Name: Bau und Betrieb von einer Kammer elektrische Stimulation zur Verbesserung der osteogene Differenzierung mesenchymaler Stammzellen/Stromazellen Zellen In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Erfahren Sie den Bau einer kostengünstigen elektrischen Stimulationskammer zur Förderung der osteogenen Differenzierung mesenchymaler Stammzellen. Diese wiederverwendbare Methode unterstützt die Knochengewebeentwicklung.

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Diese Arbeit wurde zum Teil durch eine AO Foundation Gründungshilfe (03 / 14 / S-H) und die Stiftung Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim) mit Sitz in Frankfurt/Main, Deutschland unterstützt.

1. Bau der Elektrostimulation Zelle Kultur Kammer
<ol><li>Um die EStim-Kammer zu bauen, sammeln Sie zwei Deckel der standard 6-Well Kultur Zellplatten; 99,99 % Platin Draht, 60 cm Länge mit einem Durchmesser von 0,5 – 1 mm; versilberter Kupferdraht, 70 cm in der Länge mit einem Durchmesser von 0,6 mm; Vornschneider; Lötkolben Kit; eine Tube supraleitenden Klebstoff; eine Anschlussklemme Lüsterklemme, sechs kleine 2,2 V LEDs (fakultativ); eine Tube korrosionsbeständig Silikonkleber Beschichtung (optional); eine Klebebandrolle schwarz elektrische Isolierung; Standard, flexible, isolierte elektrische Kupferdraht (0,14 mm2), 2 m Länge (Tabelle der Materialien).</li>
	<li>In einem 6-Well-Platte Deckel, Mark und dann zwei Bohrlöcher (mit einem Durchmesser von ~ 1 mm) Brunnen 25 mm voneinander entfernt, nahe dem äußeren Rand des jeder der sechs (12 Löcher insgesamt), wie in Abbildung 1A, Bgezeigt.</li>
	<li>Schnittlängen Sie 12 5 cm der Platindraht mit Vornschneider. Biegen Sie die Drähte manuell in eine L-Form, so dass einseitig 3 cm lang und die anderen 2 cm. Schneiden Sie den versilbertem Draht in zwei 35 cm Länge.</li>
	<li>Legen Sie das längere (3 cm) gebogene Ende des einen Platindraht (von innen nach außen) in jede Bohrung 1 – 2 mm ragt aus der Außenseite des Deckels, so dass es mit Pinzette biegen. Platindrähte in den Deckel Löcher mit supraleitenden Kleber zu sichern und für ca. 6 Stunden trocknen lassen.</li>
	<li>Löten Sie die Spitzen der alle sechs Platindrähte (das wird später als Kathoden dienen, siehe Abbildung 1A) ragen aus dem Deckel eines Silber-beschichtete Drähte. Wiederholen Sie den Vorgang, Löten die restlichen sechs Platindrähte (das später als Anoden dienen werden) zu den anderen versilbertem Draht.<ol>
<li>Fügen Sie LEDs in die Schaltung zwischen jedem der sechs Anoden-Kathoden Platin-Elektrodenpaare, um Funktionalität während der Experimente (optional) zu bestätigen. Legen Sie ein Stück schwarzes Isolierband unter jedem führte zur Aufdeckung der Zellen in der Kultur-Platten, das LED-Licht (Abbildung 1) verhindern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kleben Sie Anschlussklemme Lüsterklemme an der oberen linken Ecke des Deckels 6-Well-Platte und verbinden Sie beide Silber beschichteten Drähte an die Eingangsklemmen, wie in Abbildung 1dargestellt.</li>
	<li>Schneiden Sie einen Abschnitt 20 x 20 mm von der oberen linken Ecke der zweiten 6-Well-Platte Deckel (Abbildung 1 b, Deckel Nr. 2) an den Klemmleiste-Connector auf dem ersten Deckel unterbringen. Decken Sie den ersten Deckel, ausgestattet mit den Elektroden mit dem zweiten Deckel ab und kleben Sie sie mit Klebeband.<ol>
<li>Verwenden Sie zur Verbesserung der Verklebung der beiden Deckel Silikonkleber Beschichtung (optional). Dazu decken Sie den Deckel mit der silbernen-Elektroden mit einer 3 – 5 mm Schicht Silikonkleber zu und decken Sie es mit den anderen Deckel, so dass 12 h für den Klebstoff trocknen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schließen Sie ein Ende der zwei standard isolierten Kupferdrähte an die Ausgangsklemmen der Lüsterklemme und die anderen Enden an Bananen Stecker (4 mm). Hinweis: Die Länge der Drähte richtet sich nach der Entfernung aus dem Regal im Brutkasten, wo die Zellen, an die Stromversorgung an, außerhalb des Inkubators (Abbildung 1 gehalten werden).</li>
	<li>Passen Sie die Dosis (Spannung) und Therapie mit EStim an die Zellen durch die Regulierung der DC-Netzteil geliefert.<ol>
<li>Schalten Sie die Stromversorgung durch Drücken der ON/OFF -Taste auf der Frontplatte. Aktivieren Sie Kanal 1 durch Drücken der Taste 1.</li>
		<li>Drücken Sie Taste Nr. 4 (V-Satz), die Spannung eingestellt. Drücken Sie 2, . Tasten und 5 bis 2,5 V. Press Enterden Lastausgang festgesetzt.</li>
		<li>Sicherstellen, dass der Lastausgang 2,5 V (2.500 mV) entspricht einem EStim von 100 mV/mm, gemäß der folgenden, vereinfachten Gleichung. V EStim = <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59127/59127eq1.jpg"> ; oder V = VEStim × d Hier, V = die Versorgungsspannung Ausgang in Millivolt; d = Abstand zwischen den Elektroden in Millimeter; V EStim = Stimulation Spannung in Millivolt pro Millimeter. Hinweis: Diese Vereinfachung gilt nur im Falle einer konstanten Gleichspannung. Der Widerstand zwischen dem Medium und der Zellen ist vernachlässigbar, da Elektroden nicht in direkten Kontakt mit den Zellen sind; Stattdessen wird der Zellen durch das Medium EStim geliefert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. mesenchymale Stammzellen Kultur in osteogene medium
