Synthese und Biokonjugaten der Thiol-reaktive Reagenzien für die Erstellung der Website selektiv geändert Immunokonjugate

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese und Anwendung von PODS, einem neuen Reagenz für die standortspezifische Biokonjugation von Proteinen und Peptiden. Diese Technologie stellt eine deutliche Verbesserung gegenüber traditionellen Maleimid-Thiol-basierten Biokonjugationen dar. Der größte Vorteil dieses Verfahrens ist die Einfachheit, mit der das Reagenz hergestellt wird.

Das Verfahren ermöglicht die Synthese des Reagenzes in praktisch jedem Labor. In einem 10-Milliliter-Rundbodenkolben 100 Milligramm des Aminophenyloxadiazeols in drei Milliliter Methanol auflösen. Zur Lösung 360 Mikroliter Diisopropylethylamin und einen magnetischen Rührstab hinzufügen.

Versiegeln Sie den Kolben mit einem Gummistopfen und rühren Sie die Lösung 10 Minuten bei Raumtemperatur. Mit einer Ein-Milliliter-Glasspritze ein Loch durch den Gummistopfen stopfen und schnell 32 Mikroliter Jodomeme in die Mischung geben. Lassen Sie die Mischung 45 Minuten bei Raumtemperatur reagieren.

In einem 25-Milliliter-Rundbodenkolben 387 Milligramm der boc-geschützten Carbonsäure in 10 Milliliter Dichlormethan auflösen. Zur Lösung 480 Mikroliter Diisopropylethylamin, 264 Milligramm EDCI, 200 Milligramm Aniline und einen magnetischen Rührstab hinzufügen. Versiegeln Sie den Kolben mit einem Glasstopfen und lassen Sie die Reaktion fünf Tage bei Raumtemperatur rühren.

Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, übertragen Sie das Reaktionsgemisch auf einen Trenntrichter und waschen Sie dreimal mit fünf Millilitern einmollaren Salzsäure. Sammeln Sie die organische Phase und übertragen Sie sie auf den Trenntrichter. Dann die organische Phase mit einem molaren Natriumcarbonat mit anschließendem Wasser waschen.

Als nächstes sammeln Sie die organische Phase und fügen Sie Magnesiumsulfat hinzu, um jegliche Wasserspuren zu entfernen. Dann filtern Sie die Mischung mit einem medium Glas frit. Entfernen Sie die flüchtigen Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer unter reduziertem Druck, um sich einen off-white-Feststoff leisten zu können.

Anschließend den isolierten Feststoff in 10 Milliliter Ethylacetat wieder auflösen. Dann das Produkt über die allmähliche Zugabe von 30 Milliliter Cyclohexan ausbrechen. Filtern Sie die Lösung mit einem mittleren Glasfrites, um das Carbamatprodukt als weißes Pulver zu erhalten.

In einem 10-Milliliter-Rundbodenkolben 30 Milligramm des Carbamats in vier Milliliter Dichlormethan auflösen. 49 Milligramm 70%m-Chloroperbenzoesäure und einen magnetischen Rührstab langsam in die Mischung geben und den Kolben mit einem Glasstopfen versiegeln. Rühren Sie die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur, was schließlich zu einer gelben Mischung führt.

Am nächsten Tag die Mischung in einen Trenntrichter geben. Dann waschen Sie die Mischung mit 0,1-Molar-Natriumhydroxid gefolgt von Wasser. Sammeln Sie die organische Phase und fügen Sie Magnesiumsulfat hinzu, um jegliche Wasserspuren zu entfernen.

Dann filtern Sie die Mischung mit einem medium Glas frit. In einem 25-Milliliter-Rundbodenkolben 30 Milligramm des Carbamats in zwei Milliliter Dichlormethan auflösen. Fügen Sie der Mischung einen magnetischen Rührbalken hinzu.

