Name: Aufnahme von neuen Lipid-beschichteten Nanopartikeln mit Falcarindiol von humanen mesenchymalen Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung lipidbeschichteter Nanopartikel mit Falcarindiol für die Krebstherapie. Diese Methode ermöglicht die stabile Verkapselung hydrophober Wirkstoffe und deren effektive Aufnahme durch humane mesenchymale Stammzellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren danken Dr. Moustapha Kassem (Odense University Hospital, Dänemark) für die humanen mesenchymalen Stammzellen. Die Autoren danken den dänischen Bioimaging Zentrum für Zugriff auf ihre Mikroskope. Die Autoren danken die Carlsberg und Villum Grundlagen für die finanzielle Unterstützung (zu E.A.C.). Die Autoren erkennen die finanzielle Unterstützung von Niels Bohr Professur Award von der dänischen National Research Foundation zur Verfügung gestellt.

1. Nanopartikel-Synthese durch schnelle Lösungsmittel Verschiebung Technik
<ol><li>Richten Sie für die Nanopartikel Vorbereitung Folgendes: einen Block Heizung/Probe Konzentrator, Exsikkator, ein digitales Dosiersystem mit einer 1 mL Spritze mit Glas, ein 12 mL Glasflasche, Magnetrührer, einen magnetischen floh (15 mm x 4,5 mm, in zylindrischer Form mit Polytetrafluorethylen [PTFE] Beschichtung) im Inneren des Glases und eine rotatorische Verdampfer.</li>
	<li>2,4 mL 250 µM Falcarindiol Lager aufgelöst in 70 % EtOH-Wasser-Gemisch in einer Durchstechflasche Funkeln zu verzichten.</li>
	<li>Verdampft die flüssige Fraktion, mit der Probe-Konzentrator für ca. 4 h, trockene Falcarindiol zu erhalten.<ol>
<li>Legen Sie das Funkeln-Fläschchen in den Block Heizung; der Probe-Konzentrator liefert Gas über der Probe mit Edelstahl-Nadeln, Konzentration der Probenmaterials. Bei Raumtemperatur verdunsten; Verwenden Sie keine Hitze.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sobald getrocknet, fügen Sie die folgenden Komponenten der Lipid-Beschichtung in den oben genannten funkeln-Fläschchen: 31,64 mM DSPC 16.3 µL chloroform Stammlösung, 3,4 µL der Stammlösung 17,82 mM DSPE PEG 2000 Chloroform, 24 µL 25 mM Cholesterin Chloroform Lager Lösung und 6 µL 4 mM DiI Chloroform Stammlösung. Reinigen Sie die Spritze mit Chloroform nach Hinzufügen von einzelnen Komponenten um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Achtung: Schließen Sie sofort die Ampullen mit der Lipide, so dass das Lösungsmittel nicht verdunsten und, dabei die Konzentration ändern. Arbeiten Sie in einer Dampfhaube. Hinweis: Die Konzentrationen von Chloroform Stammlösungen können variieren, abhängig von der chemischen Lieferanten oder Verdünnungen im Labor hergestellt.</li>
	<li>Wickeln Sie das Fläschchen mit Alufolie zu DiI vor Licht zu schützen. Lassen Sie die Probe über Nacht im Exsikkator das Chloroform verdunsten.</li>
	<li>Auflösen der ausgetrockneten Probe im absoluten Ethanol zu einem Endvolumen von 1,2 mL, die Endkonzentrationen der DSPC, DSPE PEG 2000, Cholesterin und DiI von 0,43 mM, 0,05 mM, 0,5 mM und 0,02 mM, bzw. gibt. Diese Lösung stellt die organische Phase.</li>
	<li>Nehmen Sie die 12 mL Glasflasche, 9 mL gereinigtes Wasser füllen Sie ein und fügen Sie den magnetischen floh in das Fläschchen mit 9 mL Wasser hinzu. Halten Sie das Fläschchen auf den Magnetrührer, Rühren bei 500 u/min (Abbildung 1).</li>
	<li>Die Dosieranlage beimessen Sie die Spritze 1 mL Glas und reinigen Sie ihn mit Chloroform um jegliche Kontamination zu vermeiden. Dies durch, langsam ziehen das Chloroform in das Glasspritze und Verzicht auf manuell in einen Abfallsammler mindestens 10 Tiems. Achtung: Dies muss unter einem Abzug erfolgen.</li>
	<li>Grundieren Sie die Spritze mit Ethanol. Priming ersetzt das alte Lösungsmittel, sowie eventuelle Luftblasen entfernt. Achtung: Dies muss unter einem Abzug erfolgen.</li>
	<li>Aspirieren Sie mit der Spritze, 1 mL der organischen Phase.</li>
	<li>Legen Sie die Spritze in die Glasflasche, bis zur Mitte des Wasserzeichens 9 mL und erhalten Sie stabil in der Mitte der Durchstechflasche zu (siehe Abbildung 1).</li>
	<li>Spritzen Sie die Lösung mit der ausgewählten Geschwindigkeit der Injektion (833 µL/s) der Dispense-Taste auf die Dosieranlage (Abbildung 2). Dies erzeugt 10 mL 50 µM Lipid-beschichteten Nanopartikel aus Falcarindiol in 10 % Ethanol-haltigen Wasser. Hinweis: Diese Einspritzgeschwindigkeit wurde festgestellt, um feinste Partikel, erhalten eine enge Teilchengrößenverteilung zu erreichen. Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass die Spritze in der Mitte, stabil und gerade, beim Verzicht auf der Lösung ist.</li>
	<li>Unmittelbar nach der Injektion entfernen Sie das Fläschchen aus der Rührer und übertragen Sie die Probe in ein 50 mL Rundboden Kolben (RBF) zu.</li>
	<li>Die Drehverdampfer der RBF beimessen und 1 mL der organischen Lösungsmittel, mit dem Drehverdampfer bei Raumtemperatur verdunsten. Vermeiden Sie überflüssige Blasenbildung. Hinweis: Dieser Schritt wird ~ 5 min dauern.</li>
	<li>Übertragen Sie die Nanopartikel Suspension aus dem RBF auf ein anderes 12 mL Glasflasche. Stellen Sie sicher, dass das Volumen 9 mL. Teilen Sie die Probe in zwei 12 mL Glasfläschchen (Put 4,5 mL in jedem).</li>
	<li>Hinzufügen eines der Fläschchen und 0,5 mL 10 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), die andere Flasche 0,5 mL Reinstwasser. Nehmen Sie 1 mL pro Probe für die Messung der Partikelgröße.</li>
</ol>2. die Partikelgrößenanalyse, die mit Hilfe der DLS-Technik
Hinweis: Größenmessungen wurden durchgeführt mit einem DLS-Analysator die Partikelgrößenverteilungen bestimmt. Es ist ausgestattet mit einem 100 mW Laser, die arbeitet bei einer Wellenlänge von 662.2 nm und mit einer Lawine Fotodiode Detektor platziert in einem 90° Winkel zu der Einfallswinkel. Der Strahl ist verstreut durch die Nanopartikel und von den Photodetektor erkannt.
<ol><li>Schalten Sie die DLS-Instrument und stellen Sie die gewünschte Temperatur bei 20 ° C bis es stabilisiert.</li>
	<li>Legen Sie die Geräteparameter wie folgt: Daten Erfassungszeit = 4 s, Anzahl der Akquisitionen = 30, Auto-Dämpfung Funktion = ein, und die Auto-Dämpfung Fristen = 0.</li>
	<li>Füllen Sie die Kunststoff Küvette mit 1 mL der Nanopartikel Suspension und starten Sie die Messung.</li>
	<li>Bericht der gemessenen Größe je nach verwendeten Lösungsmittels (Wasser oder PBS). Hinweis: Die Messung mit PBS-Puffer vorgenommen, eine ungefähre Vorstellung von der Größe der Zellen in das Medium zu haben, wenn die Zellen zu behandeln. Die Behandlung erfolgt über die Nanopartikel in Wasser aufgelöst.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Messungen 24 h nach der Synthese für die Aggregation der Partikel zu überprüfen.</li>
</ol>3. Behandlung
<ol><li>Minimale wesentliche Medium (MEM) ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin, in einer humifizierten Kammer bei 37° C mit 5 % CO2zulegen Sie hMSCs. Achtung: Arbeiten Sie in der sterilen Laminar-Flow-Haube für Schritte 3.1, 3.2 und 3.3.</li>
