorbereiten: 375 mL DMEM, 125 mL M-199, 25 mL Pferd Serum und 12,5 mL FBS vermischen. Ergänzen Sie mit 1 % Penicillin und Streptomycin 1 % ige Lösung.</li>
	<li>Mitochondriale Stresstest Mediumvorbereiten: machen 200 mL DMEM basierte Stresstest Medium (DMEM ohne Nahco33, siehe Tabelle der Materialien) mit 1 mM Natrium Pyruvat, L-Glutamin, 2 mM und 10 mM Glukose und 2 mM Hepes ergänzt. Hinweis: 1 L des Mediums mit DMEM ohne Natrium Pyruvat, L-Glutamin, Glukose und Hepes, Filer steril, erstellen und speichern bei 4 ° C. Bereiten Sie das Stresstest-Medium am Tag des Tests durch das Hinzufügen von anderen Reagenzien. Mit DMEM ist Medium ohne Nahco33 kritisch.</li>
	<li>PH-Wert des mitochondrialen Stresstest Medien auf 7,4 am Tag der Nutzung anpassen. Warmen Medien auf 37 ° C vor dem Gebrauch.</li>
	<li>Oligomycinvorbereiten: 5 mL einer 5 mM Vorratslösung in DMSO vorbereiten, machen 250 µL-Aliquots und Lagerung bei-20 ° C.</li>
	<li>FCCPvorbereiten: 5 mL einer 5 mM Vorratslösung in DMSO vorbereiten, machen 250 µL-Aliquots und Lagerung bei-20 ° C.</li>
	<li>Antimycin Avorzubereiten: 5 mL einer 5 mM Vorratslösung in DMSO vorbereiten, machen 250 µL-Aliquots und Lagerung bei-20 ° C.</li>
	<li>Rotenonvorbereiten: 5 mL einer 5 mM Vorratslösung in DMSO vorbereiten, machen 250 µL-Aliquots und Lagerung bei-20 ° C. Hinweis: Alle Reagenzien und Lösungen, die in diesem Protokoll verwendeten sind in Tabelle 1aufgeführt.</li>
</ol>(2) Ernte- und Pre-Verdauung von Herzen von neugeborenen Mäusen (Tag 1)
<ol><li>Autoklaven-Schere, Pinzette und Moria Löffel zu sterilisieren.</li>
	<li>Führen Sie alle Schritte in der Zelle-Kultur-Haube für Sterilität.</li>
	<li>Aliquoten 5 mL HBSS (ohne Ca2 +, Mg2 +) in jede Vertiefung eine 6-Well Zellplatte Kultur; auf Eis legen. Aliquoten 10 mL HBSS in einer Kulturschale 10 cm Zelle.</li>
	<li>20 mL Trypsin Pre Aufschlusslösung in einem 50 mL sterile konische Rohr vorzubereiten. Halten Sie alle Lösungen auf Eis.</li>
	<li>Tauchen Sie schnell Neugeborenen (Tag 0) Mäuse in 70 % Ethanol-Lösung für die Sterilisation.</li>
	<li>Welpen mit steriler Schere (gerade) ohne Narkose zu enthaupten, und Brust entlang dem Brustbein Zugriff auf der Brusthöhle und das Herz öffnen. (Abbildung 1A) Hinweis: 1) ist es wichtig, P0 neugeborene Mäusen zu verwenden, um hohe Zellenentwicklungsfähigkeit zu erreichen. (2) dieses Euthanasie-Verfahren ist für Neugeborene nach NIH und der American Veterinary Medical Association Leitlinien 17zulässig.</li>
	<li>Herz aus dem Körper zu extrahieren, mit einer feinen Schere und Transfer sofort in der sterilen Zelle Kulturschale mit HBSS (ohne Ca2 +, Mg2 +) (Abbildung 1 b).</li>
	<li>Entfernen Sie alle verbleibenden Lungengewebe, größere Schiffe, etc. (und Atrien, falls gewünscht). Waschen Sie Herzen in die HBSS-Lösung mit sanfter Bewegung.</li>
	<li>Schneiden Sie jedes Herz mit einer feinen Schere in 8 Stücke und übertragen Sie alle Herzgewebe mit der Pinzette in einen Brunnen von einer 6-Well Kultur Zellplatte mit HBSS (Abbildung 1 und 1 D).</li>
	<li>Waschen Sie die Herzen durch die Übertragung der Herzen von Brunnen zu Brunnen in der 6-Well-Platte voller HBSS, mit einem Löffel Moria (Abbildung 1). Hinweis: Übertragen die Herzen von Brunnen zu Brunnen, ist genug, um das Blut zu waschen. Da Blut enzymatische Verdauung stört ist es wichtig, die Herzen mit HBSS waschen und Blut zu entfernen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Herzen mit einem Löffel Moria in einer konischen Röhrchen mit 20 mL Trypsin (0,5 mg/mL) und inkubieren Sie mit sanften Agitation bei 4° C für 4 h (Abbildung 1E).</li>
</ol>3. bereiten Sie eine Kultur 96-Well-Platte (Tag 1)
<ol><li>5 mL der Beschichtungslösung vorbereiten: PBS mit 0,5 % Gelatine (Autoklav vor Gebrauch) und 1 % Fibronektin Lösung. (z.B. 5 mL Gelatine-Lösung plus 50 µL Fibronektin-Lösung)</li>
	<li>Aliquoten 50 µL der Beschichtungslösung in jede Vertiefung der 96-Well Zellplatte Kultur (siehe Tabelle der Materialien). Wenn Bläschen vorhanden sind, entfernen Sie sie mithilfe einer Pipette 20 µL Luftblasen heraus zu saugen. Hinweis: Es ist wichtig, die Oberfläche von jedem Bohrloch mit Beschichtungslösung decken.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Platte in einem 37 ° C Zelle Kultur Inkubator für 1 h oder mehr, um die Matrix-Beschichtung trocknen lassen.</li>
	<li>Aspirieren Sie jede verbleibende Beschichtungslösung vor der Aussaat Kardiomyozyten.</li>
</ol>(4) enzymatische Verdauung und Beschichtung von Zellen (Tag 1)
<ol><li>Wärmen Sie Kollagenase Aufschlusslösung im Wasserbad 37 ° C vor. Hinweis: Dieser Schritt ist wichtig für effiziente enzymatische Verdauung zu erreichen ist.</li>
	<li>Das konische Rohr mit Herzen und Pre Aufschlusslösung von 4 ° C zu einer Zelle Kultur Haube zu bewegen. (Abb. 1F)</li>
	<li>Lassen Sie die Herzen auf den Boden des Rohres sinken und entfernen Sie die Pre-Verdauung-Lösung mithilfe einer serologischen 10 mL-Pipette (1 bis 2 mL des Mediums Isolierung verbleiben in der Röhre).</li>
	<li>Fügen Sie 10 mL HBSS in die Röhre. Wieder aussetzen die Herzen mit HBSS 2-3 Mal mit einer serologischen Pipette 10 mL Trypsin zu waschen. Aspirieren HBSS (1 bis 2 mL verbleiben in der Röhre).</li>
	<li>Fügen Sie 10 mL vorgewärmten Kollagenase Aufschlusslösung in das Rohr mit Herzen. (Abbildung 1)</li>
	<li>Inkubieren Sie das Rohr mit Herzen im Wasserbad 37 ° C für 10 min ohne Agitation (1. Verdauung).</li>
	<li>Verschieben Sie nach 1. Verdauung das Rohr in der Zelle-Kultur-Haube. Sanft genannte Herzen wieder aussetzen die Herzen in das Rohr sanft 10 Mal mit einer serologischen 10 mL-Pipette. Dadurch werden Herzen zu zerstreuen und Zellen von Herzgewebe freigegeben werden. (Abbildung 1 H) Hinweis: Da Kardiomyozyten sehr empfindlich sind, ist sanft Verreibung wichtig, hohe Rentabilität zu erreichen.</li>
	<li>Lassen Sie das unverdaute Gewebe sinken, verdaute Lösung angereichert in Herzmuskelzellen (ca. 9-10 mL), eine neue konische Rohr übertragen und sofort hinzufügen einer gleichen Menge von Zellkulturmedien, Kollagenase Verdauung zu stoppen.</li>
	<li>Hinzugeben Sie 10 mL Kollagenase Aufschlusslösung in das Rohr mit den restlichen unverdauten Herzgewebe.</li>
	<li>Das Rohr mit Herzgewebe im Wasserbad 37 ° C für 10 min inkubieren (2. Verdauung).</li>
	<li>Wiederholen Sie die Prozedur 4.7 und 4.8. Hinweis: Wiederholen Sie es gibt noch viel unverdautes Gewebe, Verdauung noch einmal. In den meisten Fällen sind jedoch zwei Verdauung genug, um die meisten Zellen von Herzgewebe zu zerstreuen.</li>