<ol><li>Erwerben Sie und im Handel erhältlichen Ratte MSCs (siehe Tabelle der Materialien) in flüssigem Stickstoff bis zum Tag des Experiments. Alternativ veröffentlicht Isolat MSCs von anderen Tieren nach Protokollen an anderer Stelle7,8 in Übereinstimmung mit lokalen institutionellen Regelungen für den Einsatz von Versuchstieren.</li>
	<li>Am Tag des Experiments ein Fläschchen (1 x 10-6 -Zellen) der MSCs aus dem flüssigen Stickstoff-Speicher zu entfernen und schnell (innerhalb von 1 min.) Auftauen der Zellen in einem Wasserbad auf 37 ° c vorgewärmt<ol>
<li>Unter sterilen Bedingungen in einem Laminar-Flow-Haube pipette des Ampulle Inhalts in ein 50 mL Falcon-Röhrchen und 9 mL normal Medium (NM) vorgewärmt auf 37 ° C, bestehend aus Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM; 1 X) mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin Lösung. Pellets für 5 min die Zellen durch Zentrifugation bei 300 X g.</li>
		<li>In einem Laminar-Flow-Haube den Überstand zu entfernen und sorgfältig Aufschwemmen der Zelle Pellet in 12 mL NM auf 37 ° c vorgewärmt Übertragen Sie die resuspendierte Zellen in eine T-75 Zelle Kultur Kolben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kulturzellen Sie bei 37 ° C, 5 % CO2, 5 % O2 , bis sie ein Zusammenfluss von 80 – 90 % (nach ca. 3 – 5 Tage) erreichen.</li>
	<li>Die Passage der Zellen. Hinweis: Operationen Sie alle mit Ausnahme von Zentrifugation und Inkubation unter sterilen Bedingungen in einem Laminar-Flow-Haube.<ol>
<li>Nach Erreichen einer Zusammenfluss von 80 – 90 %, Abrufen der Zellen mit Zelle Ablösung Lösung. Aspirieren das Zellkulturmedium, waschen 2 X mit 1 X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), 5 mL 1 x Zelle Ablösung Lösung hinzufügen und die Zellen in den Inkubator für 5 min zurück.</li>
		<li>Sobald die Zellen getrennt sind, Hinzufügen einer gleichen Menge von Kulturmedium, die Ablösung Lösung zu inaktivieren. Sammeln Sie die Zellen in einem 50 mL Falcon-Röhrchen und mit 300 X g für 5 min drehen.</li>
		<li>Entsorgen Sie das Medium und Aufschwemmen Sie Zellen in 1 mL frisches normal Medium. Die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit Trypan blau Fleck zu beurteilen.</li>
		<li>1 x 106 Samenzellen in einem neuen T-75-Kolben mit 12 mL vorgewärmte NM. Kulturzellen Sie bei 37 ° C, 5 % CO2, 5 % O2 , bis sie ein Zusammenfluss von 80 – 90 % erreichen. Hinweis: Zelle Passagierung (Schritte 2.4.1–2.4.4) kann ein paar Mal wiederholt, bis die benötigte Anzahl der Zellen gewonnen wird. Verwenden Sie nicht älter als Durchgang 8 Zellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>9 x 104 Samenzellen in 3 mL NM (10 % Hitze-inaktivierten fötalen Rinderserum, 1 % Penicillin/Streptomycin, DMEM) in jede Vertiefung einer Kultur 6-Well-Platte. 1 Tag bei 37 ° C, 5 % CO2, 5 % O2inkubieren Sie Zellen.</li>
	<li>Am nächsten Tag aspirieren Sie Kulturmedium und gelten Sie 3 mL osteogene Differenzierung Medium (OM; normales Mittel ergänzt mit 10-7 M Dexamethason, 10 mM β-Glycerophosphat und 0,05 mM Ascorbinsäure-2-Phosphat).</li>
	<li>Legen Sie die 6-Well-Platte mit Zellen im Inkubator und Inkubation über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2, 5 % O2 .</li>
</ol>3. Behandlung von MSCs mit EStim
<ol><li>Am Tag, wie, den die Zellen mit EStim behandelt werden, Sterilisieren Sie die Elektroden in 70 % Ethanol-Lösung für 30 min; dann trocknen sie unter UV-Licht in einem Sicherheitsschrank für eine zusätzliche 30 Minuten.</li>
	<li>In einem Laminar-Flow-Haube, decken die 6-Well-Platte mit der kultivierten MSCs bei geschlossenem Deckel ausgestattet mit den Elektroden, um sicherzustellen, dass die Elektroden in Medium vollständig eingetaucht werden (falls erforderlich, fügen Medium). Die überdachte 6-Well-Platte (EStim Kammer) mit den Zellen in den Inkubator zu übertragen und die Drähte an die Stromversorgung anschließen.</li>
	<li>Legen Sie das Netzteil auf 2,5 V Lastausgang und behandeln Sie die Zellen mit EStim für 1 h3,9.</li>
	<li>Trennen Sie nach der Stimulation das Netzteil und entfernen Sie die EStim-Kammer aus dem Inkubator zu. Tauschen Sie unter sterilen Bedingungen den Deckel mit Elektroden mit einem standard 6-Well-Platte Deckel ausgestattet.</li>
	<li>Die Zellen in den Inkubator zurück und lassen sie über Nacht. Reinigen Sie die Elektroden, mit PBS und dann mit 70 % igem Ethanol-Lösung. Reinigen Sie die angesammelten Korrosionsprodukte von der Elektrodenoberfläche mit feinem Sandpapier.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.1 bis 3.5 an 6 aufeinanderfolgenden Tagen. Am Tag 4, vor dem Auftragen EStim und unter sterilen Bedingungen ändern Sie das Kulturmedium durch Absaugen von 1,5 mL Medium und ersetzt es mit 1,5 mL vorgewärmte frische OM</li>
	<li>Nach dem Auftragen EStim für 7 aufeinander folgenden Tagen, pflegen Sie die Zellen in der Kultur für weitere 7 Tage, Austausch von dem Medium alle 3 – 4 Tage.</li>
</ol>4. osteogene Differenzierung Messungen
<ol><li>Analysieren Sie Zelle Morphologie Veränderungen unter dem Mikroskop.</li>
	<li>Zur Beurteilung der Wirkung von EStim auf MSC osteogene Differenzierung Maßnahme Kalzium Ablagerung, alkalische Phosphatase-Aktivität und osteogene Marker-gen-Expression, wie beschrieben an anderer Stelle3,9.</li>
</ol>