	<li>Etwa 50.000 Samenzellen zu einer Zelle Dichte von ca. 30 % auf zuvor Absolute-EtOH-sterilisiert #1.5 Deckgläsern in 6-Well Platten gelegt. Fügen Sie MEM, um einem Endvolumen von 3 mL in jede Vertiefung haben. 24 h unter den gleichen Bedingungen wie in Schritt 3.1 inkubieren. Samen der Zellen 24 h vor der Behandlung. Hinweis: Es ist wichtig, dass die Zellen ausgesät werden mindestens 24 h vor der Nanopartikel-Behandlung, um sicherzustellen, dass die Zellen in eine angemessene Zusammenfluss sind.</li>
	<li>Ohne das Medium zu entfernen, fügen Sie 3 µL der Nanopartikel-Lösung für eine endgültige Falcarindiol Konzentration von 5 µM. Inkubation für 24 h unter den gleichen Bedingungen wie in Schritt 3.1. Hinweis: Die Nanopartikel Vorbereitung erfolgte am Tag der Zelltherapie, Partikel-Aggregation zu vermeiden.</li>
	<li>Waschen Sie anschließend nach 24 Stunden nach der Behandlung, die Zellen 2 X mit PBS, in 4 % Formaldehyd für 10 min bei Raumtemperatur zu beheben, und speichern sie mit PBS-Puffer bei 4° C für bis zu mehreren Monaten bis abgebildet. Achtung: Dies muss unter einem Abzug erfolgen.<ol>
<li>Alternativ kann nach der Fixierung, ein 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) nukleare Färbung durchgeführt werden. Hierzu nach der Fixierung der Zellen, permeabilize sie mit 0,1 % Triton x-100 für 30 min, waschen Sie sie 2 X mit PBS, und färben sie mit 250 µL von 300 nM DAPI für 5 Minuten, vor Licht geschützt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) Mikroskopie
<ol><li>
Fluoreszenz-Mikroskopie
	<ol>
<li>Verwenden Sie ein Weitfeld Fluoreszenzmikroskop, ausgestattet mit einer CCD-Kamera Elektrons multipliziert, um Bilder zu erwerben. Verwenden Sie die 150 x NA 1,45 Öl Ziel und der GFP LP-Kanal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Konfokale Mikroskopie
	<ol>
<li>Abrufen von Bildern der konfokalen Mikroskopie, mit 63 x NA 1.4 Öl Ziel, einem Argonlaser (514 nm) für DiI und ein zwei-Photonen-Laser (780 nm) für DAPI, um die Aufnahme von Nanopartikeln in die Zellen zu überprüfen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Firestone, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Density+Lipoprotein+as+a+Vehicle+for+Targeting+Antitumor+Compounds+to+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low-Density Lipoprotein as a Vehicle for Targeting Antitumor Compounds to Cancer Cells.</a> Bioconjugate Chemistry. 5 (2), 105-113 (1994).</li>
<li>Beloribi-Djefaflia, S., Vasseur, S., Guillaumond, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+metabolic+reprogramming+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">Lipid metabolic reprogramming in cancer cells.</a> Oncogenesis. 5 (1), 189(2016).</li>
<li>Xin, Y., Yin, M., Zhao, L., Meng, F., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+on+nanoparticle-based+drug+delivery+systems+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Recent progress on nanoparticle-based drug delivery systems for cancer therapy.</a> Cancer Biology & Medicine. 14 (3), 228(2017).</li>
<li>Merriel, S. W. D., Carroll, R., Hamilton, F., Hamilton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+unexplained+hypoalbuminaemia+and+new+cancer+diagnoses+in+UK+primary+care+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Family+Practice%22%5BJournal%5D)">Association between unexplained hypoalbuminaemia and new cancer diagnoses in UK primary care patients.</a> Family Practice. 33 (5), 449-452 (2016).</li>
<li>Yue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesteryl+ester+accumulation+induced+by+PTEN+loss+and+PI3K%2FAKT+activation+underlies+human+prostate+cancer+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Cholesteryl ester accumulation induced by PTEN loss and PI3K/AKT activation underlies human prostate cancer aggressiveness.</a> Cell Metabolism. 19 (3), 393-406 (2014).</li>
<li>dos Santos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LDL-cholesterol+signaling+induces+breast+cancer+proliferation+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids+in+Health+and+Disease%22%5BJournal%5D)">LDL-cholesterol signaling induces breast cancer proliferation and invasion.</a> Lipids in Health and Disease. 13 (16), (2014).</li>
<li>Gallagher, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+tumor+LDLR+expression+accelerates+LDL+cholesterol-mediated+breast+cancer+growth+in+mouse+models+of+hyperlipidemia+HHS+Public+Access%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Elevated tumor LDLR expression accelerates LDL cholesterol-mediated breast cancer growth in mouse models of hyperlipidemia HHS Public Access.</a> Oncogene. 36 (46), 6462-6471 (2017).</li>
<li>Needham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom+up+design+of+nanoparticles+for+anti-cancer+diapeutics%3A+%22put+the+drug+in+the+cancer%27s+food%22%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Targeting%22%5BJournal%5D)">Bottom up design of nanoparticles for anti-cancer diapeutics: "put the drug in the cancer's food".</a> Journal of Drug Targeting. 24 (9), 836-856 (2016).</li>
<li>Lacko, A. G., Mconnathy, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+cancer+chemotherapy+using+synthetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22United+States+Patent+Application+Publication%22%5BJournal%5D)">Targeted cancer chemotherapy using synthetic nanoparticles.</a> United States Patent Application Publication. , Pub. No.: US 2009/0110739 A1 (2009).</li>
<li>Nikanjam, M., Gibbs, A. R., Hunt, C. A., Budinger, T. F., Forte, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+nano-LDL+with+paclitaxel+oleate+as+a+targeted+drug+delivery+vehicle+for+glioblastoma+multiforme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Synthetic nano-LDL with paclitaxel oleate as a targeted drug delivery vehicle for glioblastoma multiforme.</a> Journal of Controlled Release. 124 (3), 163-171 (2007).</li>
<li>Teerlink, T., Scheffer, P. G., Bakker, S. J. L., Heine, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+data+from+LDL+composition+and+size+measurement+are+compatible+with+a+discoid+particle+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Combined data from LDL composition and size measurement are compatible with a discoid particle shape.</a> Journal of Lipid Research. 45 (5), 954-966 (2004).</li>
<li>Schweizer, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+study+of+niclosamide+in+combination+with+enzalutamide+in+men+with+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A phase I study of niclosamide in combination with enzalutamide in men with castration-resistant prostate cancer.</a> PLoS ONE. 13 (8), 0202709(2018).</li>
<li>Allen, T. M., Hansen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics+of+stealth+versus+conventional+liposomes%3A+effect+of+dose%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics of stealth versus conventional liposomes: effect of dose.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1068 (2), 133-141 (1991).</li>