	<li>Legen Sie eine sterile Zelle-Sieb (100 µm-Nylon-Mesh) in eine neue sterile 50 mL konische Rohr. Vornässen der Zelle Sieb mit ca. 2-3 mL Zellkulturmedien und Zellen durch die Zelle-Sieb passieren. Spülen Sie die Zelle-Sieb mit ca. 2-3 mL Zellkulturmedien. (Abbildung 1I)</li>
	<li>Zentrifugieren Sie konischem Rohr mit Kardiomyozyten für 5 min bei 180 X g (Abbildung 1J). Abzusaugen Sie den überstand (Abbildung 1 K), die Zelle Gewebe Ablagerungen enthalten und wieder aussetzen der Zelle Pellet in 10 mL von Zellkulturmedien (Abbildung 1 L).</li>
	<li>Sanft Aufschwemmen der Zellen und Platte auf einer 10 cm Zelle Kulturschale (Kunststoff ohne jede Art von Beschichtung) und inkubieren Sie für 1 Stunde in eine Zelle Kultur Inkubator (1. Pre-Plating) (Abbildung 1 M). Pre-Beschichtung können nicht-Kardiomyozyten, wie Fibroblasten und Endothelzellen, zur Einhaltung der unbeschichteten Zellkultur-Schale. Hinweis: An dieser Stelle Kardiomyozyten sind in der Regel eine Runde Form und glänzend unter dem Mikroskop erscheinen. (Abbildung 1N).</li>
	<li>Nach 1 h Inkubation sanft schütteln Sie die Platte, waschen Sie nicht anhaftende Zellen (angereichert in Herzmuskelzellen) aus der Kulturschale 10 cm und wieder auszusetzen Sie Zellen durch wiederholt das Zellkulturmedium über das Gericht mit einer serologischen 10 mL-Pipette pipettieren. Dann übertragen Sie nicht anhaftende Zellen (angereichert in Herzmuskelzellen) in eine neue Zelle Kulturschale 10 cm (Kunststoff ohne jede Beschichtung) und inkubieren Sie für weitere 1 h in einer Zelle Kultur Inkubator (2. Pre-Beschichtung). Hinweis: Zellen, mit denen die nicht beschichteten Platte befestigt sind überwiegend nicht Kardiomyozyten: Fibroblasten und Endothelzellen, die unter dem Mikroskop (Abbildung 1O) visualisiert werden können.</li>
	<li>Nach 2. Pre-Beschichtung, sanft schütteln Sie die Platte, waschen Sie nicht anhaftende Zellen (Herzmuskelzellen) von 10 cm-Kulturschale, dann übertragen Sie die Herzzellen in ein neues 50 mL konische Röhrchen.</li>
</ol>5. zählen Zellen und Beschichtung in einer 96-Well Zellplatte Kultur (Tag 1)
<ol><li>Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer.</li>
	<li>Die Zellen in einer extrazellulären Matrix beschichtet 96-Well Kultur Zellplatte bei einer Dichte zwischen 10-30 x 103 Zellen/Brunnen mit einer Multi-Kanal-Pipette in einem Endvolumen von 200 µL (Abbildung 1 P) Platte. Verwenden Sie Brunnen A1, A12, H1 und H12 für Hintergrund: 200 µL Kulturmedium als andere Brunnen in diese Vertiefungen (keine Zellen) hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte in einem 37 ° C Zelle Kultur Inkubator. Hinweis: In dieser Studie wurde Sauerstoffverbrauch mittels unterschiedlichen Zelldichten z. B. 10 x 103, 20 x 103oder 30 x 103 Zellen/gut getestet. (Abbildung 2A). Auch, wie oben beschrieben, Herzmuskelzellen sofort nach Isolierung sind in der Regel eine Runde Form und glänzend unter dem Mikroskop erscheinen. Entwicklungsfähigen Zellen werden innerhalb von 16-24 h Kultur abflachen.</li>
</ol>6. Sauerstoff-Verbrauch-Assay mit einer 96-Well-Format extrazelluläre Flux Analyzer (Tag2)
Hinweis: Sauerstoff-Verbrauch-Assay kann einen Tag nach der galvanischen Zellen durchgeführt werden oder später. Neonatale Kardiomyozyten kultiviert unter Verwendung dieses Protokolls bis zu 7 Tage überleben kann, post isoliert.
<ol><li>Ein Flussmittel Analyzer Sensorkassette-Hydrat (siehe Tabelle der Materialien) für mindestens 3 Stunden, aber ideal für einen ganzen Tag vor dem Test. Fügen Sie 200 µL der Kalibrator Lösung (siehe Tabelle der Materialien) in den einzelnen Brunnen der Dienstprogramm-Platte wieder auf den Teller Dienstprogramm der Sensorkassette und brüten in einem 37 ° C Inkubator ohne CO2 oder O2 Ergänzung.</li>
	<li>Ändern Sie Zellkulturmedien in Mitochondrien Stresstest Medium eine Stunde vor dem Test. Herzmuskelzellen sind zerbrechlich. Daher vorsichtig entfernen Sie den Zellkulturmedien mithilfe einer Multi-Kanal-Pipette und waschen Sie die Zellen mit 200 µL vorgewärmten mitochondriale Stresstest Medien zweimal. Nach dem zweiten waschen fügen 175 µL vorgewärmten Mitochondrien Stresstest Medien und Kultur der Zellen in einem 37 ° C Inkubator ohne CO2 oder O2 Ergänzung.</li>
	<li>Konzentrierte Testverbindungen vorzubereiten. Mitochondrien-Stress-Test Vorbereitung 3,0 mL 16 µM Oligomycin, 9 µM FCCP und einer Mischung aus 20 µM Rotenon und 20 µM Antimycin A, alle im mitochondrialen Stresstest Medium. Hinweis: Jede Verbindung in der Konzentration beschrieben wurde getestet. Allerdings ist es notwendig, die Konzentration von jeder Verbindung im eigenen Labor titrieren.</li>
	<li>Laden Sie 25 µL jeder Verbindung in den Injektor Häfen der Sensorkassette mit einer Mehrkanal-Pipette (Abbildung 1Q). Das Volumen und die Endkonzentration sind in Tabelle 2beschrieben.</li>
	<li>Extrazelluläre Flux-Assay-Protokoll eingerichtet. Das Programm wird in beschrieben Tabelle 3.
</li>
	<li>Starten Sie das Programm. Legen Sie zuerst die Sensorkassette in die Maschine für die Kalibrierung (Abbildung 1R). Der Kalibrator für die Test-Platte zu ersetzen, sobald die Kalibrierung abgeschlossen ist. Hinweis: Mit der vom Hersteller mitgelieferten Software, geben Sie Gruppen von Brunnen und jede Verbindung und Port.</li>
	<li>Falls gewünscht, nach der Probe verwerfen Sie sorgfältig alle Assay Medium mithilfe einer Multi-Kanal-Pipette und speichern Sie die Zelle Kultur Mikrotestplatte bei-20 ° C für zukünftige Zelle Normalisierung mit Protein Assay.</li>
	<li>Protein-Inhalt zu messen. Fügen Sie 50 µL RIPA Zelle Lysis Standardlösung (siehe Tabelle der Materialien). Inkubieren Sie die Platte auf dem Eis für 30 min, voll Zellen lysiert. Übertragen Sie sämtliches Material auf eine neue klare Flachboden 96 gut Assay Platte.</li>
	<li>Messen Sie Proteinkonzentration von BCA-Test nach Hersteller Protokoll. Hinweis: Beschichtung des Brunnens mit extrazellulären Matrix führt zu einer hohen Proteinkonzentration in jede Vertiefung. Daher den Betrag der Hintergrund betreffendes (keine Zellen) tatsächliche Zelle Proteinkonzentration zu subtrahieren. Die Konzentration des Proteins abgeleitet von Zellen ist gering, in einer Kultur der 96-Well-Platte. Darüber hinaus variiert Proteinkonzentration von Brunnen zu Brunnen durch extrazelluläre Matrix Beschichtung. Daher empfiehlt sich mit Handynummer, um die OCR zu normalisieren.</li>
</ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

