Synthese und Biokonjugaten der Thiol-reaktive Reagenzien für die Erstellung der Website selektiv geändert Immunokonjugate
6. März 2019
In diesem Protokoll wird die Synthese von Hülsen, ein Phenyoxadiazolyl Methyl Sulfon-basierte Reagenz für die Website-selektive Befestigung der Ladungen an die Thiole von Biomolekülen, insbesondere Antikörper beschrieben. Darüber hinaus beschreiben wir die Synthese und Charakterisierung von eine Hülsen tragenden bifunktionelle Chelator und die Konjugation zu einem Modell-Antikörper.
Dieses Protokoll beschreibt die Synthese und Anwendung von PODS, einem neuen Reagenz für die standortspezifische Biokonjugation von Proteinen und Peptiden. Diese Technologie stellt eine deutliche Verbesserung gegenüber traditionellen Maleimid-Thiol-basierten Biokonjugationen dar. Der größte Vorteil dieses Verfahrens ist die Einfachheit, mit der das Reagenz hergestellt wird.
Das Verfahren ermöglicht die Synthese des Reagenzes in praktisch jedem Labor. In einem 10-Milliliter-Rundbodenkolben 100 Milligramm des Aminophenyloxadiazeols in drei Milliliter Methanol auflösen. Zur Lösung 360 Mikroliter Diisopropylethylamin und einen magnetischen Rührstab hinzufügen.
Versiegeln Sie den Kolben mit einem Gummistopfen und rühren Sie die Lösung 10 Minuten bei Raumtemperatur. Mit einer Ein-Milliliter-Glasspritze ein Loch durch den Gummistopfen stopfen und schnell 32 Mikroliter Jodomeme in die Mischung geben. Lassen Sie die Mischung 45 Minuten bei Raumtemperatur reagieren.
In einem 25-Milliliter-Rundbodenkolben 387 Milligramm der boc-geschützten Carbonsäure in 10 Milliliter Dichlormethan auflösen. Zur Lösung 480 Mikroliter Diisopropylethylamin, 264 Milligramm EDCI, 200 Milligramm Aniline und einen magnetischen Rührstab hinzufügen. Versiegeln Sie den Kolben mit einem Glasstopfen und lassen Sie die Reaktion fünf Tage bei Raumtemperatur rühren.
Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, übertragen Sie das Reaktionsgemisch auf einen Trenntrichter und waschen Sie dreimal mit fünf Millilitern einmollaren Salzsäure. Sammeln Sie die organische Phase und übertragen Sie sie auf den Trenntrichter. Dann die organische Phase mit einem molaren Natriumcarbonat mit anschließendem Wasser waschen.
Als nächstes sammeln Sie die organische Phase und fügen Sie Magnesiumsulfat hinzu, um jegliche Wasserspuren zu entfernen. Dann filtern Sie die Mischung mit einem medium Glas frit. Entfernen Sie die flüchtigen Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer unter reduziertem Druck, um sich einen off-white-Feststoff leisten zu können.
Anschließend den isolierten Feststoff in 10 Milliliter Ethylacetat wieder auflösen. Dann das Produkt über die allmähliche Zugabe von 30 Milliliter Cyclohexan ausbrechen. Filtern Sie die Lösung mit einem mittleren Glasfrites, um das Carbamatprodukt als weißes Pulver zu erhalten.
In einem 10-Milliliter-Rundbodenkolben 30 Milligramm des Carbamats in vier Milliliter Dichlormethan auflösen. 49 Milligramm 70%m-Chloroperbenzoesäure und einen magnetischen Rührstab langsam in die Mischung geben und den Kolben mit einem Glasstopfen versiegeln. Rühren Sie die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur, was schließlich zu einer gelben Mischung führt.
Am nächsten Tag die Mischung in einen Trenntrichter geben. Dann waschen Sie die Mischung mit 0,1-Molar-Natriumhydroxid gefolgt von Wasser. Sammeln Sie die organische Phase und fügen Sie Magnesiumsulfat hinzu, um jegliche Wasserspuren zu entfernen.