<li>Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Enhanced+Permeability+and+Retention+%28EPR%29+Effect+in+Tumor+Vasculature%3A+The+Key+Role+of+Tumor-Selective+Macromolecular+Drug+Targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Enzyme+Regulation%22%5BJournal%5D)">The Enhanced Permeability and Retention (EPR) Effect in Tumor Vasculature: The Key Role of Tumor-Selective Macromolecular Drug Targeting.</a> Advances in Enzyme Regulation. 41 (1), 189-207 (2001).</li>
<li>Wong, A. D., Ye, M., Ulmschneider, M. B., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+of+the+Enhanced+Permeation+and+Retention+%28EPR%29+Effect%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis of the Enhanced Permeation and Retention (EPR) Effect.</a> PLoS ONE. 10 (5), 0123461(2015).</li>
<li>Khodabandehloo, H., Zahednasab, H., Hafez, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanocarriers+Usage+for+Drug+Delivery+in+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Iranian+Journal+of+Psychiatry+and+Behavioral+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nanocarriers Usage for Drug Delivery in Cancer Therapy.</a> Iranian Journal of Psychiatry and Behavioral Sciences. 9 (2), (2016).</li>
<li>Kobaek-Larsen, M., El-Houri, R. B., Christensen, L. P., Al-Najami, I., Fretté, X., Baatrup, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+polyacetylenes%2C+falcarinol+and+falcarindiol%2C+isolated+from+carrots+prevents+the+formation+of+neoplastic+lesions+in+the+colon+of+azoxymethane-induced+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Food+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Dietary polyacetylenes, falcarinol and falcarindiol, isolated from carrots prevents the formation of neoplastic lesions in the colon of azoxymethane-induced rats.</a> Food & Function. 8, 964-974 (2017).</li>
<li>Hervella, P., Parra, E., Needham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+and+retention+of+chelated-copper+inside+hydrophobic+nanoparticles%3A+Liquid+cored+nanoparticles+show+better+retention+than+a+solid+core+formulation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Encapsulation and retention of chelated-copper inside hydrophobic nanoparticles: Liquid cored nanoparticles show better retention than a solid core formulation.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 102, 64-76 (2016).</li>
<li>Hervella, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chelation%2C+formulation%2C+encapsulation%2C+retention%2C+and+in+vivo+biodistribution+of+hydrophobic+nanoparticles+labelled+with+57Co-porphyrin%3A+Octyl+Amine+ensures+stable+chelation+of+cobalt+in+Liquid+Nanoparticles+that+accumulate+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Chelation, formulation, encapsulation, retention, and in vivo biodistribution of hydrophobic nanoparticles labelled with 57Co-porphyrin: Octyl Amine ensures stable chelation of cobalt in Liquid Nanoparticles that accumulate in tumors.</a> Journal of Controlled Release. , (2018).</li>
<li>Zhigaltsev, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-up+design+and+synthesis+of+limit+size+lipid+nanoparticle+systems+with+aqueous+and+triglyceride+cores+using+millisecond+microfluidic+mixing%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing.</a> Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).</li>
<li>Aubry, J., Ganachaud, F., Cohen Addad, J. -P., Cabane, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoprecipitation+of+Polymethylmethacrylate+by+Solvent+Shifting%3A1+Boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Nanoprecipitation of Polymethylmethacrylate by Solvent Shifting:1 Boundaries.</a> Langmuir. 25 (4), 1970-1979 (2009).</li>
<li>Karnik, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Platform+for+Controlled+Synthesis+of+Polymeric+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Platform for Controlled Synthesis of Polymeric Nanoparticles.</a> Nano Letters. 8 (9), 2906-2912 (2008).</li>
<li>Gaumet, M., Vargas, A., Gurny, R., Delie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+for+drug+delivery%3A+The+need+for+precision+in+reporting+particle+size+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles for drug delivery: The need for precision in reporting particle size parameters.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 69 (1), 1-9 (2018).</li>
<li>Christensen, L. P., Brandt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+polyacetylenes+in+food+plants+of+the+Apiaceae+family%3A+Occurrence%2C+bioactivity+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Bioactive polyacetylenes in food plants of the Apiaceae family: Occurrence, bioactivity and analysis.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 41 (3), 683-693 (2016).</li>
<li>Kobaek-Larsen, M., Christensen, L. P., Vach, W., Ritskes-Hoitinga, J., Brandt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+Effects+of+Feeding+with+Carrots+or+%28-%29+-Falcarinol+on+Development+of+Azoxymethane-Induced+Preneoplastic+Lesions+in+the+Rat+Colon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibitory Effects of Feeding with Carrots or (-) -Falcarinol on Development of Azoxymethane-Induced Preneoplastic Lesions in the Rat Colon.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53, 1823-1827 (2005).</li>
<li>Jin, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antitumor+natural+compound+falcarindiol+promotes+cancer+cell+death+by+inducing+endoplasmic+reticulum+stress%5BTitle%5D)+AND+%22CellDeath+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">The antitumor natural compound falcarindiol promotes cancer cell death by inducing endoplasmic reticulum stress.</a> CellDeath & Disease. 3, 1-9 (2012).</li>
<li>Walke, P. Physico-Chemical Parameters of Nanoparticles that Govern Prodrug Design and Application in Anticancer Nanomedicine in Physics, Chemistry, Pharmacy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalke%2C+P+%22University+of+Southern+Denmark+%28SDU%29%22">University of Southern Denmark (SDU)</a>. , (2018).</li>
<li>Walke, P. B., Hervella, P., Needham, D. Lipid-Coated Stealth Nanoparticles of Novel Hydrophobic Prodrug, Niclosamide Stearate, as Cancer Therapeutic: Formulation and Physico-Chemical Characterization of Nanoparticles. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalke%2C+PB+%226th+International+Pharmaceutical+Federation+Pharmaceutical+Sciences+World+Congress%22">6th International Pharmaceutical Federation Pharmaceutical Sciences World Congress</a>. , Stockholm, Sweden. (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von Lipid-beschichteten Nanopartikel für Drug-Delivery mit der einfachen, schnell, reproduzierbare und skalierbare schnelle Injektion Methode der Lösungsmittel Verschiebung war gefolgt27,28 und wird in diesem Papier als präsentiert auf Falcarindiol angewendet. Durch die Kontrolle der Geschwindigkeit der Injektion von der organischen Phase in wässrigen Phase und durch Beschichtung Lipide in entsprechenden Konzentrationen...