In dieser Studie haben wir ein einfaches Protokoll für die Isolierung und Kultivierung Maus neonatale Kardiomyozyten etabliert. Durch die Verwendung dieser Kardiomyozyten, haben wir auch die Voraussetzungen für die Sauerstoff-Verbrauch messen mit einem extrazellulären Flussmittel Analyzer System optimiert. Das Protokoll erlaubt verwenden Maus neonatale Kardiomyozyten als Modellsystem um zu untersuchen, wie verschiedene Faktoren Sauerstoffverbrauch in den wichtigsten arbeitenden Zellen des Herzens, vergleichbar mit, was i...

Um eine stetige kardiale kontraktile Funktion aufrecht zu erhalten, müssen die Herzzellen eine konstante Versorgung mit zellulären Energie hauptsächlich in Form von ATP1pflegen. Im Herzen entsteht etwa 95 % der ATP durch Mitochondrien, vor allem durch Oxidative Phosphorylierung, zeigt, dass Mitochondrien Herzfunktion2,3bioenergetische maßgeblich beteiligt. Unterstützen diese Vorstellung ist, dass Dysregulation der mitochondrialen Funktion zu Kardiomyopathie und Herzinsuffizienz4,5führen kann. Umgekehrt, Wiederherstellung der Funktion der Mitochondrien hat gezeigt, dass das Versagen der Herzfunktion verbessern Herz-6,7. Daher konnte studieren des Mechanismus der mitochondrialen Bioenergetik und Identifizierung neuartige Regulatoren der mitochondrialen Funktion in Kardiomyozyten verraten nicht nur mechanistische Einblicke der kardialen Energieerzeugung aber auch Einblick, der führt zur Entwicklung neuer therapeutischer Ziele zur Behandlung von Herz-Kreislauferkrankungen6,8.
Im Vergleich zu das ganze Herz, die enthält einer Mischungaus von Myozyten und nicht Myozyten9, Cardiomyocyte Kulturen sind hochrein, mit minimalen Kontamination von nicht-Myozyten aus dem Herzen, wie z. B. Fibroblasten und Endothelzellen10. Darüber hinaus ermöglicht isolieren Herzzellen von neugeborenen Welpen züchten eine große Anzahl von Zellen in einer kleinen Menge der Zeit, im Vergleich zu isolierenden Zellen von Erwachsenen Herzen10,11. Vor allem primäre kultivierten erwachsenen Maus Herzzellen haben kurze überleben Zeiten (z.B. 24 h) und auf längere Zeit de-Punkte unterscheiden. Neugeborenen Maus Herzzellen können überleben und für mehr als 7 Tage in der Kultur, wodurch sie ideal für die Prüfung der Auswirkungen der Wirkstoffe und Genmanipulation auf die Funktion der Mitochondrien in Kardiomyozyten10manipuliert werden. Natürlich gibt es biologische Unterschiede zwischen den Erwachsenen und Neugeborenen Zellen, aber die längere Dauer, die für Kultur neonatale Zellen macht sie geeignet für viele verschiedene Arten von Studien, einschließlich der Funktion der Mitochondrien.
Bisher wurden primäre kultivierte Neugeborene Maus und Ratte Kardiomyozyten als Modelle zur kardialen Bioenergetik12,13zu studieren. In den letzten Jahren verwendet Studien einen extrazelluläre Flux-Analysator Sauerstoff-Verbrauch (OCR) messen und auswerten oxidative Kapazität bei Maus und Ratte neonatale Kardiomyozyten14,15. Während mit Ratten verglichen, die Zellviabilität des Neugeborenen Maus Herzzellen ist niedriger und hat größere Variabilität16. Außerdem macht die Fähigkeit, Zellen aus gentechnisch veränderter Mausmodelle im Mausmodell Zelle sehr wichtig. Da die OCR-Studien so empfindlich auf Zell-Zahl und Dichte Aussaat sind, braucht man Entwicklung eines reproduzierbaren, zuverlässig und einfach Protokolls, konsequente Zellausbeute und Rentabilität zu erzielen.
Hier berichten wir über ein optimiertes Protokoll, das entwickelt worden ist die kultivierte Maus neonatale Herzzellen zusammen mit einem 96-Well-Format extrazelluläre Flux-Analysator für OCR-Analyse verwendet. Dieses Protokoll wird die Reproduzierbarkeit des Assays stark erhöht. Darüber hinaus das Protokoll nicht nur bietet eine neuartige und reproduzierbare Methode für OCR-Analyse, sondern könnte auch zu einer größeren Größe Kultur für andere experimentelle Zwecke, wie die möglicherweise notwendigen myofibrillären Funktionen zu studieren und intrazellulären angepasst werden Signalwege.
Dieses Protokoll beschreibt insbesondere eine eintägige Verfahren zur Isolierung und Kultur des Neugeborenen Maus Herzzellen in eine 96-Well Zellplatte Kultur. Darüber hinaus beschreibt es die Verfahren zur Messung der Sauerstoff-Verbrauch mit einem extrazellulären Flux-Analyzer. Alle Lösungen sind steril oder steril filtriert. Alle Werkzeuge werden mit 75 % igem Ethanol sterilisiert. Wir bieten eine Tabelle von Materialien für verschiedene Teile des Verfahrens. Für die Kultivierung von Kardiomyozyten, erfolgen alle Abläufe und Schritte in eine Standardzelle Kultur Kapuze. Dieses Protokoll ist für die Isolierung von Neugeborenen Mäuseherzen aus einem Wurf (ca. 8-10 Welpen) entwickelt. Das Protokoll kann jedoch auch zur Isolierung von Herzzellen aus mehreren Würfen angepasst.