<ol><li>Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Regenerative+Medicine%3A+What+Is+the+Evidence%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%2C+Tissues%2C+Organs%22%5BJournal%5D)">Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence?</a> Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).</li>
<li>Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Tissue+Engineering+Applications%3A+Current+Status+and+Future+Prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects.</a> Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).</li>
<li>Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+effect+of+direct+current+electrical+stimulation+on+rat+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells.</a> PeerJ. 5, e2821(2017).</li>
<li>Leppik, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+electrical+stimulation+and+tissue+engineering+to+treat+large+bone+defects+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), S1(2018).</li>
<li>Song, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).</li>
<li>Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+responses+of+two-+and+three-dimensional+engineered+tissues+to+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+B%2C+Reviews%22%5BJournal%5D)">A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).</li>
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<li>Nau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineered+vascularized+periosteal+flap+enriched+with+MSC%2FEPCs+for+the+treatment+of+large+bone+defects+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier beschreiben wir den Bau einer Kammer und eine Methode für die Behandlung von mesenchymalen Stammzellen mit EStim, der verbesserte osteogene Differenzierung führt.
Das EStim Setup präsentiert erfordert keine spezielle Ausrüstung/wissen und von Nachwuchswissenschaftlern in einem standard Stammzell-Biologie/Biochemie Labor durchgeführt werden kann. Allerdings muss beim Erstellen und verwenden der EStim-Kammer, in ein paar wichtige Schritte geachtet werden. Beim Umgang mit der Platin-Elektrod...