Lipid-beschichteten Nanopartikel sind ein erhöhtes Interesse hinsichtlich ihrer Funktion als Drug Delivery Systeme für Krebs-Therapie1sehen. Krebserkrankungen haben eine veränderte Lipid-Stoffwechsel Neuprogrammierung2 und ein erhöhter Bedarf an Cholesterin3vermehren. Sie overexpress LDLs1 und nehmen an mehr LDLs als normale Zellen, in dem Maße, in dem ein Krebspatient LDL Graf4noch gehen kann. LDL-Aufnahme fördert aggressive Phänotypen5 was Proliferation und Invasion im Brust-Krebs-6. Eine Fülle von LDL-Rezeptoren (LDLRs) ist ein prognostischer Indikator von metastasierendem potenzielle7. Inspiriert von der LDL und seine Aufnahme durch Krebszellen, eine neue Strategie ist genannt worden: die Droge, die aussehen wie der Krebs Lebensmittel machen8. Damit diese Nanopartikel Medikament Lieferung Neukonstruktionen8,9,10 wurden inspiriert durch die Kern-Lipid-stabilisiert und Gestaltung der natürlichen LDLs11 als Mechanismus für die Bereitstellung von Krebsmedikamenten für Krebszellen. Diese passive Fähigkeit targeting-Delivery-System unterstützt die Verkapselung, vor allem, hydrophobe Drogen, die sind in der Regel in peroralen Darreichungsform gegeben sondern nur eine kleine Menge der Medikamente in den Blutkreislauf, so begrenzen ihre erwarteten Wirksamkeit12. Wie mit der Stealth-Liposomen13, eine Polyethylenglykol (PEG) Beschichtung hilft, um immunologische Reaktion zu reduzieren und erstreckt sich die Zirkulation in den Blutkreislauf für optimale Tumor Aufnahme durch die angebliche verbesserte Durchdringung und Retentionswirkung (EPR) 14 , 15. jedoch zusätzlich zu, in einigen Fällen, die Instabilität in der Zirkulation und unerwünschte Verteilung im System16, einige Hindernisse bleiben ungelöst, wie wie und in welchem Umfang solche Nanopartikel durch Zellen aufgenommen werden und was ist Ihre intrazellulären Schicksal. Es ist hier, dass dieses Papier befasst sich die Nanopartikel Aufnahme einer speziellen hydrophoben Anti-Krebs-Medikament Falcarindiol, konfokale und Epifluoreszenz bildgebende Verfahren.
Ziel der Studie ist, Lipid-beschichteten Nanopartikel von Falcarindiol zu fabrizieren und ihre intrazelluläre Aufnahme in hMSCs zu studieren. Bewältigung der Herausforderungen im Zusammenhang mit der Lieferung dabei, potenziell Stabilisierung seiner Verwaltung und Verbesserung der Bioverfügbarkeit. So bewerten eine neue Liefersystem für das Krebsmedikament. Zuvor hat Falcarindiol mündlich über eine hohe Konzentration gereinigt Falcarindiol als ein Lebensmittel Ergänzung17verwaltet wurde. Allerdings gibt es Bedarf für einen strukturierteren Ansatz dieser vielversprechende Medikament liefern. Deshalb wurden Falcarindiol Nanopartikel mit einem Phospholipid und Cholesterin Kapseln monomolekularen Film mit der gereinigten Droge bilden den Kern des Teilchens, entworfen. Die schnelle Injektion Methode des Lösungsmittels verlagert, wie kürzlich entwickelt von Needham Et al. 8, wird in dieser Studie verwendet, um die Polyacetylen Falcarindiol Kapseln.
Die Methode hat wurde früher für die Herstellung von Nanopartikeln Lipid Kapseln diagnostische Bildgebung Agenten18,19, sowie test Moleküle (Triolein)27 und Drogen (Orlistat, Niclosamide Stearat)8 ,27,28. Es ist eine relativ einfache Technik, wenn mit den richtigen Molekülen durchgeführt. Nanoskaligen Partikeln, an der Grenze ihrer kritischen Keimbildung (~ 20 nm Durchmesser), bildet es sehr unlöslichen hydrophoben gelöste Stoffe, die in einem polaren Lösungsmittel aufgelöst. Die Lösungsmittelaustausch wird erreicht, indem eine schnelle Injektion von organischen Lösung in ein Übermaß an Antisolvent (in der Regel eine wässrige Phase in einer 1:9 Bio: wässrige Volumenverhältnis)20,21.
Die kompositorische Gestaltung der Nanopartikel ergeben sich mehrere Vorteile. Die DSPC:Chol Komponenten bieten eine sehr enge, fast undurchlässig, biokompatibel und biologisch abbaubare monomolekularen Film. Die PEG bietet eine sterisch stabilisierende Oberfläche, die wie ein Schutzschild aus Opsonization durch das Immunsystem, wirkt verlangsamt jede Aufnahme durch den retikuloendothelialen System (Leber und Milz) und Schutz gegen das Mononukleäre Phagozyten System, verhindert ihre Aufbewahrung und Abbau durch das Immunsystem und somit ihre Durchblutung Halbzeit im Blut22. Dadurch können die Partikel zu zirkulieren, bis sie an erkrankten Stellen, Leber wie z. B. Tumoren, wo das Gefäßsystem undicht ist, so dass EPR-Effekt, passive Ansammlung der Partikel hervorzubringen. Darüber hinaus erlaubt es die Lipid-Mantel, haben eine bessere Kontrolle über die Nanopartikel Größe durch den Kern seiner kritischen Kern Dimension27,28kinetisch abfangen. Lipide induzieren verschiedenen Oberflächeneigenschaften (einschließlich Peptid Ausrichtung, die noch nicht für dieses Projekt war), einen reinen Droge-Kern und ein niedriger Polydispersität22,27,28. Die Methode zur Partikelgrößenanalyse ist DLS, eine Technik, Forscher, die Größe einer großen Anzahl von Partikeln zur gleichen Zeit messen können. Allerdings kann diese Methode der Messwerte größer, bias, wenn Nanopartikel nicht Prozess23sind. Dieses Problem wird mit dem Lipid-Mantel sowie bewertet. Weitere Details dieser grundlegenden Designs und die Quantifizierung aller Merkmale sind in anderen Publikationen27,28gegeben.
Das Medikament in die Nanopartikel verkapselt ist Falcarindiol, eine diätetische Polyacetylen in Pflanzen aus der Familie Apiaceae gefunden. Es ist eine sekundäre Metaboliten aus dem aliphatischen C17Polyacetylenes Typ, der anzuzeigenden gesundheitsfördernde Effekte, einschließlich Anti-inflammatorische Aktivität, antibakterielle Wirkung und Zytotoxizität gegen ein breites Spektrum von Krebszelllinien gefunden wurde. Seine hohe Reaktivität bezieht sich auf seine Fähigkeit zur Interaktion mit verschiedenen Biomolekülen, als eine sehr reaktive Alkylierungsmittel gegen Mercapto und Aminogruppen24. Falcarindiol hat bisher gezeigt, Reduzierung der neoplastischen Läsionen in der Doppelpunkt17,25, obwohl die biologischen Mechanismen noch unbekannt sind. Es ist jedoch Gedanken, dass es interagiert mit Biomolekülen wie NF-κB, COX1, COX-2 und Zytokine hemmen ihre Tumor Progression und Zelle Verbreitung Prozesse, führen zu verhaften den Zellzyklus, endoplasmatische Retikulum (ER) zu betonen und Apoptose 17,26 in Krebszellen. Falcarindiol wird in dieser Studie verwendet, wie ein Beispiel Krebsmedikament aufgrund seiner Anti-Krebs-Potenzial und Mechanismus werden derzeit untersucht, und weil es vielversprechende Anti-Krebs Wirkung zeigt. Die zelluläre Aufnahme von Nanopartikeln ist in hMSCs getestet und abgebildet mit Epifluoreszenz und konfokalen Mikroskopie. Dieser Zellentyp wählte man aufgrund ihrer Größe eignen sich ideal für die Mikroskopie.