Dann filtern Sie die Mischung mit einem medium Glas frit. In einem 25-Milliliter-Rundbodenkolben 30 Milligramm des Carbamats in zwei Milliliter Dichlormethan auflösen. Fügen Sie der Mischung einen magnetischen Rührbalken hinzu.
Und 400 Mikroliter Trifluoressigsäure und versiegeln den Kolben mit einem Glasstopfen. Dann rühren Sie das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur für drei Stunden. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, entfernen Sie die Flüchtigen unter reduziertem Druck bei Raumtemperatur mit einem Rotationsverdampfer, um einen öligen Rückstand zu erhalten.
Lösen Sie den öligen Rückstand in sieben Milliliter Wasser auf. Und auf einen Separatorentrichter übertragen. Waschen Sie die wässrige Lösung dreimal mit vier MilliliterEthylacetat.
In einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr 10 Milligramm PODS und 300 Mikroliter Dimethylsulfoxid auflösen. Dann 26 Mikroliter N, N-Diisopropylethylamin in die Lösung geben. 15,2 Milligramm DOTA NCS in 100 Mikroliter Dimethylsulfoxid auflösen und die Lösung mit der PODS-Lösung kombinieren.
Versiegeln Sie das Mikrozentrifugenrohr und lassen Sie die Reaktion über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. Als nächstes 61 Mikroliter einer Trastuzumab-Stammlösung mit 859 Mikroliter PBS in einem proteinarmen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr verdünnen. Zu dieser Mischung 6,7 Mikroliter einer frisch hergestellten 10-Millimolar-Lösung von TCEP in Wasser geben.
73 Mikroliter einer EIN Milligramm pro Milliliter PODS-DOTA-Lösung in das Reaktionsgemisch geben. Schließlich das Mikrozentrifugenrohr versiegeln und die Lösung zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Die PODS-Synthese ist robust und zuverlässig.
Deproteinierung und Substitution des Aminophenyloxadiazols Thiol servierte Thioether eins in quantitativer Ausbeute. Ligation von Thioether eins und die boc-geschützte Carbonsäure ergab Verbindung zwei in 55%Yield. Oxidation gewährt eige Verbindung drei in 90%Yield.
Und die Entfernung der Bocs-Schutzgruppe brachte PODS zu 98% Rendite. Die Identität jedes Produkts wurde über Proton NMR, Kohlenstoff-NMR und hochauflösende MS bestätigt. Eine Isothiocyanat-tragende Variante des Chelators DOTA wurde an das Pendantamin von PODS gekoppelt, um den bifunktionellen Chelator in 75% Ausbeute zu erhalten. Die Identität des Produkts wurde über Proton NMR, Kohlenstoff-NMR und hochauflösende MS bestätigt. Hier wird die standortselektive Biokonjugation von PODS-DOTA an den HER2-targeting Antikörper Trastuzumab gezeigt.
Die Disulfidverbindungen der Scharnierregion des Antikörpers wurden selektiv reduziert, und der Antikörper wurde dann mit PODS-DOTA inkubiert, um dem DOTA-tragenden Immunkonjugat eine Ausbeute von 80% zu ermöglichen. Die MALDI-TOF-Analyse ergab einen Grad der Kennzeichnung von 1,8 DOTA pro Antikörper. Was in einer Reihe von menschlichen, humanisierten und chimeren IgG1-Antikörpern konsistent bleibt.
Die gleichen Bedingungen erzeugen jedoch Immunkonjugate mit einem Etikettierungsgrad von 1,5 für murine IgG1-Antikörper. Aufgrund der Lichtempfindlichkeit dieser Verbindung ist es wichtig, alle Reaktionen in folienbedeckten Gefäßen zu halten. Dies erhöht den Gesamtertrag des Produkts.