Zunahme/Trauma oder Krankheit-induzierte Knochendefekte sind mit unterschiedlichen Kombinationen der Zelltherapie und regenerative Medizin-Technologien behandelt werden. MSCs sind die Zelle der Auswahl in solche Behandlungen aufgrund ihrer relativ hohen knochenbildenden Aktivität, Isolierung und Ausbau Effizienz und Sicherheit1. Zur Maximierung ihrer knochenbildenden Aktivität und damit ihre therapeutische Wirksamkeit zu optimieren, wurden mehrere Methoden eingeführt, um MSCs vor ihrer Verwendung in diesen Behandlungen zu manipulieren (wie Mauney Et Al.2überprüft). Eine solche Methode ist EStim, das gezeigt worden ist, zu verbessern MSC osteogene Differenzierung in Vitro3 und Förderung der Knochenheilung in-vivo-4. Trotz der wachsenden Zahl von Studien mit Schwerpunkt auf die Behandlung von MSCs mit EStim muss eine optimale Therapie für die Maximierung der EStim Pro-osteogene Effekt noch definiert werden.
Andere in-vitro-Methoden mit EStim nutzen Salz Brücken, eingetaucht in das Kulturmedium, das Zellen von metallischen Elektroden5trennt. Der Vorteil hierbei ist, dass liefern EStim durch Salz Brücken die Einführung der chemischen Nebenprodukte (z.B. Korrosion von metallischen Elektroden) eliminiert, die zytotoxischen möglicherweise. Trotz dieses Vorteils Salz Brücken sind umständlich, mit zu arbeiten, und die EStim sie liefern unterscheidet, dass gelieferte in in-vivo-Modelle macht es schwierig, die Ergebnisse beim Einsatz der beiden Systeme korrelieren. Setups, die EStim über metallische oder Carbon Elektroden befestigt im Inneren der Zelle Kultur Brunnen liefern simulieren (wie Hronik Tupaj und Kaplan6überprüft) besser Geräte in Vivo; aber diese Geräte sind schwer zu reinigen sterilisieren/zwischen den Anwendungen und beschränkt sich die Anzahl der Zellen, die pro Experiment untersucht werden können. Wir entwarfen EStim Kammer präsentiert hier speziell um die Einschränkungen von diesen anderen Setups zu beheben. Während die meisten von unserer Erfahrung im Umgang mit diesem EStim-Saal wurde mit 2D und 3D Kulturen mit dem Knochenmark und Fettgewebe-Gewebe-abgeleitete MSCs3,4, ein großer Vorteil dieses Hauses ist, dass es ist vielseitig und mit relativ Änderungen, anpassbar andere Zelltypen unter einer Vielzahl von unterschiedlichen Bedingungen zu studieren.
Hier beschreiben wir den Bau einer EStim Zelle Kultur Kammer; dann zeigen wir Ihnen deren Nutzung durch Behandlung von MSCs mit verschiedenen Therapien EStim und den daraus resultierende Effekt auf osteogene Differenzierung zu messen. MSC osteogene Differenzierung wird durch Ablagerung von Kalzium, alkalische Phosphatase-Aktivität und osteogene Marker-gen-Expression beurteilt. Vor allem beobachtet Vergangenheit Experimente, die diese Einrichtung verwendet wir, dass diese Pro-osteogene Effekte bestehen, lange nach Beendigung der Therapie die EStim.