<table><tbody><tr><td>12 mL Schraubhalsfläschchen (Klarglas, 15-425 Gewinde, 66 x 18,5 mm)</td><td>Microlab Aarhus A/S</td><td>ML 33154LP</td><td></td></tr><tr><td>6 Well Platten</td><td>Greiner Bio One International GmbH</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Absolute Ethanol</td><td>EMD Millipore (VWR)</td><td>EM8.18760.1000</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Rathburn Chemicals Ltd.</td><td>RH1009</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Avanti Polar Lipide, Inc.</td><td>700000P</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Zeiss LSM510</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser Dicke #1,5</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co</td><td>117650</td><td></td></tr><tr><td>Exsikkator</td><td>Selbstbau</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>Invitrogen</td><td>D282</td><td></td></tr><tr><td>DLS</td><td>Beckman Schar</td><td>DelsaMAXpro 3167-DMP</td><td></td></tr><tr><td>DSPC (Chloroform Lager)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850365C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DSPE PEG 2000 (Chloroform-Lager)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>880120C</td><td></td></tr><tr><td>eVol XR</td><td>SGE analytische Wissenschaft, Trajan Scientific Australia Pty Ltd.</td><td>2910200</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenz-Mikroskop</td><td>Olymous IX81</td><td></td><td>mit manuellem TIRF und Andor iXon EMCCD</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Panasonic&nbsp;</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><tr><td>Magnetischer Floh</td><td>VWR Chemikalien</td><td>15 x 4,5 mm</td><td>Zylindrische Form mit PTFE-Beschichtung</td></tr><tr><td>Magnetrührer</td><td>IKA</td><td>RT-10</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Media</td><td>Gibco</td><td>32561-029</td><td></td></tr><tr><td>PBS Tabletten für Zellkulturen</td><td>VWR Chemicals</td><td>97062-732</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Streptokokken</td><td>VWR Chemicals</td><td>97063-708</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer salzhaltig (PBS, pH 7,4)</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Rotationsverdampfer</td><td>Rotavapor, B&uuml; chi Labortechnik AG</td><td>R-210</td><td></td></tr><tr><td>Probenkonzentrator&nbsp;</td><td>Stuart, Cole-Parmer Instrument Company, LLC</td><td>SBHCONC/1</td><td></td></tr></tbody></table>