Und 400 Mikroliter Trifluoressigsäure und versiegeln den Kolben mit einem Glasstopfen. Dann rühren Sie das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur für drei Stunden. Sobald die Reaktion abgeschlossen ist, entfernen Sie die Flüchtigen unter reduziertem Druck bei Raumtemperatur mit einem Rotationsverdampfer, um einen öligen Rückstand zu erhalten.

Lösen Sie den öligen Rückstand in sieben Milliliter Wasser auf. Und auf einen Separatorentrichter übertragen. Waschen Sie die wässrige Lösung dreimal mit vier MilliliterEthylacetat.

In einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr 10 Milligramm PODS und 300 Mikroliter Dimethylsulfoxid auflösen. Dann 26 Mikroliter N, N-Diisopropylethylamin in die Lösung geben. 15,2 Milligramm DOTA NCS in 100 Mikroliter Dimethylsulfoxid auflösen und die Lösung mit der PODS-Lösung kombinieren.

Versiegeln Sie das Mikrozentrifugenrohr und lassen Sie die Reaktion über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. Als nächstes 61 Mikroliter einer Trastuzumab-Stammlösung mit 859 Mikroliter PBS in einem proteinarmen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr verdünnen. Zu dieser Mischung 6,7 Mikroliter einer frisch hergestellten 10-Millimolar-Lösung von TCEP in Wasser geben.

73 Mikroliter einer EIN Milligramm pro Milliliter PODS-DOTA-Lösung in das Reaktionsgemisch geben. Schließlich das Mikrozentrifugenrohr versiegeln und die Lösung zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Die PODS-Synthese ist robust und zuverlässig.

Deproteinierung und Substitution des Aminophenyloxadiazols Thiol servierte Thioether eins in quantitativer Ausbeute. Ligation von Thioether eins und die boc-geschützte Carbonsäure ergab Verbindung zwei in 55%Yield. Oxidation gewährt eige Verbindung drei in 90%Yield.

Und die Entfernung der Bocs-Schutzgruppe brachte PODS zu 98% Rendite. Die Identität jedes Produkts wurde über Proton NMR, Kohlenstoff-NMR und hochauflösende MS bestätigt. Eine Isothiocyanat-tragende Variante des Chelators DOTA wurde an das Pendantamin von PODS gekoppelt, um den bifunktionellen Chelator in 75% Ausbeute zu erhalten. Die Identität des Produkts wurde über Proton NMR, Kohlenstoff-NMR und hochauflösende MS bestätigt. Hier wird die standortselektive Biokonjugation von PODS-DOTA an den HER2-targeting Antikörper Trastuzumab gezeigt.

Die Disulfidverbindungen der Scharnierregion des Antikörpers wurden selektiv reduziert, und der Antikörper wurde dann mit PODS-DOTA inkubiert, um dem DOTA-tragenden Immunkonjugat eine Ausbeute von 80% zu ermöglichen. Die MALDI-TOF-Analyse ergab einen Grad der Kennzeichnung von 1,8 DOTA pro Antikörper. Was in einer Reihe von menschlichen, humanisierten und chimeren IgG1-Antikörpern konsistent bleibt.

Die gleichen Bedingungen erzeugen jedoch Immunkonjugate mit einem Etikettierungsgrad von 1,5 für murine IgG1-Antikörper. Aufgrund der Lichtempfindlichkeit dieser Verbindung ist es wichtig, alle Reaktionen in folienbedeckten Gefäßen zu halten. Dies erhöht den Gesamtertrag des Produkts.

Während dieses Protokoll die Synthese von PODS-DOTA beschreibt, kann ein ähnliches Verfahren auf eine Vielzahl potenzieller Ladungen angewendet werden, einschließlich Fluorophoren, Toxine und andere Chelatoren. Diese Methode erleichtert den Aufbau klar definierter, homogener und hochstabiler Immunkonjugate, die in einer Vielzahl von Bereichen eingesetzt werden können. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass das in Schritt eins dieses Experiments hinzugefügte Jodome schädliche Auswirkungen haben kann und daher in einer Dunstabzugshaube verwendet werden sollte.