<table><tbody><tr><td>Antimycin A</td><td>SIGMA</td><td>A8674</td><td>Hemmt den Komplex III der Mitochondrien</td></tr><tr><td>Zellsieb 100 &mu; m Poren</td><td>FALCON</td><td>352360</td><td>Zur Erfassung von unverdauter</td></tr><tr><td>Gewebe Kollagenase Typ II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>Zur Herstellung von Kollagenase-Aufschlusslösung</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>SIGMA</td><td>75351</td><td>Zur Herstellung von mitochodriellen Stresstests Medium</td></tr><tr><td>DMEM High Glucose</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>Zur Herstellung von Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>DMEM ohne NaHCO3, Glukose, Pyruvat, Glumanin und Hepes</td><td>SIGMA</td><td>D5030-10X1L</td><td>Zur Herstellung des mitochodnialen Stresstestmediums</td></tr><tr><td>FCCP (Carbonylcyanid 4-(trifluormethoxy)phenylhydrazon)</td><td>SIGMA</td><td>C2920</td><td>Entkoppelt die mitochondriale Atmung</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Life technologies</td><td>26140-079</td><td>Zur Herstellung von Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>Fibronektin aus Rinderplasma</td><td>SIGMA</td><td>F1141-5MG</td><td>Zur Herstellung von Beschichtungslösung für Gewebekulturplatten</td></tr><tr><td>Feine Schere</td><td>Fine Sciences Tools</td><td>14060-10</td><td>Zum Sezieren von Herzen</td></tr><tr><td>Gelatine aus Schweinehaut</td><td>SIGMA</td><td>G-1890</td><td>Zur Herstellung von Beschichtungslösung für Gewebekulturplatten</td></tr><tr><td>HBSS (Hank's balanced salt solution, ohne Ca2+, Mg2+)</td><td>Cellgro</td><td>21-022-CV</td><td>Zum Waschen von Herzen und zur Herstellung von Lösung für den Vorverdauungs- und Collagnase-Aufschluss</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td>Zur Herstellung eines mitochodnialen Stresstestmediums</td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>Life technologies</td><td>26050-088</td><td>Zur Herstellung eines Zellkulturmediums</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>SIGMA</td><td>G-3126</td><td>Zur Herstellung eines mitochodnialen Stresstestmediums</td></tr><tr><td>M-199</td><td>Cellgro</td><td>10-060-CV</td><td>Zur Herstellung von Zellkulturmedium</td></tr><tr><td>Moria Löffel</td><td>Fisher wissenschaftliche</td><td>NC9190356</td><td>Zum Waschen von Herzen&nbsp;</td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>SIGMA</td><td>75351-5MG</td><td>Hemmt die mitochondriale ATP-Synthase</td></tr><tr><td>RIPA-Puffer</td><td>Fisher scientific</td><td>89900</td><td>Zur Lyse der Zellen für den Proteinassay</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>SIGMA</td><td>R8875</td><td>Hemmt den Komplex I der Mitochondrien</td></tr><tr><td>Seepferdchen XFe96 Extrazellulärer Flux -Analysator</td><td>Agilent</td><td></td><td>Gerät zur Analyse der Sauerstoffverbrauchsrate</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102601-100</td><td>Packung mit Flussmittelanalysator-Kulturplatten, Sensorkartuschen und Kalibrant</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>SIGMA</td><td>P2256</td><td>Zur Herstellung von mitochodnialem Stresstestmedium</td></tr><tr><td>Gerade Schere Fine</td><td>Sciences Tools</td><td>91401-12</td><td>Zum Sezieren von Herzen</td></tr><tr><td>Spritzenfilter 0,2 & mu; m Größe</td><td></td><td></td><td>Für die Sterilfiltration von Aufschlussmedium</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>USB Corporation</td><td>22715 25GM</td><td>Zur Herstellung von Lösung vor dem Aufschluss</td></tr></tbody></table>