aufnahme von neuen lipid-beschichteten nanopartikeln mit falcarindiol von humanen mesenchymalen stammzellen

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanopartikel sind der Schwerpunkt der ein erhöhtes Interesse an Drug-Delivery-Systeme für die Krebstherapie. Lipid-beschichteten Nanopartikel sind in Struktur und Größe von Low-Density-Lipoproteine (LDLs) inspiriert, weil Krebszellen einen erhöhten Bedarf an Cholesterin haben zu vermehren, und dies wurde als ein Mechanismus für die Bereitstellung von Krebsmedikamenten zu Krebs ausgeschöpft Zellen. Darüber hinaus kann je nach Medikament Chemie, Verkapselung der Drogenkonsums vorteilhaft, Abbau des Medikaments während der Zirkulation in vivo zu vermeiden sein. Dieses Design dient daher in dieser Studie zu fabrizieren Lipid-beschichteten Nanopartikel aus dem Krebsmedikament Falcarindiol, bietet eine potenzielle neue Abgabesystem von Falcarindiol um seine chemische Struktur gegen Abbau zu stabilisieren und zu verbessern ihre Aufnahme von Tumoren. Falcarindiol Nanopartikel, wurden mit einem Phospholipid und Cholesterin Monolage Verkapselung den gereinigten Droge Kern des Teilchens, entworfen. Die Lipid-Monolayer-Beschichtung besteht aus 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), Cholesterin (Chol) und 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) zusammen mit der Leuchtstoffröhre Label DiI (molare Verhältnis von 43:50:5:2). Die Nanopartikel sind hergestellt mit der schnelle Injektion Methode, die eine schnelle und einfache Technik, Nanopartikel durch gutes Lösungsmittel für Anti-Lösemittel Austausch auszufällen. Es besteht aus einer schnellen Injektion einer Ethanol-Lösung, die Nanopartikel-Komponenten in eine wässrige Phase enthält. Die Größe der fluoreszierende Nanopartikel wird mit dynamischen Lichtstreuung (DLS) bei 74.1 ± 6,7 nm gemessen. Die Aufnahme der Nanopartikel ist in humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) getestet und abgebildet, mit Fluoreszenz und konfokalen Mikroskopie. Die Aufnahme der Nanopartikel ist in hMSCs, was darauf hindeutet das Potenzial für ein solches stabile Drug Delivery System für Falcarindiol beobachtet.

Zwei verschiedene Arten von Nanopartikeln wurden hergestellt, nämlich reine Falcarindiol Nanopartikel und Lipid-beschichtete Falcarindiol Nanopartikel. Verschiedenen Konzentrationen von Lipiden und Cholesterin wurden getestet. Wie aus Tabelle 1hervorgeht, hatte unbeschichtete Nanopartikel in Wasser gebildet und in PBS gemessen einen Durchmesser von 71 ± 20,3 nm mit einem Polydispersität Index (PDI) von 0.571. Diese Parameter wurden auf einem DLS-Analysator gemessen. Die L...

Dieser Artikel beschreibt die Verkapselung von Falcarindiol in Lipid-beschichtete 74 nm Nanopartikel. Die zelluläre Aufnahme von Nanopartikeln durch menschliche Stammzellen in Lipid Tröpfchen wird durch fluoreszierende und confocal Imaging überwacht. Nanopartikel werden hergestellt durch die schnelle Injektion Methode des Lösungsmittels verschieben und ihre Größe wird mit der dynamischen Lichtstreuung Technik gemessen.

Aufnahme von neuen Lipid-beschichteten Nanopartikeln mit Falcarindiol von humanen mesenchymalen Stammzellen