<table><tbody><tr><td>Estim Fertigung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bananenstecker/Klinkenadapter</td><td>Poppstars</td><td>1008554</td><td>2 Stück</td></tr><tr><td>Schneidezange</td><td>Knipex</td><td>78 03 125</td><td></td></tr><tr><td>DC Netzteil (0-30V/0-3A)</td><td>B& K</td><td>Präzisionsmodell 9130B</td><td>Jedes ähnliche Modell kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Isolierte flexible Drähte (0,14 mm2)</td><td>Conrad Electronic International</td><td>604794, 604093</td><td>2 Stück</td></tr><tr><td>Korrosionsbeständiger Silikonkautschuk</td><td>Dow Corning</td><td>3140 RTV</td><td>*, kann in vielen Geschäften gekauft</td></tr><tr><td>werden Platinum Wire (999,5/1000; 1mm &oslash;)</td><td>Junker Edelmetalle</td><td>00D-3010</td><td>0,6 m benötigt für 1 Estim-Kammer</td></tr><tr><td>70%ige Ethanollösung</td><td>beliebige</td><td></td><td>Sterilisation der Estim-Kammer</td></tr><tr><td>Silberbeschichteter Kupferdraht (0,6 mm &oslash;)</td><td>Conrad Electronic International</td><td>409334 - 62</td><td>&asymp; 70 cm benötigt für 1 Estim Gerät</td></tr><tr><td>Lötkolben Set</td><td>Conrad Electronic International</td><td>1611410 - 62</td><td>Jedes ähnliche Modell kann verwendet werden</td></tr><tr><td>TPP 6-Well-Plattendeckel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707759-126EA</td><td>2 Deckel für Estim Kammer</td></tr><tr><td>2,2V verdrahtete runde LEDs</td><td>Conrad Electronic International</td><td>599525 - 62</td><td>6 Stück</td></tr><tr><td>UHU Sekundenkleber</td><td>UHU GmbH & Co. KG</td><td>n/a</td><td>*kann in vielen Geschäften gekauft werden</td></tr><tr><td>MSC Kultur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Glycerophosphat Dinatriumsalzhydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td>osteogene Zellkultur</td></tr><tr><td>DMEM, niedrige Glukose, GlutaMAX Supplement, Pyruvat</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>21885025</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>DPBS, kein Calcium, kein Magnesium</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>14190144</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td>osteogene Zellkultur</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>10500064</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>50 ml Falcon Tube</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td>osteogene Zellkultur</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>15140122</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Sprague-Dawley (SD) mesenchymale Stammzellen der Ratte, Herkunft aus dem Knochenmark</td><td>Cyagen</td><td>RASMX-01001</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Lösung zur Zellablösung</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>A1110501</td><td>Zellkultur, Zellablösung</td></tr><tr><td>TC Flask, T75</td><td>Sarstedt</td><td>833911302</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>TPP 6-Well-Platten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707759-126EA</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Trypanblauer Farbstoff, 0,4%ige Lösung</td><td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td>Zellzahl</td></tr></tbody></table>