Während dieses Protokoll die Synthese von PODS-DOTA beschreibt, kann ein ähnliches Verfahren auf eine Vielzahl potenzieller Ladungen angewendet werden, einschließlich Fluorophoren, Toxine und andere Chelatoren. Diese Methode erleichtert den Aufbau klar definierter, homogener und hochstabiler Immunkonjugate, die in einer Vielzahl von Bereichen eingesetzt werden können. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass das in Schritt eins dieses Experiments hinzugefügte Jodome schädliche Auswirkungen haben kann und daher in einer Dunstabzugshaube verwendet werden sollte.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt die Synthese und Anwendung von PODS, einem neuen Reagenz für die ortsspezifische Biokonjugation von Proteinen und Peptiden. Die Methode ermöglicht die einfache Synthese des Reagenzes praktisch in jedem Labor.
Wichtige Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Bio-Konjugation
- Proteinchemie
- Antikörpermodyfikation
Hintergrund
- PODS ist ein auf Phenoxiadiazolylmethylsulfon basierendes Reagenz.
- Es ermöglicht die ortssensitive Anheftung von Laststoffen an Thiole von Biomolekülen.
- Diese Technologie stellt eine Verbesserung gegenüber herkömmlichen, auf Maleimid-Thiol-Reaktionen basierenden Bioverknüpfungen dar.
- Die Einfachheit des Syntheseprozesses ist ein wesentlicher Vorteil.
Zweck der Studie
- Eine Anleitung zur Synthese von PODS bereitstellen.
- Ihre Anwendung in der Biokonjugation demonstrieren.
- Einen PODS-tragenden bifunktionellen Chelator charakterisieren.
Verwendete Methoden
- Lösen von Aminophenyl-oxadiazolthiol in Methanol.
- Zugabe von Diisopropylethylamin zur Lösung.
- Verwendung eines magnetischen Rührstabs zum Mischen.
- Charakterisierung der synthetisierten PODS und deren Konjugation an einen modellhaften Antikörper.
Hauptergebnisse
- PODS wurde erfolgreich in einem Labor synthetisiert.
- Das Reagenz zeigte eine effektive ortsspezifische Biokonjugation.
- Die Charakterisierung des PODS-tragenden bifunktionellen Chelators wurde erfolgreich durchgeführt.
- Die Methode wies Vorteile gegenüber herkömmlichen Biokonjugationstechniken auf.
Schlussfolgerungen
- PODS bietet eine einfache und effektive Methode für die Biokonjugation.
- Dieses Reagenz kann in verschiedenen Laborumgebungen synthetisiert werden.
- Das Protokoll verbessert die Effizienz der Anheftung von Cargos an Biomoleküle.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die standortselektive Biokonjugation von Antikörpern bleibt aufgrund der Instabilität maleimidbasierter Bindungen in vivo eine wesentliche Herausforderung in der Entwicklung von Radiopharmazeutika. Die auf PODS basierende Chemie ermöglicht homogene, stabile Immunkonjugate mit verbesserter Target-Retention und reduzierter Ablagerung außerhalb des Zielgewebes. Dieser Fortschritt trägt zur präklinischen Risikominimierung von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten und radiogelabelten Therapeutika bei, indem die Integrität des Wirkstoffs und der therapeutische Index verbessert werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von Struktur-Funktions-Beziehungen von Antikörpern durch ortsspezifische Anheftung von Wirkstoffen.
- Operationaler Wert: Verringert die Heterogenität in Konjugatpopulationen und vereinfacht dadurch die nachgeschaltete Charakterisierung.
- Prädiktiver Wert: Erhöht die Zuverlässigkeit präklinischer Wirksamkeits- und Sicherheitsbewertungen, indem variable Wirkstoffbeladung minimiert wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Verwendbarkeit: Erzeugt gut definierte Immunkonjugate, die für Bindungs- und Internalisierungsassays geeignet sind.