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Die Herstellung von lipidbeschichteten Nanopartikeln mit der Schnellinjektionsmethode sorgt für ein stabiles Arzneimittelabgabesystem für die Krebstherapie. Diese Technik ist eine einfache, schnelle, skalierbare und reproduzierbare Technik für die Nanopartikelherstellung, die hydrophobe Medikamente kapselt. Diese Technik eignet sich zur Herstellung diagnostischer und therapeutischer Nanopartikel aus hydrphoben Materialien, die bei mehreren Krankheitserkrankungen effektiv eingesetzt werden können.Diese Herstellungstechnik kann zusammen mit DLS verwendet werden, um die Keimbildung und das Wachstum hydrophober Materialien wie Lipide, Proteine und Polymere zu untersuchen. Die Physikalisch-chemischen Eigenschaften Ihrer Wirkstoffsubstanz zu kennen, ist vor der Herstellung der Nanopartikel von entscheidender Bedeutung. Achten Sie auch darauf, die richtigen Konzentrationen von Beschichtungslipiden zu verwenden.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, um die Einfachheit der Herstellungstechnik zu zeigen und die erfolgreiche Abgabe des Arzneimittels als Nanopartikel an die Zellen zu zeigen. Bei der Arbeit mit Chloroform und Formaldehyd ist Vorsicht geboten, und die Arbeit unter einer Dunstabzugshaube ist erforderlich. Zunächst 2,4 Milliliter 250 Mikromolar Falcarindiol-Stammlösung in 70%Ethanol in einer Szintillationsdurchstechflasche gelöst geben.Mit einem Probenkonzentrator die Flüssigkeitsfraktion etwa vier Stunden lang verdampfen, um trockenes Falcarindiol zu erhalten. Mit dem Probenkonzentrator Gas bei Raumtemperatur über die Probe liefern, um die Probe zu konzentrieren. Nach dem Trocknen fügen Sie die hier gezeigten Komponenten in einer Dunstabzugshaube in die Szintillationsflasche ein, um die Spritze nach zugabe jeder Komponente mit Chloroform zu reinigen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.Schließen Sie dann sofort die Durchstechflaschen, die die Lipide enthalten, damit das Lösungsmittel nicht verdunstet und dadurch die Konzentration verändern. Die Durchstechflasche mit Aluminiumfolie umwickeln, um DiI vor Licht zu schützen, und lassen Sie die Probe über Nacht im Trockenhaus, um das Chloroform zu verdampfen. Lösen Sie am nächsten Tag die ausgetrocknete Probe in absolutem Ethanol auf, um ein Endvolumen von 1,2 Millilitern zu erreichen.Diese Lösung stellt die organische Phase dar. Nehmen Sie eine 12 Milliliter Glasdurchstechflasche und füllen Sie sie mit neun Milliliter gereinigtem Wasser. Dann fügen Sie einen magnetischen Floh in die Durchstechflasche mit neun Milliliter Wasser.Die Durchstechflasche auf einen Magnetrührer legen und bei 500 Umdrehungen rühren. Als nächstes eine Ein-Milliliter-Glasspritze am Dosiersystem befestigen und mindestens 10 Mal chloroform in und aus der Glasspritze ziehen. Geben Sie die Chloroform jedes Mal in ihren Abfallsammler.Die Reinigung der Spritze mit Chloroform hilft, Verunreinigungen zu vermeiden. Jetzt die Spritze mit Ethanol primen. Die Grundierung ersetzt das alte Lösungsmittel und entfernt Luftblasen.Mit der Spritze einen Milliliter der organischen Phase ansaugen und die Spritze bis zur Mitte der Neun-Milliliter-Wassermarke in die Glasflasche einlegen. Halten Sie es in der Mitte der Durchstechflasche stabil und injizieren Sie die Lösung mit 833 Mikroliterpro Sekunde, indem Sie den Dosierknopf am Dosiersystem drücken. Dadurch entstehen 10 Mikroliter von 50 mikromolaren lipidbeschichteten Nanopartikeln von Falcarindiol in 10% Ethanol.Diese Injektionsgeschwindigkeit wurde gefunden, um feinste Nanopartikel mit schmaler Partikelgrößenverteilung zu erreichen. Während der Injektion ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Nadel in der Mitte, stetig und gerade eingesetzt wird. Unmittelbar nach der Injektion die Durchstechflasche aus dem Rührwerk nehmen und die Probe in einen 50 Milliliter runden Bodenkolben geben.Greifen Sie den Kolben auf den Rotationsverdampfer an und verdampfen Sie einen Milliliter des organischen Lösungsmittels bei Raumtemperatur. Seien Sie vorsichtig, um übermäßige Blasenbildung zu vermeiden. Übertragen Sie die Nanopartikelsuspension aus dem Kolben in eine weitere 12-Milliliter-Glasflasche.Stellen Sie sicher, dass das Volumen neun Milliliter beträgt, und teilen Sie die Probe dann in zwei 12 Milliliter Glasfläschchen auf. Dann fügen Sie 0,5 Milliliter ultrareines Wasser in eine der Fläschchen und 0,5 Milliliter 10X Phosphat gepufferte Salzsäure in der anderen Durchstechflasche. Schalten Sie das digitale Lichtstreuungsinstrument ein und stellen Sie die gewünschte Temperatur auf 20 Grad Celsius ein, bis sie sich stabilisiert.Legen Sie dann die Geräteparameter wie hier gezeigt fest. Füllen Sie die Kunststoffküvette mit einem Milliliter Nanopartikelsuspension, und starten Sie die Messung. Melden Sie die gemessene Größe in Abhängigkeit von dem verwendeten Lösungsmittel.Samen ca. 50.000 Zellen auf sterilen 1,5 Abdeckung Suple in Sechs-Well-Platte platziert, um eine Zelldichte von etwa 30% zu erhalten Dann fügen Sie Kulturmedium, um ein endgültiges Volumen von drei Milliliter in jedem Brunnen haben. Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang unter Standardkulturbedingungen. Am nächsten Tag drei Mikroliter der Nanopartikellösung für eine endgültige Falcarindiol-Konzentration von fünf Mikromolaren hinzufügen.Dann geben Sie die Zellen für 24 Stunden in den Inkubator zurück. Waschen Sie die Zellen nach 24 Stunden Behandlung zweimal mit PBS und fixieren Sie sie dann 10 Minuten bei Raumtemperatur in 4%Formaldehyd. Nach der Fixierung, permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,1%Triton X-100 für 30 Minuten.Dann waschen Sie sie zweimal mit PBS, und färben Sie sie mit 250 Mikroliter 300 Nanomolar DAPI für fünf Minuten, vor Licht geschützt. Legen Sie den Deckelschlupf mit einem Drop PBS auf eine Folie. Wenden Sie sich einer 150-fachen subjektiven Und übertragen Sie die Folie auf die Stufe eines Weitfeldfluoreszenzmikroskops, das mit einer elektronenmultiplizierten CCD-Kamera ausgestattet ist.Bildzellen mit dem GFP-LP-Kanal. Überprüfen Sie außerdem die Aufnahme der Nanopartikel in die Zellen, indem Sie konfokale Mikroskopiebilder mit einem 63-fachen Ölobjektiv mit einer numerischen Blende von 1,4 aufnehmen. Bild DiI mit einem Argonlaser mit 514 Nanometern und DAPI mit einem Zwei-Photonen-Laser bei 780 Nanometern.Unbeschichtete Nanopartikel von Falcarindiol, die in Wasser gebildet und in PBS gemessen wurden, zeigten eine hohe Polydisperität mit einem PD-Index von 0,571. Dieser Wert gibt eine breite und ungleichmäßige Verteilung der Partikelgrößen an. Im Gegensatz dazu waren die in diesem Video hergestellten lipidbeschichteten Nanopartikel von Falcarindiol von 74,1 Nanometern mit einem Polydispersitätsindex von 0,182, was auf eine relativ monodisperse und gleichmäßige Verteilung der Partikelgrößen hindeutete.Als erste Beobachtung der Nanopartikel in den Zellen wurden nach 24 Stunden Behandlung Epifluoreszenzmikroskopiebilder aufgenommen. Die Nanopartikel wurden als weiße, helle Punkte visualisiert, und es könnte vermutet werden, dass sich Nanopartikel in den Zellen, die den Kern umgeben, befanden. Um zu überprüfen, ob Falcarindiol-Nanopartikel in die Zellen eingedrungen waren, wurde auch eine konfokale Mikroskopie an den Zellen durchgeführt.Hier wird eine große Anzahl von Nanopartikeln gezeigt, die im Zytoplasma in jeder Zelle verstreut sind. Diese Ergebnisse zeigen, dass Nanopartikel als stabiles Arzneimittelabgabesystem für Falcarindiol fungieren. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Lösung mit der richtigen Injektionsgeschwindigkeit zu injizieren, wobei die Aussaat in der Mitte stabil bleibt, um eine ordnungsgemäße Durchmischung zu gewährleisten.Dieses Verfahren kann für jedes hydrophobe Medikament verwendet werden, um therapeutische Nanopartikel zu formulieren, oder für bildgebende Mittel, um diagnostische Nanopartikel zu formulieren, die unter verschiedenen Krankheiten wie Krebs verwendet werden können. Diese Technik ermöglichte es, mehr Forschung über den Mechanismus durchzuführen, durch den die Nanopartikel von den Zellen aufgenommen werden, sowie seine Live-Zell-Bildgebung und die Untersuchung der Krebswirkung des Medikaments.