analyse von sauerstoff-verbrauch im primären kultivierten maus neonatale herzzellen mit einer extrazellulären flux-analyzer

Analyzing Oxygen Consumption Rate in Primary Cultured Mouse Neonatal Cardiomyocytes Using an Extracellular Flux Analyzer

Mitochondrien und oxidativen Stoffwechsel sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der Funktion des Herzmuskels. Forschung hat gezeigt, dass mitochondriale Dysfunktion ein wichtiger Faktor für beeinträchtigte Herzfunktion bei Herzinsuffizienz gefunden. Im Gegensatz dazu möglicherweise Wiederherstellung defekter mitochondriale Funktion wohltuende Wirkung auf die Verbesserung der Herzfunktion bei Herzinsuffizienz. Daher könnte die regulatorischen Mechanismen und Identifizierung neuer Regler für mitochondriale Funktion Einblicke die genutzt werden könnten, um neue therapeutische Zielstrukturen für die Behandlung von Herzkrankheiten zu entwickeln. Hier ist kardialen Myozyten mitochondriale Atmung mit einer einzigartigen Zellkultursystem analysiert. Zunächst wurde ein Protokoll optimiert, um schnell zu isolieren und hohe Rentabilität Neugeborenen Maus Herzzellen Kultur. Dann ist eine 96-Well-Format extrazelluläre Flussmittel Analyzer verwendet, um den Sauerstoff-Verbrauch von diesen Kardiomyozyten zu beurteilen. Für dieses Protokoll wir säen Bedingungen optimiert und demonstrierte, dass Neugeborenen Maus Herzzellen Sauerstoff-Verbrauch leicht in eine extrazelluläre Flux-Analysator beurteilt werden kann. Wir beachten, dass unser Protokoll auf eine größere Größe der Kultur auch kann und andere Studien, wie z. B. die intrazelluläre Signal- und kontraktile Analyse Funktion.

Mithilfe des Protokolls beschrieben, waren die Herzen von Tag 0 neugeborenen Welpen isoliert. 5 x 105 Zellen/Pup stammen, und Herzmuskelzellen bei dichten von 10 x 103, 20 x 103oder 30 x 103 Zellen/Brunnen, in 96-well-Platten (Abbildung 2A) ausgesät wurden. Nach Übernachtung Kultur fanden sich Kardiomyozyten Kunststoff beschichteten Oberfläche gut an und es gab sehr wenige ungebundene Zellen (ungebunden Zellen werde...