- Reproduzierbarkeit: Ein konsistenter Markierungsgrad (~1,8 DOTA pro Antikörper) über verschiedene IgG1-Subklassen hinweg unterstützt die Standardisierung von Assays.
- Skalierbarkeit: Die robuste Synthese unter Standardlaborbedingungen ermöglicht die Übertragung der Technologie auf verschiedene Forschungsteams.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Zeigte überlegene In-vivo-Leistung in murinen Kolorektalkrebsmodellen im Vergleich zu Maleimid-Kontrollen.
- Übertragbarkeit: Standortspezifische Konjugation erhält die Immunreaktivität und unterstützt Target-Engagement-Studien.
- Risikominderung: Verminderte Payload-Umlagerung und retro-Michael-Abbau senken das Risiko einer Off-Target-Toxizität während der Leitstruktur-Optimierung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die PODS-Chemie ist in die Kontinuum von der Entdeckung bis zur präklinischen Phase eingebettet und ermöglicht die zuverlässige Herstellung stabiler Immunkonjugate für die Identifizierung von Leitverbindungen sowie für zulassungsvorbereitende Studien (IND-enabling studies).
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung mittels definierter Antikörper-Konjugate für die Zielvalidierung und Untersuchungen zum Wirkmechanismus.
- Screening: Erzeugt homogene Konjugate für das Hochdurchsatz-Screening der Wirksamkeit und Selektivität von Wirkstoffen.
- Analytik: Ermöglicht die präzise Quantifizierung des Wirkstoff-zu-Antikörper-Verhältnisses mittels MALDI-TOF und NMR zur Sicherstellung der Batch-Konsistenz.
- Translationale Forschung: Erleichtert die PK/PD-Modellierung durch stabile Konjugate, die einem in-vivo-Thiol-Austausch widerstehen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Das modulare Reagenzdesign erlaubt die Anpassung an verschiedene Frachten (Chelatoren, Fluorophore, Toxine) über mehrere Projekte hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verbesserte Zielvalidierung durch stabile, ortsspezifische Kopplung, die mechanistische Unschärfen verringert.
- Operationaler Wert: Hochgradige, reproduzierbare Synthese (98 % für PODS, 80 % für die Konjugation) minimiert das Risiko von Chargenfehlern.
- Strategischer Wert: Verbesserter therapeutischer Index und kontrastreichere Bildgebung ermöglichen fundiertere Go/No-Go-Entscheidungen in präklinischen Portfolioanalysen.
- Portfolioauswirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Konjugaten mit überlegenen pharmakokinetischen Profilen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in organischer Synthese und Bio-Konjugationschemie.
- Benötigt Standard-Laborausrüstung: Rundkolben, Rotationsverdampfer, Trenntrichter und Abzugshaube für die Handhabung von Iodomethan.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise bei den Konjugationsprotokollen und analytischen Charakterisierungen (NMR, MS, MALDI-TOF) über mehrere Teams hinweg.
- Die Anpassung an Nicht-IgG1-Antikörper kann eine Optimierung erfordern, bedingt durch die Variabilität der Markierungseffizienz (z. B. 1,5 DOTA pro murinem IgG1).
- Die Lichtempfindlichkeit erfordert die Verwendung mit Folie abgedeckter Gefäße während Lagerung und Reaktionsschritten, um Ausbeute und Reinheit zu gewährleisten.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
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Title
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Synthesis of 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)
1:15
Synthesis of Tert-butyl[18-({4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] Carbamate (2)
3:00
Synthesis of Tert-butyl[18-({4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] Carbamate (3)
3:55
Synthesis of N1-(3-{2-[2-(3-aminopropoxy)ethoxy]-ethoxy}propyl)-N4-{4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl] phenyl}Succinamide (PODS)
4:47
Synthesis of PODS-DOTA and Bioconjugation of PODS-DOTA to Trastuzumab
6:05
Results: Synthesis of PODS and PODS-DOTA and Conjugation to Trastuzumab
8:01
Conclusion