bau und betrieb von einer kammer elektrische stimulation zur verbesserung der osteogene differenzierung mesenchymaler stammzellen/stromazellen zellen in vitro

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Mesenchymale Stammzellen/Stromazellen Zellen (MSCs) wurden ausgiebig zur Förderung der Knochenheilung in Gewebetechnik Ansätze. Elektrostimulation (EStim) nachweislich zu erhöhen MSC osteogene Differenzierung in-vitro- und Förderung der Knochenheilung in klinischen Umgebungen. Hier beschreiben wir den Bau einer EStim Zelle Kultur Kammer und seine Verwendung bei der Behandlung von Ratte Bone-Marrow-derived MSC osteogene Differenzierung zu verbessern. Wir fanden, dass die Behandlung von MSCs mit EStim für 7 Tage führt zu einem deutlichen Anstieg der osteogene Differenzierung, und wichtig ist, diese Pro-osteogene Effekt bleibt lange nach (7 Tage) EStim eingestellt ist. Dieser Ansatz der Vorbehandlung MSCs mit EStim osteogene Differenzierung verbessern ließe sich Knochengewebe engineering Behandlungsergebnisse zu optimieren und so helfen ihnen, ihre volle therapeutische Potential zu erreichen. Neben dieser Anwendung dieser EStim Zelle Kultur Kammer und Protokoll auch einsetzbar, andere EStim-sensible Zelle Verhaltensweisen, z. B. Migration, Proliferation, Apoptose und Gerüst Anlage zu untersuchen.

Zur Bewertung der Wirkung der 100 mV/mm EStim auf die osteogene Differenzierung der MSCs, Zellen behandelt mit EStim für 3, wurden 7 und 14 Tagen oder aufbereitetem (Control) am 14. Tag der Kultivierung durch die morphologische Veränderungen und Kalzium Ablagerung (Abbildung 2 Bewertung analysiert ). Dies geschah durch bildgebende Zellen mittels Hellfeld Mikroskopie (Morphologie Änderungen) oder durch Befestigung Zellen in 4 % Paraformaldehyd Lösung, mit 0,02...

Hier präsentieren wir ein Protokoll für den Bau einer Zelle Kultur Kammer entwickelt, um Zellen zu verschiedenen Arten von elektrische Stimulation, und seine Verwendung bei der Behandlung von mesenchymalen Stammzellen zur Verbesserung der osteogene Differenzierung aufzudecken.