Dieses Protokoll soll veranschaulichen, wie zu verwenden Maus neonatale Kardiomyozyten als Modellsystem um zu untersuchen, wie verschiedene Faktoren Sauerstoffverbrauch im Herzen ändern können.

Analyse von Sauerstoff-Verbrauch im primären kultivierten Maus neonatale Herzzellen mit einer extrazellulären Flux-Analyzer

Mitochondria and oxidative metabolism are critical for maintaining cardiac muscle function. Research has shown that mitochondrial dysfunction is an ...

Dieses Protokoll ermöglicht es uns, hohe Bi-BBT zu isolieren und zu kulturieren, die nur Maus-Kardiomyozyten bekannt sind. Um die mitochondriale Funktion zu bewerten, kann die Sauerstoffverbrauchsrate von Kardiomyozyten mit einem tatsächlichen Silberflussanalysator analysiert werden. Einer der Vorteile dieser Technik ist, dass der Sauerstoffverbrauch von Kardiomyozyten leicht in ihrem Haftenzustand im 96-Well-Format gemessen werden kann, was das Testen mehrerer Bedingungen mit einer großen Anzahl von Replikationen ermöglicht.Dieses Schiff bietet wichtige Einblicke in den Forschungsbereich der Kardiologie. Neben dem Sauerstoffverbrauch können wir auch andere metabolische Parameter wie Graugrizen und Peracid-Epoxidation untersuchen. Die Erreichung einer hohen Variabilität von Kardiomyozyten ist für dieses Experiment von entscheidender Bedeutung.Dies erfordert eine effiziente Verdauung der Herzen. Da neonatale Kardiomyozyten sehr zerbrechlich sind, ist auch der schonende Umgang mit Kardiomyozyten wichtig. In der Zellkulturhaube, aliquot 5ml von HBSS zu jedem Brunnen einer 6-Well-Zell-Kulturplatte und legen Sie es auf Eis.Darüber hinaus aliquot 10ml HBSS zu einer 10cm Zellkulturschale, dann bereiten 20 ml Trypsin Predigestion Lösung in einem 50ml sterilen konischen Röhrchen. Halten Sie alle Lösungen auf Eis. Als nächstes extrahieren Sie das Herz und übertragen Sie es sofort auf die sterile Zellkulturschale, die HBSS enthält.Entfernen Sie alle verbleibenden Lungengewebe und größere Gefäße. Waschen Sie das Herz in HBSS mit sanfter Rührung. Anschließend das Herz mit einer feinen Schere in 8 Stücke schneiden und das Herzgewebe mit Zangen in einen Brunnen einer 6-Well-Zellkulturplatte mit HBSS übertragen.Mit einem Moria-Löffel, waschen Sie das Herzgewebe, indem Sie es von gut zu gut in der 6-Well-Platte mit HBSS gefüllt übertragen. Dann das Herzgewebe in eine konische Röhre mit 20ml Trypsin übertragen und mit sanfter Rührung bei 4 Grad Celsius für 4 Stunden brüten. Bei diesem Verfahren die Kollagenase-Verdauungslösung in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius vorwärmen.Übertragen Sie die konische Röhre mit Herzgewebe und Präkondonsionslösung von 4 Grad Celsius auf eine Zellkulturhaube. Lassen Sie das Herzgewebe auf den Boden des Rohres sinken und entfernen Sie die Prädigestionslösung mit einer 10ml serologischen Pipette. Als nächstes fügen Sie 10ml HBSS in die Tube.Setzen Sie das Herzgewebe mit HBSS 2 bis 3 Mal aus, um Trypsin mit einer 10ml serologischen Pipette auszuwaschen. ASpirieren Sie HBSS und fügen Sie 10ml vorgewärmte Kollagennase-Verdauungslösung in die Röhre mit Herzgewebe. Für die erste Verdauung, inkubieren Sie die Röhre mit Herzgewebe in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten ohne Rührung.Anschließend übertragen Sie die Röhre auf die Zellkulturhaube. Trituieren Sie das Gewebe, indem Sie es mit einer 10ml serologischen Pipette 10ml sanft wieder aufhängen. Dies wird es dem Herzen ermöglichen, sich zu zerstreuen und die Zellen aus dem Herzgewebe zu lösen.Lassen Sie das unverdaute Gewebe sinken. Übertragen Sie die in Kardiomyozyten angereicherte verdaute Lösung in eine neue konische Röhre und fügen Sie sofort eine gleiche Menge an Zellkulturmedium hinzu, um die Kollagenaseverdauung zu stoppen. Dann fügen Sie 10ml Kollagenase Verdauungslösung in die Röhre mit dem verbleibenden unverdautem Herzgewebe.Für die zweite Verdauung, inkubieren Sie die Röhre mit Herzgewebe in einem 37 Grad Celsius Wasserbad für 10 Minuten. Wiederholen Sie die Verfahren der ersten Verdauung und übertragen Sie die in Kardiomyozyten angereicherte verdaute Lösung in eine neue konische Röhre, bevor Sie die Kollagenaseverdauung stoppen. Als nächstes legen Sie ein steriles Zellsieb in eine neue sterile 50ml konische Röhre.Das Zellsieb mit 2 bis 3 ml Zellkulturmedium vorbefeuchten und die Zellen durch das Zellsieb leiten. Anschließend spülen Sie das Zellsieb mit Zellkulturmedium. Zentrifugieren Sie dann das konische Rohr, das Kardiomyozyten enthält, für 5 Minuten bei 180-facher Schwerkraft.Nach 5 Minuten den Überstand ansaugen und das Zellpellet in 10ml Zellkulturmedium wieder aufsetzen. Die Zellen auf eine 10cm Zellkulturschale aufstellen und eine Stunde lang bebrüten. Danach rühren Sie die Platte sanft auf.Die nicht haftenden Zellen abwaschen und die Zellen wieder aufhängen, indem sie das Zellkulturmedium mit einer 10ml serologischen Pipette wiederholt über die Schale pfeifen. Dann übertragen Sie die nicht haftenden Zellen in eine neue 10cm Zellkulturschale und inkubieren Sie sie für eine weitere Stunde. Nach einer Stunde die Platte sanft aufrühren und die nicht haftenden Zellen abwaschen.