uptake-new-lipid-coated-nanoparticles-containing-falcarindiol-human

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Ziel der Präsentation ist es, eine hohe Reproduzierbarkeit der Methode zur Matrix verbunden Stammzellen Implantate in Knorpeldefekte, die visualisiert werden MR-Bildgebung erzeugen kann demonstrieren. Stammzellen sind mit von der FDA zugelassene Ferumoxides mit Agarose, implantiert in Knorpeldefekte und abgebildet mit einem 7T MR-Scanner bezeichnet.

Die Implantation von Ferumoxides Labeled humanen mesenchymalen Stammzellen in Knorpeldefekte

Wir beschreiben eine Technik zur Kennzeichnung und Verfolgung von Stammzellen mit FDA-Zulassung, superparamagnetische Eisenoxid (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). Diese zellulären bildgebendes Verfahren, das Magnetresonanz-(MR)-Bildgebung nutzt zur Visualisierung, ist leicht zugänglich für die langfristige Überwachung und Diagnose von Erfolg oder Misserfolg Stammzellen engraftments bei Patienten.

Labeling Stammzellen mit Ferumoxytol, eine FDA-Zulassung Eisenoxid-Nanopartikel

Die immunmodulatorischen Eigenschaften von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC) erscheint für die klinische Anwendung zunehmend relevant. Verwendung eines Co-Kultursystem der MSCs und peripheren Blutleukozyten mit dem Fluoreszenzfarbstoff Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE) vorgefärbten beschreiben wir den in vitro Beurteilung der MSC Immunomodulation auf Effektorzellen Leukozyten Proliferation und bestimmten Subpopulationen.

Beurteilung der immunmodulatorischen Eigenschaften von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSCs)

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Möglichkeit zur Überwachung der Zelle Persistenz und Bioverteilung des menschlichen Fettgewebe mesenchymalen Stammzellen (HaMSCs) durch dunkelrote Fluoreszenz Kennzeichnung in einem Rattenmodell Knie Arthrose (KOA) durch intraartikuläre Injektion (IA).

In Vivo Tracking der menschlichen Fettgewebe mesenchymalen Stammzellen in einem Rattenmodell Knie Arthrose mit fluoreszierenden lipophile Membran Farbstoff

Dieses Protokoll beschreibt der Transienten Gentechnik zahnmedizinische Stammzellen aus der menschlichen zahnmedizinische Follikel extrahiert. Die angewandte nicht-viralen Modifikation Strategie kann eine Grundlage für die Verbesserung der therapeutischen Stammzellen Produkte geworden.

Isolierung, Charakterisierung und RNA-basierte gentechnische Veränderung von menschlichen Dental follikelstimulierendes Stammzellen

Dieses Protokoll demonstriert, wie die kleinen extrazellulären Vesikel (hUC-MSC-sEVs) von humanen Nabelschnurstammzellen (hUC-MSC-sEVs) mit einer einfachen Laborumgebung isoliert werden können. Die Größenverteilung, Proteinkonzentration, sEVs-Marker und Morphologie isolierter hUC-MSC-sEVs werden durch Nanopartikel-Tracking-Analyse, BCA-Protein-Assay, Western Blot bzw. Transmissionselektronenmikroskop charakterisiert.

Eine einfache Tischfiltrationsmethode zur Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus humanen mesenchymalen Stammzellen

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung von humanen mesenchymalen Stammzellen unter Verwendung der Einzelzellsortierungsmethode. Insbesondere kann durch den Einsatz der Einzelzellsortierung eine Reinheit von 99 % der immunphänotypisierten Zellen aus einer heterogenen Population erreicht werden, wenn sie mit einem multiparametrischen Durchflusszytometrie-basierten Ansatz kombiniert wird.

Einzelzellsortierung von immunphänotypisierten mesenchymalen Stammzellen aus humanen abgeblätterten Milchzähnen

Dieses Protokoll beschreibt alle Verfahren, von der Kultivierung humaner mesenchymaler Stammzellen (ADSCs) aus Fettgewebe über die Entnahme von Überständen bis hin zur Extraktion extrazellulärer Vesikel (EVs) mittels Ultrazentrifugation.

Aufreinigung und Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus humanen mesenchymalen Stammzellen aus Fettgewebe

Die Isolierung von BAMBI-hohenMFGE8-hohen MSCs, einer der drei Hauptuntergruppen der heterogenen humanen UC-MSCs, ist hilfreich, um die Eigenschaften und Funktionen dieses Subtyps für seine zukünftige Anwendung zur Verbesserung der klinischen Wirksamkeit bei bestimmten Erkrankungen vollständig zu verstehen. Hier stellen wir eine Methode zur Sortierung von BAMBIhochMFGE8hoch UC-MSCs vor.

Isolierung von humanen mesenchymalen Stromazellen mitBAMBI-Gehalt anhohemMFGE8-Nabelschnurgehalt

Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine Methode zur Herstellung und Reinigung von mesenchymalen Stammzellen (MSC)-abgeleiteten extrazellulären Vesikelbiomimetika für die Gentherapie einzuführen. Das Nanovesikel ist mit MSC-abgeleiteten Lipid-Doppelschichten eingeschlossen und kapselt rekombinante AAVs, die das relevante Gen im Lumen tragen. Dieses Nanovesikel bietet einen verbesserten Vektor für die Genlieferung in vivo .

Entwicklung mesenchymaler Stammzellmembran-umhüllte Nanovesikel zur verbesserten Genlieferung

Erfahren Sie die Herstellung lipidbeschichteter Nanopartikel mit Falcarindiol für die Krebstherapie. Diese Methode ermöglicht die stabile Verkapselung hydrophober Wirkstoffe und deren effektive Aufnahme durch humane mesenchymale Stammzellen.

Aufnahme von neuen Lipid-beschichteten Nanopartikeln mit Falcarindiol von humanen mesenchymalen Stammzellen

Weitere Videos entdecken