Bau und Betrieb von einer Kammer elektrische Stimulation zur Verbesserung der osteogene Differenzierung mesenchymaler Stammzellen/Stromazellen Zellen In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Hier zeigen wir, wie man eine elektrische Stimulationskammer mit gängigen sechs Wandkulturplatten baut und wie man sie einsetzt, um die osteogene Differenzierung in mesenchymalen Stammzellen zu stimulieren. Diese Kammer ist einfach und nicht teuer zu bauen, und kann in mehreren Experimenten wiederverwendet werden. Nach der Vorbehandlung mit elektrischer Stimulation in unserer Kammer können mesenchymale Stammzellen verwendet werden, um die Ergebnisse in knochengewebetechnischen Behandlungen zu verbessern.Diese Kammer kann auch verwendet werden, um andere Zelltypen und elektroempfindliche Zellverhalten wie Migration, Proliferation, Veränderungen im Membranpotential, Apoptose und sorgfältige Anhaftung zu untersuchen. In einem sechs Bohrblechdeckel, markieren und bohren Sie dann zwei Löcher mit einem Millimeter Durchmesser, 25 Millimeter voneinander entfernt, in der Nähe der äußeren Kante jeder der sechs Bohrungen. Als nächstes schneiden Sie einen Platindraht in 12 fünf Zentimeter lange Abschnitte.Biegen Sie jeden Fünf-Zentimeter-Abschnitt manuell in eine L"-Form, so dass ein Ende drei Zentimeter lang und die anderen zwei Zentimeter lang sind. Dann schneiden Sie den silberbeschichteten Draht in zwei 35-Zentimeter-Längen. Setzen Sie das längere gebogene Ende eines Platindrahtes in das Bohrloch ein, sodass ein bis zwei Millimeter von der Außenseite des Deckels herausragen.Biegen Sie es mit Zangen. Anschließend die Platindrähte in den Deckellöchern mit superleitendem Kleber befestigen und ca. sechs Stunden trocknen lassen. Zur Vorbereitung der Kathoden löten Sie die Spitzen aller sechs Platindrähte, die vom Deckel auf einen der silberbeschichteten Drähte ragen.Zur Vorbereitung der Anoden die restlichen sechs Platindrähte auf andere silberbeschichtete Drähte löten. Fügen Sie anschließend LEDs in den Kreislauf zwischen jedem der sechs Anoden-Kathoden-Platin-Elektroden-Paare hinzu, um die Funktionalität zu bestätigen. Legen Sie ein Stück schwarzes Isolierband unter jede LED, um zu verhindern, dass die Zellen in den Kulturplatten LED-Licht aussetzen.Als nächstes kleben Sie den Drahtklemmenstecker an die linke obere Ecke des Sechs-Well-Plattendeckels und verbinden Sie beide silberbeschichteten Drähte mit den Eingangsklemmen. Schneiden Sie dann einen 20-Millimeter-mal 20-Millimeter-Quadratteil aus der linken oberen Ecke eines zweiten Sechs-Well-Plattendeckels aus, um den Klemmenblockanschluss auf dem ersten Deckel unterzubringen. Bedecken Sie den ersten Deckel, der mit den Elektroden ausgestattet ist, mit dem zweiten Deckel und kleben Sie sie mit Klebeband zusammen.Schließen Sie ein Ende der beiden standardmäßig isolierten Kupferdrähte an die Ausgangsklemmen des Drahtsteckers und das andere Ende an Bananensteckeranschlüsse an. Schalten Sie das Netzteil ein, indem Sie die ON-OFF-Taste auf der Frontplatte drücken. Aktivieren Sie Kanal eins durch Drücken der Taste eins.Danach drücken Sie Taste vier, um die Spannung einzustellen. Stellen Sie den Lastausgang auf 2,5 Volt ein. Drücken Sie dann die Eingabetaste.Am Tag, an dem die Zellen mit E-Stiel behandelt werden, sterilisieren Sie die Elektroden in 70%Ethanol-Lösung für 30 Minuten. Dann trocknen Sie sie unter UV-Licht in einem Sicherheitsschrank für weitere 30 Minuten. In einer laminaren Durchflusshaube bedecken Sie die Sechs-Well-Platte mit den kultivierten MSCs mit dem deckel, der mit den Elektroden ausgestattet ist, und stellen Sie sicher, dass die Elektroden vollständig in das Medium eingetaucht sind.