Übertragen Sie die Kardiomyozyten in eine neue 50ml konische Röhre. Als nächstes bereiten Sie eine 96-Well-Kulturplatte vor, indem Sie 50 Mikroliter Beschichtungslösung in jedem Brunnen der 96-Well-Zellkulturplatte aliquotieren. Wenn Blasen vorhanden sind, entfernen Sie sie mit einer 20-Mikroliter-Pipette.Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für mindestens eine Stunde, um das Trocknen der Matrixbeschichtung zu ermöglichen. Zählen Sie dann die Zellen mit einem Hämozytometer. Die Zellen in die extrazelluläre Matrix beschichtet 96-Well-Zellkulturplatte mit einer Dichte zwischen 10 bis 30 Tausend Zellen pro Brunnen.Und legen Sie die Zellen in den Inkubater. Um den Sauerstoffverbrauch assay vorzuformen, hydratisieren Sie eine Flussanalysator-Sensorpatrone für mindestens 3 Stunden, fügen Sie 200 Mikroliter Kalibrant-Lösung in jeden Brunnen der Versorgungsplatte. Legen Sie die Sensorpatrone wieder auf die Nutzplatte und brüten Sie in 37 Grad Celsius ohne CO2- oder O2-Supplementierung für mindestens 3 Stunden.Eine Stunde vor dem Test, entfernen Sie vorsichtig die Zellkultur Medium und waschen Sie die Zellen mit 200 Mikroliter von vorgewärmten mitochondrialen Stresstest Medium zweimal. Nach der zweiten Wäsche 175 Mikroliter vorgewärmten mitochondrialen Stresstestmedium hinzufügen. Dann kulturieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius ohne Kohlendioxid oder Sauerstoff-Supplementierung.Bereiten Sie 3ml jeder der Testverbindungen in mitochondrialen Stresstestmedium. Laden Sie 25 Mikroliter jeder Verbindung mit einer Mehrkanalpipette in die Injektoranschlüsse der Sensorpatrone. Zustand der Zellen und alle Vorbehandlungen können die maximale Restauration durch Injektion von Entkoppler FCCP entsteht beeinflussen.Die Zellempfindlichkeit gegenüber dem Entkoppler kann sich ebenfalls ändern, daher ist es wichtig, die Arbeitskonzentration von FCCP für jede einzelne Behandlung zu optimieren. Anschließend richten Sie das extrazelluläre Fluss-Assay-Protokoll ein und starten Sie das Programm. Legen Sie zunächst den Sensorknortrat zur Kalibrierung in die Maschine.Ersetzen Sie das Kalibrant für die Assayplatte, sobald der Kalibrierungsschritt abgeschlossen ist. Falls gewünscht, nach dem Test, sorgfältig alle Assay-Medium mit einer Mehrkanal-Pipette zu entsorgen. Und speichern Sie die Zellkultur Mircoplate bei negativen 20 Grad Celsius für die zukünftige Zellnormalisierung mit Protein-Assay.Durch die Verwendung des beschriebenen Protokolls wurden Die Herzen vom Tag 0 neonatale Welpen isoliert und Kardiomyozyten wurden bei Dichten von 10, 20 oder 30 Tausend Zellen pro Brunnen in 96-Well-Platten ausgesät. Nach der Nachtkultur wurden Kardiomyozyten gefunden, die gut an der beschichteten Kunststoffoberfläche befestigt waren, und es gab nur sehr wenige ungebundene Zellen. Zu diesem Zeitpunkt waren spontan kontranomyozyten leicht sichtbar.Eine Saatdichte von 30.000 Zellen pro Brunnen zeigte einen Tag nach der Aussaat einen Zusammenfluss, während sich die Zellen ausbreiteten. Kardiomyozyten wurden mit einem Antikörper gegen sarcomeric alpha actinin, einem Kardiomyozyten-spezifischen Marker, immungefärbt. Wie hier gezeigt, zeigten die meisten Zellen eine positive Färbung von Alpha-Actinin, was auf die hohe Reinheit der Kardiomyozytenisolation hindeutet.Hier wird ein Schema eines typischen mitochondrialen Stresstests gezeigt. Der mitochondriale Stresstest beginnt mit einer Basislinienmessung der Sauerstoffverbrauchsrate, gefolgt von der Injektion von Oligo-Myosin, die ATPas hemmt. Anschließend wurde das Entkopplungsmittel FCCP injiziert, um den maximalen Sauerstoffverbrauch zu messen.Schließlich stoppt mit der Injektion von zwei Elektronentransport-Komplex-Inhibitoren die mitochondriale Atmung vollständig und OCR sinkt auf den niedrigsten Stand. Um konsistente und reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Es ist entscheidend, eine hohe Überlebensfähigkeit zu erreichen.Daher ist es wichtig, neugeborene Neugeborene Neugeborene und sanft behandeltherzes Gewebe in Kardiomyozyten zu verwenden. Durch die Verwendung neuer oder vorhandener genetisch manipulierter Mauslinien kann diese Methode leicht in Daten übersetzt werden, die zum Verständnis neuer Mechanismen für die bioenergetische Regulierung im Herzen führen können. Mitochondrial spielen Schlüsselrollen in der Herzfunktion.Wir erwarten, dass diese Methode dazu beiträgt, neue Regulatoren und Wege zu identifizieren, die den oxidierenden Stoffwechsel regulieren und neue therapeutische Ziele für die Behandlung von Herzinsuffizienz finden.

analyzing-oxygen-consumption-rate-primary-cultured-mouse-neonatal

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Quelle:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Oroboros InstrumenteIn diesem Video wird erklärt, wie der Sauerstofffluss zur Beurteilung der mitochondrialen Atmung in lebenden und permeabilisierten Säugetierzellen verwendet wird. Es zeigt die sequentielle Verwendung von Digitonin, metabolischen Substraten, ADP, einem Entkoppler und einem Inhibitor zur Charakterisierung verschiedener respiratorischer Zustände. Das resultierende Sauerstoffflussprofil zeigt die...