Übertragen Sie dann die abgedeckte Sechs-Well-Platte mit Zellen an den Inkubator und schließen Sie ihre Drähte an das Netzteil an. Als nächstes stellen Sie die Stromversorgung auf 2,5 Volt Lastausgang und behandeln Sie die Zellen mit E-Stamm für eine Stunde. Trennen Sie nach der Stimulation die Stromversorgung und entfernen Sie die E-Stielkammer aus dem Inkubator.Ersetzen Sie unter sterilen Bedingungen den mit Elektroden ausgestatteten Deckel durch einen Standard-Sechs-Well-Plattendeckel. Anschließend die Zellen an den Inkubator zurückgeben und über Nacht verlassen. Reinigen Sie die Elektroden zuerst mit PBS und dann mit 70% Ethanollösung.Reinigen Sie dann die angesammelten Korrosionsprodukte von der Elektrodenoberfläche mit feinem Schleifpapier. Wiederholen Sie die E-Stiel-Behandlung für sechs aufeinanderfolgende Tage. Am vierten Tag, vor der Anwendung der elektrischen Stimulation, und unter sterilen Bedingungen, ändern Sie das Kulturmedium, indem Sie 1,5 Milliliter Medium ansaugen und durch 1,5 Milliliter vorgewärmtes, frisches osteogenes Differenzierungsmedium ersetzen.Nach der Anwendung der elektrischen Stimulation für sieben aufeinanderfolgende Tage, halten Sie die Zellen in kultur für weitere sieben Tage, Austausch des Mediums alle drei bis vier Tage. Wenn die Behandlung abgeschlossen ist, analysieren Sie die Zellmorphologie-Änderungen unter dem Mikroskop. Um die Auswirkungen der elektrischen Stimulation auf die osteogene MSC-Differenzierung zu bewerten, messen Sie die Kalziumabscheidung, die alkalische Phosphataseaktivität und die osteogene Marker-Genexpression, wie an anderer Stelle beschrieben.Um die Wirkung von 100 Millivolt pro Millimeter elektrischer Stimulation auf die osteogene MSC-Differenzierung zu bewerten, wurden Zellen, die drei, sieben und 14 Tage lang mit elektrischer Stimulation behandelt wurden, und nicht behandelte Zellen am 14. Tag der Kultur analysiert, indem morphologische Veränderungen und Kalziumablagerungen bewertet wurden. Signifikante Veränderungen in der Zellmorphologie und Kalziumablagerungen waren in Zellen sichtbar, die sieben und 14 Tage lang mit elektrischer Stimulation behandelt wurden. Eine detaillierte Analyse der Veränderungen der osteogenen Marker-Genexpression wurde an den Tagen drei, sieben und 14 der Kultur durchgeführt.An Tag sieben der Kultur war die RunX2-Expression in Zellen, die sieben Tage lang mit elektrischer Stimulation behandelt wurden, signifikant höher. Während colla1-Expression in Zellen, die sieben Tage lang behandelt wurden, signifikant höher war, gemessen am Tag 14 der Kultur. Die Expression von Osteopontin wurde in elektrisch stimulierten Zellen an den Tagen drei, sieben und 14 der Kultur signifikant erhöht.Osterix-Expression fehlte in Kontrollzellen zu allen Zeitpunkten und wurde nur bei sieben und 14 Tagen Kultur in Zellen gesehen, die elektrischer Stimulation ausgesetzt waren. Die elektrische Stimulationskammer ist relativ einfach zu bauen. Besondere Vorsicht ist jedoch bei der Handhabung der Platindrähte sowie bei der Reinigung und Sterilisation der Elektroden geboten.Zellen, die in unserer Kammer mit Strom vorbehandelt wurden, allein oder auf einem Gerüstmaterial sitzend, könnten in Tiermodelle implantiert werden, um zu untersuchen, wie die positive Wirkung der elektrischen Stimulation in vitro fortbesteht. Diese Technik bietet ein einfaches, aber leistungsstarkes Werkzeug, um den Mechanismus zu untersuchen, mit dem elektrische Stimulation die Zellfunktionen reguliert. Dieses Wissen kann in regenerativen Medizinzellen verfügbar sein.

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Forschung

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Biotechnik

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Bau und Betrieb von einer Kammer elektrische Stimulation zur Verbesserung der osteogene Differenzierung mesenchymaler Stammzellen/Stromazellen Zellen In Vitro (Video) | JoVE Journal

Bau und Betrieb von einer Kammer elektrische Stimulation zur Verbesserung der osteogene Differenzierung mesenchymaler Stammzellen/Stromazellen Zellen In Vitro

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