Sauerstoffflussmessungen zur Bewertung der mitochondrialen Atmung in lebenden und permeabilisierten Zellen

Glykolyse ist ein definierender metabolischer Marker in mehreren biologischen Systemen. Die Überwachung der Glykolyse durch Messung des extrazellulären Flusses von H+ ist üblich, erfordert jedoch eine Korrektur, um quantitativ und eindeutig zu sein. Hier zeigen wir, wie extrazelluläre Flussdaten gesammelt und korrigiert werden können, um zwischen respiratorischen und glykolytischen Quellen der extrazellulären Versauerung zu unterscheiden.

Messung und Analyse von extrazellulären Säureproduktion zu ermitteln glykolytischen Rate

Dieses Verfahren beschreibt Echtzeit Aufnahme von Sauerstoff-Verbrauch und extrazelluläre Übersäuerung Preise in explantierten Maus retinalen Gewebe mit einer extrazellulären Flux-Analyzer.

Messung des Energiestoffwechsels in explantierten Netzhautgewebe extrazelluläre Flux-Analyse

Die hier vorgestellte Methode fasst optimierte Protokolle zur Beurteilung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen (HSPCs) der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator zusammen, um die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) und die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) von HSPCs in Echtzeit zu messen.

Bewertung der zellulären Bioenergetik in hämatopoetischen Stamm- und primitiven Vorläuferzellen der Maus mit dem extrazellulären Flussanalysator

Der Echtzeit-Zellstoffwechselfluss-Assay misst die Sauerstoffverbrauchsrate und die extrazelluläre Säuerungsrate, die der mitochondrialen und glykolytischen Adenosintriphosphatproduktion entspricht, unter Verwendung von pH- und Sauerstoffsensoren. Das Manuskript erklärt eine Methode zum Verständnis des Energiestatus von Osteoblasten und die Charakterisierung und Interpretation des zellulären bioenergetischen Status.

Verwendung eines Echtzeit-Zellstoffwechselflussanalysators zur Überwachung der Bioenergetik des Osteoblast

Die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) ist ein gängiger Proxy für die mitochondriale Funktion und kann zur Untersuchung verschiedener Krankheitsmodelle verwendet werden. Wir haben eine neue Methode entwickelt, die einen Seahorse XF-Analysator verwendet, um die OCR in akuten striatalen Schnitten von erwachsenen Mäusen direkt zu messen, die physiologisch relevanter ist als andere Methoden.

Messung des Sauerstoffverbrauchs in akuten striatalen Schnitten von erwachsenen Mäusen

Der Stoffwechselstatus menschlicher retinaler Pigmentepithelzellen (H-RPE) spiegelt deren Gesundheit und Funktion wider. Hier wird ein optimiertes Protokoll zur Untersuchung des Echtzeit-Stoffwechselflusses von H-RPE mittels hochauflösender Respirometrie vorgestellt.

Echtzeitanalyse der Bioenergetik in primären humanen retinalen Pigmentepithelzellen mittels hochauflösender Respirometrie

Wir beschreiben schrittweise Protokolle zur Messung der mitochondrialen Atmung von Maus und humanen Neutrophilen und HL60-Zellen mit dem metabolischen extrazellulären Flussanalysator.

Echtzeitmessung des mitochondrialen bioenergetischen Profils von Neutrophilen

Hier beschreiben wir detailliert Methoden zur Extraktion von Makrophagen aus dem Knochenmark, der Milz und dem infarktierten Herzen und zur anschließenden Bestimmung des metabolischen Flusses in lebenden Zellen.

Analyse des ex vivo metabolischen Flusses in Milz- und Herzmakrophagen und Knochenmarkmonozyten

Wir präsentieren ein Protokoll zur selektiven Permeabilisierung der Plasmamembran, wodurch gezielte Abgabe von Substraten und Inhibitoren ermöglicht wird, um die mitochondriale oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) in kultivierten Zellen zu bewerten und so die Transportbarrieren der Plasmamembran zu überwinden, die diese Analyse typischerweise behindern. Mit dieser Technik zeigten wir, wie die Funktion von OXPHOS durch muscarinische Agonisten und Antagonisten moduliert wird.

cholinerge ligandabhängige Modulation der oxidativen Phosphorylierungskopplung in Digitonin-permeabilisierten BE(2)-C-Neuroblastomzellen

In diesem Artikel beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Quantifizierung der Sauerstoffverbrauchsrate und der extrazellulären Versauerungsrate der ex-vivo erwachsenen Zebrafischventrikel, um deren oxidative und glykolytische Stoffwechselkapazität zu charakterisieren.

Bewertung der Stoffwechselaktivität ganzer regenerierender Zebrafischventrikel ex vivo mittels eines extrazellulären Flusstests

Lernen Sie die Analyse des Sauerstoffverbrauchs in primären neonatalen Maus-Kardiomyozyten mit einem extrazellulären Flux-Analyzer. Diese Methode ermöglicht die Bewertung mitochondrialer Funktion in der Kardiologie.

Analyse von Sauerstoff-Verbrauch im primären kultivierten Maus neonatale Herzzellen mit einer extrazellulären Flux-Analyzer

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